QUANTA Lite Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata. HA dsdna ELISA

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1 QUANTA Lite Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata HA dsdna ELISA Finalità d uso Il presente dosaggio permette la determinazione in vitro degli autoanticorpi IgG specifici ad elevata avidità diretti verso l acido desossiribonucleico a doppia elica (dsdna) in siero umano, come sussidio nella diagnosi del lupus eritematoso sistemico (LES), in congiunzione con altri risultati sierologici e dati clinici. Vengono forniti materiali sufficienti per il dosaggio di un massimo di 40 campioni in doppio o di 88 campioni in singolo, con una curva di calibrazione, un controllo cut-off, un controllo positivo, uno negativo ed un controllo per il DNA a singola elica. Riassunto e Spiegazione del test L utilizzo degli anticorpi anti-dsdna come marcatore diagnostico del LES e per il conseguente monitoraggio della sua attività patologica ha costituito un gran beneficio nel campo clinico 1 fin dalla loro prima identificazione da parte di Ceppelini et al, che risale al e con il susseguente inserimento di questi ultimi tra i criteri aggiornati di classificazione per il LES dell American College of Rheumatology 3. Attualmente vi sono tre metodi comunemente utilizzati, distinguibili in base all avidità degli anticorpi anti-dsdna rilevati 4. I test immunoenzimatici (ELISA), di cui esistono molte varianti, determinano per loro caratteristica un vasto spettro di avidità anticorpali. Il dosaggio in immunofluorescenza (IFA) su Crithidia luciliae, subisce l influenza degli anticorpi a bassa avidità. Infine i dosaggi Farr radioimmunologici (RIA) 5 tipicamente misurano solamente gli anticorpi ad elevata avidità, grazie alla fase di precipitazione mediante solfato di ammonio che esclude gli anticorpi a bassa avidità. 8 Il test HA dsdna prevede una serie di condizioni di dosaggio più restrittive volte ad eliminare gli anticorpi a bassa avidità debolmente legati. Alcuni studi 6,7 hanno dimostrato una correlazione tra avidità anticorpale ed il progredire della malattia, in cui la scelta del dosaggio facilita la distinzione tra i pazienti con forme di LES benigne e quelli con coinvolgimento renale e cutaneo, specialmente nei casi di nefrite lupica 8,9. Generalmente si osserva una buona concordanza tra i suddetti dosaggi sui casi ben definiti di lupus eritematoso sistemico (LES) mentre sorgono discrepanze significative nei pazienti con patologie inattive o quelli che non rientrano nel quadro clinico standard del LES. Principio della Metodica I micropozzetti sono sensibilizzati con l antigene dsdna estratto da timo di vitello. I calibratori, i controlli e i campioni diluiti vengono dispensati nei pozzetti. Gli eventuali autoanticorpi diretti verso l antigene dsdna si legheranno durante la prima incubazione. Dopo il lavaggio dei pozzetti, per rimuovere il materiale non legato, viene aggiunto il coniugato: anti-igg umane di capra marcate con perossidasi. Il coniugato si legherà agli eventuali anticorpi umani catturati nel pozzetto mentre il coniugato in eccesso viene rimosso mediante ulteriore lavaggio. Il coniugato legato verrà evidenziato mediante aggiunta del substrato TMB (3,3,5,5 tetrametilbenzidina). In presenza di perossidasi, si ottiene una colorazione blu che virerà al giallo dopo aver aggiunto acido solforico. L intensità del colore, proporzionale alla concentrazione di autoanticorpi nel campione, viene letta a 450nm. Reagenti 1. Evitare piastre ELISA di micro pozzetti sensibilizzati con l antigene dsdna estratto da timo di vitello., (12-1 x 8 pozzetti), con supporto, in busta chiusa contenente materiale essicante 