5. Tale osservazione conferma la necessità di

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1 QUANTA Lite Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata dsdna SC ELISA Finalità d uso Il presente dosaggio permette la determinazione in vitro degli autoanticorpi IgG verso l acido desossiribonucleico a doppia elica (dsdna) in siero umano, come sussidio nella diagnosi del lupus eritematoso sistemico (LES) in congiunzione con altri dati clinici. Vengono forniti materiali sufficienti per il dosaggio di un massimo di 40 campioni in doppio o di 88 campioni in singolo, con una curva di calibrazione, un controllo positivo, uno negativo ed un controllo per il DNA a singola elica. Riassunto e Spiegazione del test Gli anticorpi diretti verso il DNA riconoscono sia le forme di DNA a singola elica (ss) che quelle a doppia elica (ds). Gli autoanticorpi anti-ssdna non sono specifici per una determinata patologia, essendo associati ad una vasta gamma di disturbi autoimmuni tra cui: lupus eritematoso sistemico (LES) indotto da farmaci, connettivite mista, artrite reumatoide, sclerodermia e sindrome di Sjögren. Al contrario, gli autoanticorpi anti-dsdna sono associati più specificamente alla LES 1,2,3, dove la formazione di immunocomplessi svolgerebbe un ruolo principale nella patogenesi della malattia. La deposizione di immunocomplessi causa sia l infiammazione che le caratteristiche renali e vascolari della malattia 4. I repentini aumenti di attività patologica nella LES sono generalmente preceduti da un incremento dei livelli di antidsdna, seguito da un brusco calo al culmine della malattia 5. Tale osservazione conferma la necessità di monitorare regolarmente i livelli di autoanticorpi anti-dsdna nei pazienti LES. Principio della Metodica I micropozzetti sono sensibilizzati con l antigene dsdna estratto da timo di vitello. I calibratori, i controlli e i campioni diluiti vengono dispensati nei pozzetti. Gli eventuali autoanticorpi diretti verso l antigene dsdna si legheranno durante la prima incubazione. Dopo il lavaggio dei pozzetti, per rimuovere il materiale non legato, viene aggiunto il coniugato: anti-igg umane di capra marcate con perossidasi. Il coniugato si legherà agli eventuali anticorpi umani catturati nel pozzetto mentre il coniugato in eccesso viene rimosso mediante ulteriore lavaggio. Il coniugato legato verrà evidenziato mediante aggiunta del substrato TMB (3,3,5,5 tetrametilbenzidina). In presenza di perossidasi, si ottiene una colorazione blu che virerà al giallo dopo aver aggiunto acido solforico. L intensità del colore, proporzionale alla concentrazione di autoanticorpi nel campione, viene letta a 450nm. Reagenti 1. Evitare piastre ELISA di micro pozzetti sensibilizzati con l antigene dsdna estratto da timo di vitello, (12-1 x 8 pozzetti), con supporto, in busta chiusa contenente materiale essicante 2. Controllo ELISA Negativo, 1 flacone di tampone contenente conservante e siero umano senza anticorpi umani della classe dsdna, prediluito, 1,2mL 3. Calibratore A ELISA positivo per dsdna SC, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi 4. Calibratore B ELISA positivo per dsdna SC, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi 5. Calibratore C ELISA positivo per dsdna SC, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi 6. Calibratore D ELISA positivo per dsdna SC, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi 7. Calibratore E ELISA positivo per dsdna SC, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi 8. Controllo debolmente positivo per dsdna SC, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani della classe dsdna, prediluito, 1,2mL 9. Diluente per campioni Type III, 2 flacones di colore giallo contenente Tween 20, stabilizzatori delle proteine e conservante, 50mL 10. Soluzione di lavaggio HRP Concentrata, 1 flacone di soluzione concentrata 40x di colore rosso contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris e Tween 20, 25mL. Vedi la Sezione Metodi per le istruzioni sulla diluizione. 