2. Controllo ELISA Negativo, 1 flacone di tampone contenente conservante e siero umano senza anticorpi 3. Calibratore A ELISA positivo per HA dsdna, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi 4. Calibratore B ELISA positivo per HA dsdna, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi 5. Calibratore C ELISA positivo per HA dsdna, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi 6. Calibratore D ELISA positivo per HA dsdna, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi 7. Calibratore E ELISA positivo per HA dsdna, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi 8. Controllo ELISA debolmente positivo per HA dsdna, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani della classe dsdna, prediluito, 1,2mL 9. Diluente per campioni Type III, 2 flacones di colore giallo contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween 20, stabilizzatori delle proteine e conservante, 50mL 10. Soluzione di lavaggio HA dsdna Concentrata (10x), 2 flacones di soluzione concentrata 10x incolore contenente soluzione fisiologica tamponata con Tween 20, 50mL. Vedi la Sezione Metodi per le istruzioni sulla diluizione. 11. HA dsdna Controllo a singola elica ssdna, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani ssdna, prediluito, 1,2mL 12. Coniugato HA dsdna IgG, anti-igg umane, 1 flacone di colore blu contenente tampone, stabilizzatori delle proteine e conservante, 10mL 13. Cromogeno TMB, 1 flacone contenente stabilizzatori, 10mL 14. Soluzione di arresto HRP, Acido solforico 0,344M, 1 flacone incolore, 10mL Avvertenze 1. ATTENZIONE: Questo prodotto contiene un composto chimico (cloramfenicolo allo 0,02%) i campioni, nei controlli, diluente e nel coniugato, noto allo Stato della California come causa di tumori. La lavaggio e diluente per campioni contenente Proclin 150. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. 1

2 2. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-hiv, per HBsAg e per anticorpi anti-hcv mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controllo ELISA debolmente positivo per HA dsdna, HA dsdna Calibratori A E, HA dsdna Controllo a singola elica dsdna ed ELISA Negativo devono essere 12 maneggiati come materiali potenzialmente infettivi. 3. La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. 4. Il Coniugato HRP contiene un composto chimico velenoso/corrosivo, che può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 5. Il Cromogeno TMB contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. 6. La Soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. Evitare l esposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L acido solforico è velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 7. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 8. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. 2. Il presente prodotto deve essere utilizzato da personale specializzato. 3. Si raccomanda di osservare la procedura del test alla lettera. Qualsiasi variazione potrebbe influire sui risultati e la qualità del dosaggio. Non trascurare le eventuali Note ed avvertenze contenute nelle istruzioni. 4. I reattivi provenienti da lotti diversi di kit NON sono intercambiabili. Se si effettuano molti dosaggi, occorre avere l accortezza di controllare che tutti I reattivi provengano dallo STESSO lotto. Tutti gli strip utilizzati devono provenire dalla medesima custodia di alluminio. La sostituzione di qualsiasi componente può portare a risultati errati. 5. Per evitare contaminazioni, utilizzare solamente vetreria/contenitori di plastica nuovi o perfettamente puliti. Mai versare reattivi inutilizzati nuovamente nel flacone di origine. 6. NON lasciare i flaconi dei reattivi stappati; qualsiasi evaporazione o contaminazione che ne risultasse darà luogo a risultati inattendibili. 7. Il substrato TMB deve essere mantenuto al riparo dalla luce e dall acqua. 8. I sieri con contaminazioni microbiche, emolizzati o lipemici ed i campioni contenenti particelle non devono essere utilizzati. 9. Si consiglia l utilizzo di pipette calibrate e di sieri di controllo interni. 10. L utilizzo di campionatori automatici, diluitori per campioni o di qualsiasi altro tipo di strumentazione automatica può dar luogo a differenze nei risultati, rispetto al procedimento manuale. È responsabilità del laboratorio convalidare il sistema di automazione, verificando che i risultati rientrino nei limiti definiti nella presente metodica e nel certificato QC annesso. 11. Tutta la strumentazione utilizzata dovrà essere tarata e sottoposta alla manutenzione periodica suggerita dalla casa madre. Condizioni di conservazione 1. Il kit va conservato a 2-8 C e non deve essere congelato. Temperature di conservazione inappropriate possono influire negativamente sul risultato. 2. Il tampone di lavaggio diluito può essere conservato a 2-8 C per 1 settimane. 3. La data di scadenza del kit è riportata sull etichetta esterna. Raccolta dei campioni 1. I campioni di sangue devono essere presi tramite prelievo venoso e lasciati coagulare naturalmente per separare il siero. 2. Il siero può essere conservato a 2-8 C per un massimo di 7 giorni prima del dosaggio 10 o per conservarlo più a lungo lo si può dividere in aliquote e conservare a -20 C o a temperature inferiori. 3. Il ripetuto scongelamento e ricongelamento dei campioni deve essere evitato. 4. I campioni di siero non devono essere inattivati al calore, poichè questo può dare risultati falsi positivi. Procedura Materiali forniti Foglietto illustrativo: Dà esaurienti dettagli del test. Certificato Controllo Qualità (CQ): Indica i risultati attesi del lotto. Pozzetti rivestiti di transglutaminasi umana: 12 strisce separabili di 8 pozzetti sensibilizzati l antigene dsdna estratto da timo di vitello. Ogni piastra è confezionata in una busta di alluminio risigillabile contenente due bustine essiccanti. Diluente del campione Type III: 2 flaconi contenenti 50mL di tampone per la diluizione del campione. Colorato giallo, pronto per l uso. Soluzione di lavaggio HAdsDNA Concentrata (10X): 2 flaconi contenente 50mL di un tampone concentrato 10 volte per lavare i pozzetti. Calibratori HA dsdna: 5 flaconi, ciascuno contenente 1,2mL di siero umano diluito, con le seguenti concentrazioni di autoanticorpi anti-dsdna: 1000; 333; 111; 37; 12,3 IU/mL. Pronto per l uso. 2

3 Controllo positivo HA dsdna: 1 flacone contenente 1,2mL di siero umano diluito. Il valore atteso è fornito sul certificato CQ. Pronto per l uso. Controllo negativo ELISA: 1 flacone contenente 1,2mL di siero umano diluito. Il valore atteso è fornito sul certificato CQ. Pronto per l uso. Controlo a singola elica dsdna: 1 flacone contenente 1,2mL de siero umano diluto. Il valore atteso è fornito sul certificato CQ. Pronto per l uso. Coniugato HA dsdna IgG: 1 flacone contenente 1,2mL di anticorpi purificati anti-igg umane, coniugati con perossidasi. Colorato in blu, pronto per l uso. Cromogeno TMB: 1 flacone contenente 10mL di substrato TMB. Pronto per l uso. Soluzione di arresto HRP: 1 flacone contenente 10mL di acido solforico 0,344M. Pronto per l uso. Materiali richiesti ma non forniti Lavatore automatico per micropiastre: È consigliato, sebbene il lavaggio della piastra possa essere eseguito manualmente. Lettore per piastre: In grado di misurare la densità ottica a 450nm, calibrato contro aria. Acqua distillata o deionizzata: Si raccomanda l uso di acqua della migliore qualità disponibile. Micropipette calibrate: Per dosare 1000, 100 e 10µL. Pipetta multicanale: Consigliata per dosare volumi di 100µL di coniugato, substrato e soluzione bloccante. Provette di vetro/plastica: Per la diluizione dei campioni. Metodica Prima di incominciare 1. Portare il kit a temperatura ambiente Il kit è stato messo a punto per una procedura a temperatura ambiente (20-24 C). Togliere il kit dal luogo di conservazione e attendere che raggiunga la temperatura ambiente (per circa 60 minuti). I pozzetti non devono essere rimossi dalla custodia di alluminio finché non abbiano raggiunto la temperatura ambiente. Nota: I kit si mantengono a temperatura ambiente per una settimana. 2. Componenti del kit Miscelare uniformemente ciascun componente del kit prima dell uso. 3. Diluizione del tampone di lavaggio (concentrato 10x) Aggiungere 100mL di tampone di lavaggio concentrato a 900mL di acqua distillata (diluizione 1/10) in un contenitore pulito e miscelare. Si possono frazionare le quantità da diluire se necessario. Nota: Il tampone di lavaggio diluito può essere conservato a 2-8 C per 1 settimane, quindi diluire solo la quantità più appropriata. 4. Diluizione dei campioni Diluire 10µL di ciascun campione con 1000µL di diluente dei campioni (1:101) e miscelare accuratamente. Nota: I campioni diluiti devono essere utilizzati entro 8 ore. 5. Manipolazione degli strip e del supporto Inserire il numero desiderato di pozzetti negli strip, a partire dal pozzetto A1, riempiendo le colonne da sinistra a destra, fino a completare l intera piastra. Durante tale procedura è opportuno premere sui lati più lunghi del supporto, per evitare la fuoriuscita dei pozzetti. Nota: Riporre immediatamente i pozzetti non utilizzati nella custodia di alluminio con le 2 bustine di essiccante, richiudendo saldamente per ridurre al minimo l esposizione all umidità. Assicurarsi che non vi siano strappi o forature nella custodia di alluminio: AVVERTENZA: L esposizione dei pozzetti all umidità, la contaminazione da polvere o da qualsiasi altro tipo di particelle può dar luogo al deterioramento degli antigeni, con risultati del dosaggio poco attendibili. Esecuzione del test Rispettare la stessa sequenza di dispensazione durante tutto il test. 1. Dispensazione del campione Distribuire 100µL di ciascun calibratore, controllo e campione diluito 1:101 negli opportuni pozzetti della piastra fornita. Nota: I campioni dovrebbero essere dispensati sulla piastra il più velocemente possibile per minimizzare variazioni nel saggio, ed il timer deve partire dopo l aggiunta dell ultimo campione. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. 2. Lavaggio La procedura di lavaggio è critica e richiede una particolare attenzione. Una piastra lavata male darà risultati inaccurati, poco precisi e con elevato valore di fondo. Dopo l incubazione rimuovere la piastra e lavare i pozzetti 3 volte con µL di tampone di lavaggio per pozzetto. Lavare la piastra o usando un lava-piastre automatico o manualmente come sotto indicato. Dopo il lavaggio automatico finale, capovolgere la piastra e far sgocciolare i pozzetti su carta assorbente. Le piastre possono essere lavate manualmente come segue: a. Svuotare il contenuto della piastra nel lavandino. b. Far sgocciolare i pozzetti su carta assorbente battendo delicatamente sulla sommità. c. Riempire ogni pozzetto con µL di tampone di lavaggio usando una pipetta multicanale. d. Scuotere delicatamente la piastra su una superficie piana. e. Ripetere due volte i passaggi a-d. f. Ripetere a e b. 3. Dispensazione del coniugato Distribuire 100µL di coniugato in ogni pozzetto, asciugare la sommità dei pozzetti con carta assorbente per rimuovere eventuali schizzi. Nota: Per evitare contaminazioni, non rimettere mai il coniugato avanzato nel flacone. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. 3

4 4. Lavaggio Ripetere la fase Dispensazione del cromogeno (TMB) Distribuire 100µL di cromogeno TMB in ogni pozzetto, asciugare la sommità dei pozzetti con carta assorbente per rimuovere eventuali schizzi.nota: Per evitare contaminazioni, non rimettere mai il TMB avanzato nella flacone.incubare a temperatura ambiente al buio per 30 minuti. 6. Dispensazione del bloccante Distribuire 100µL di soluzione bloccante in ciascun pozzetto. Questo provoca un viraggio di colore dal blu al giallo. 7. Misura della densità ottica Leggere la densità ottica (DO) di ciascun pozzetto a 450nm su un lettore di micropiastre entro 30 minuti dalla dispensazione della soluzione bloccante. Controllo di qualità 1. Controllo qualità Per essere valido il dosaggio deve rispettare i seguenti requisiti: I calibratori e i controlli negativo, positivo e a singola elica devono essere inclusi in ogni seduta. I valori ottenuti per ciascun controllo devono rientrare nei range specificati sul Certificato QC. La forma della curva dovrà essere simile a quella riportata sul Certificato QC. Se non vengono rispettati i suddetti criteri, il dosaggio sarà invalidato e si dovrà ripetere la seduta. 2. Calcolo delle densità ottiche medie (solo per dosaggi in doppio) Calcolare la DO media delle due letture per ciascun calibratore, controllo e campione dispensato in doppio. Il C.V.% di ciascun replicato dovrà essere inferiore al 15%. 3. Tracciare la curva di calibrazione La curva di calibrazione potrà essere tracciata in automazione o manualmente come segue, con la concentrazione degli autoanticorpi anti-dsdna su scala log, rispetto alle DO su scala lin, per ciascun calibratore: In automazione utilizzare un software adeguatamente validato, scegliendo il fitting che meglio si adatta ai dati. Manualmente utilizzando carta log/lineare (semilogaritmica) tracciare una curva uniforme attraverso i punti (non una retta o una punto-punto). 4. Trattamento dei punti anomali Se uno dei punti fuoriesce dalla curva, questo potrà essere rimosso. Se in seguito a tale rimozione la curva assume una forma diversa rispetto a quella riportata sul Certificato QC o se più punti risultano fuorvianti, il dosaggio dovrà essere ripetuto. 5. Calcolo dei livelli anticorpali nei controlli e nei campioni diluiti Leggere i livelli degli autoanticorpi anti-dsdna nei controlli e nei campioni prediluiti direttamente sulla curva di calibrazione. I valori dei controlli dovrebbero rientrare nei range riportati sul Certificato QC. Nota: I valori dei calibratori sono già corretti considerando un fattore 100 per la prediluizione 1:101 dei campioni. Non sono pertanto necessarie ulteriori correzioni. 6. Calibrazione del dosaggio Il dosaggio è calibrato in IU/mL rispetto al calibratore di riferimento OMS (Wo80 6 ). Limitazioni del test 1. Il presente dosaggio, in virtù della sua capacità di rilevare solamente gli anticorpi anti-dsdna ad alta avidità, potrebbe non identificare alcune forme di LES nei cui pazienti si riscontrano solo anticorpi a bassa avidità. Potrebbe quindi risultare inadatto per quelle applicazioni in cui è richiesta la misurazione totale di anticorpi anti-dsdna. 2. Il presente kit va utilizzato unicamente come sussidio diagnostico. Un risultato positivo è indice di alcune patologie che andranno confermate attraverso i parametri clinici e ulteriori test sierologici. 3. I risultati ottenuti nel dosaggio non rappresentano una prova diagnostica dell insorgere o meno di una determinata patologia. Valori attesi I seguenti range sono stati stabiliti in base ai risultati ottenuti dal dosaggio con FARRZYME su campioni provenienti sia da donatori sani (n=150) che da pazienti LES (n=224): INTERPRETAZIONE 30 IU/mL Negativo > 30 IU/mL Positivo I 150 sieri provenienti da donatori sani hanno dato tutti risultati al di sotto di 17,0 IU/mL, con 146 (97%) dei risultati al di sotto di 12,3 IU/mL che costituisce il limite di misurazione inferiore del kit. Il 22,8% dei sieri dei pazienti LES risultava positivo al FARRZYME (>30 IU/mL). I risultati qui di seguito mostrati provengono da uno studio comparativo tra gli stessi 224 campioni LES del FARRZYME ed un dosaggio anti-dsdna EIA convenzionale, che misura sia anticorpi ad alta che a bassa avidità verso il dsdna. I campioni con risultati borderline al dosaggio dsdna convenzionale sono stati considerati negativi ai fini del calcolo sia delle percentuali di concordanza tra positivi e tra negativi che per la concordanza complessiva. 4

5 Anti-dsDNA ELISA convenzionale Positivi Borderline Negativi FARRZYME Positivi Negativi Percentuale di concordanza positivi = 58,8% Percentuale di concordanza negativi = 97,2% Concordanza complessiva = 83,5% L incidenza degli anticorpi anti-dsdna ad elevata avidità rilevati dal FARRZYME e dal Farr RIA in 100 pazienti LES è risultata del 36% e 38%, rispettivamente 8. Al contrario, in 100 pazienti con malattie del tessuto connettivo ed altre patologie autoimmuni l incidenza per i due dosaggi risultava del 4% e 5% rispettivamente. Le unità ottenute con il test FARRZYME potrebbero non concordare con quelle ottenute in altri test che si esprimono in IU/mL in quanto il FARRZYME misura solamente il sottogruppo di anticorpi anti-dsdna ad elevata avidità. I range rappresentano unicamente un parametro guida. I dosaggi ELISA risultano molto sensibili e in grado di rivelare differenze minime nelle popolazioni dei campioni. Si raccomanda pertanto che ciascun laboratorio stabilisca i propri limiti di normalità, in base alla popolazione locale, alla strumentazione e alle tecniche impiegate. Caratteristiche Metodolgiche 1. RANGE DI MISURAZIONE Il range di misurazione del dosaggio è tra 12, IU/mL. 2. CONVALIDA DELLA SENSIBILITÀ ANALITICA L attendibilità del test FARRZYME nel distinguere tra due campioni con valori vicini al limite inferiore del range di misurazione (120 e 165% del calibratore più basso) è stata determinata mediante analisi statistica (test t di Student) dei risultati ottenuti dosando replicati multipli di ciascun campione. 3. SPECIFICITÀ, CONCORDANZA 189 campioni di pazienti con LES, 35 campioni positivi per anticorpi anti-dsdna mediante Crithidia o ELISA nonché 28 campioni provenienti da soggetti sani sono stati dosati con FARRZYME, in immunofluorescenza su Crithidia luciliae ed inoltre con un test dsdna ELISA convenzionale. Crithidia IFA FARRZYME % Concordanza positivi 67,3% % Concordanza negativi 92,9% Concordanza complessiva 87,3% Il FARRZYME EIA ha mostrato una buona concordanza tra negativi con il dosaggio in immunofluorescenza su Crithidia luciliae. La concordanza percentuale tra positivi si è dimostrata inferiore in quanto quest ultimo dosaggio rileva gli anticorpi anti-dna a bassa avidità 11, a differenza del test FARRZYME. dsdna ELISA convenzionale + Borderline - FARRZYME *% Concordanza positivi 58,8% % Concordanza negativi 97,7% Concordanza complessiva 85,3% *Per il calcolo della concordanza tra i due dosaggi, i campioni nella fascia borderline del test dsdna convenzionale sono stati classificati come negativi. Il test ELISA convenzionale rileva sia gli anticorpi ad alta che a bassa avidità, con conseguente riduzione della concordanza tra positivi per il test FARRZYME. 4. SOSTANZE INTERFERENTI Sono stati dosati vari tipi di siero per verificare i possibili effetti di sostanze interferenti, utilizzando un kit Interference Check A plus (Kokusai, Giappone). Sostanza Bilirubina F (libera) Bilirubina C (coniugata) Emoglobina emolizzata Chilo Fattore reumatoide Concentrazione 20,3mg/dL 20,2mg/dL 486mg/dL 1460 unità 45 IU/mL Non sono state osservate interferenze con bilirubina libera o coniugata, emoglobina, lipidi o fattore reumatoide. In uno studio a parte sono stati saggiati 6 sieri di mieloma IgG al test FARRZYME e nessuno ha dato esito positivo. 5. Precisione La precisione intra- ed inter-saggio è stata determinata su 6 campioni che rientravano nei range della curva di calibrazione. Le medie ed i CV% di ciascun campione sono qui di seguito riportati: 5

6 La precisione intra-saggio è stata determinata utilizzando 20 replicati in un dosaggio. PRECISIONE INTRA-SAGGIO n=20 Concentrazione (IU/mL) C.V. % Campione 1 25,1 5,4 Campione 2 39,0 4,8 Campione 3 74,5 2,2 Campione 4 205,5 3,3 Campione 5 361,2 4,3 Campione 6 528,6 5,1 La precisione inter-saggio è stata determinata dosando i campioni in doppio su 6 dosaggi effettuati in 3 giorni. PRECISIONE INTER-SAGGIO n=6 Concentrazione (IU/mL) C.V. % Campione 1 24,6 13,5 Campione 2 42,3 3,9 Campione 3 61,3 11,6 Campione 4 123,2 4,9 Campione 5 272,4 7,0 Campione 6 474,1 6,9 Schema Piastra A B C D E F G H Riassunto del metodo 1. Dispensare 100µL di ciascun controllo e calibratore pronto per l uso e dei campioni diluiti 1:101 nei rispettivi pozzetti. Incubare per 30 minuti. Lavare. 2. Dispensare 100µL di coniugato in tutti i pozzetti. Incubare per 30 minuti. Lavare. 3. Dispensare 100µL di substrato in tutti i pozzetti. Incubare per 30 minuti. 4. Dispensare 100µL di soluzione bloccante in tutti i pozzetti. Misurare l assorbanza a 450nm. QUANTA Lite e INOVA Diagnostics sono marchi registrati.copyright 2012 Tutti i diritti riservati 6

7 Bibliografia 1. Isenberg D and Smeenk R. Clinical laboratory assays for measuring anti-dsdna antibodies. Where are we now? Lupus, 2002; 11: Ceppelini R, Polli E and Celada F. A DNA-reacting factor in serum of a patient with lupus erythematosus diffuses. Proc Soc Exp Biol Med, 1957; 96: Tan et al. The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheumatism, 1982; 25: Riboldi P et al. Anti-DNA antibodies: a diagnostic and prognostic tool for systemic lupus erythematosus? Autoimmunity. 2005; 38: Werle E et al. The clinical significance of measuring different ant-dsdna antibodies by using the Farr assay, an enzyme immunoassay and a crithidia luciliae immunofluorescence test. Lupus, 1992; 1: Isenberg D. Anti-dsDNA antibodies: still a useful criterion for patients with systemic lupus erythematosus? Lupus, 2004; 13: Nossent H C and Rekvig O P. Is closer linkage between systemic lupus erythematosus and anti-doublestranded DNA antibodies a desirable and attainable goal? Artheritis Res Ther, 2005; 7(2): Jaekel HP et al. Anti-dsDNA antibody subtypes and anti-c1q antibodies: toward a more reliable diagnosis and monitoring of systemic lupus erythematosus and lupus nephritis. Lupus, 2006; 15: Renaudineau Y et al. Association of α-actinin-binding anti-dsdna antibody Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A with lupus nephritis. Arthritis Rheumatism, 2006 (in press) 10. Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield Smeenk R, van der Lelij G and Aarden L. Measurement of low avidity anti-dsdna by the Crithidia luciliae test and the PEG assay. Clin Exp Immunol, 1982; 49: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. Fornitore: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Rappresentante Autorizzato: Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: ITA August 2012 Revision 3 7