11. dsdna SC Controllo a singola elica ssdna, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani ssdna, prediluito, 1,2mL 12. Coniugato dsdna SC IgG, 1 flacone di colore blu contenente tampone, stabilizzatori delle proteine e conservante, 10mL 13. Cromogeno TMB, 1 flacone contenente stabilizzatori, 10mL 14. Soluzione di arresto HRP, Acido solforico 0,344M, 1 flacone incolore, 10mL Avvertenze 1. ATTENZIONE: Questo prodotto contiene un composto chimico (cloramfenicolo allo 0,02%) i campioni, nei controlli, diluente e nel coniugato, noto allo Stato della California come causa di tumori. La diluente per campioni contenente Proclin 150. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. 2. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-hiv, per HBsAg e per anticorpi anti-hcv mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controllo debolmente positivo per dsdna SC, dsdna SC Calibratori A E, dsdna SC Controllo a singola elica ssdna ed Controllo ELISA Negativo devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi. 8 1

2 3. La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. 4. Il Coniugato HRP contiene un composto chimico velenoso/corrosivo, che può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 5. Il Cromogeno TMB contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. 6. La Soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. Evitare l esposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L acido solforico è velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 7. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 8. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. 2. Il presente prodotto deve essere utilizzato da personale specializzato. 3. Si raccomanda di osservare la procedura del test alla lettera. Qualsiasi variazione potrebbe influire sui risultati e la qualità del dosaggio. Non trascurare le eventuali Note ed avvertenze contenute nelle istruzioni. 4. I reattivi provenienti da lotti diversi di kit NON sono intercambiabili. Se si effettuano molti dosaggi, occorre avere l accortezza di controllare che tutti I reattivi provengano dallo STESSO lotto. Tutti gli strip utilizzati devono provenire dalla medesima custodia di alluminio. La sostituzione di qualsiasi componente può portare a risultati errati. 5. Per evitare contaminazioni, utilizzare solamente vetreria/contenitori di plastica nuovi o perfettamente puliti. Mai versare reattivi inutilizzati nuovamente nel flacone di origine. 6. Accertarsi che il tampone di lavaggio sia diluito in un contenitore perfettamente pulito. Se la soluzione, una volta diluita, dovesse assumere un aspetto opaco durante il periodo di conservazione, dovrà essere scartata e preparata fresca. 7. Non lasciare i flaconi dei reattivi stappati; qualsiasi evaporazione o contaminazione che ne risultasse darà luogo a risultati inattendibili. 8. Il substrato TMB deve essere mantenuto al riparo dalla luce e dall acqua. 9. I sieri con contaminazioni microbiche, emolizzati o lipemici ed i campioni contenenti particelle non devono essere utilizzati. 10. Si consiglia l utilizzo di pipette calibrate e di sieri di controllo interni. 11. L utilizzo di campionatori automatici, diluitori per campioni o di qualsiasi altro tipo di strumentazione automatica può dar luogo a differenze nei risultati, rispetto al procedimento manuale. È responsabilità del laboratorio convalidare il sistema di automazione, verificando che i risultati rientrino nei limiti definiti nella presente metodica e nel certificato QC annesso. 12. Tutta la strumentazione utilizzata dovrà essere tarata e sottoposta alla manutenzione periodica suggerita dalla casa madre. Condizioni di conservazione 1. Il kit va conservato a 2-8 C e non deve essere congelato. Temperature di conservazione inappropriate possono influire negativamente sul risultato. 2. Il tampone di lavaggio diluito può essere conservato a 2-8 C per 1 settimane. 3. La data di scadenza del kit è riportata sull etichetta esterna. Raccolta dei campioni 1. I campioni di sangue devono essere presi tramite prelievo venoso e lasciati coagulare naturalmente per separare il siero. 2. Il siero può essere conservato a 2-8 C per un massimo di 7 giorni prima del dosaggio 6 o per conservarlo più a lungo lo si può dividere in aliquote e conservare a -20 C o a temperature inferiori. 3. Il ripetuto scongelamento e ricongelamento dei campioni deve essere evitato. 4. I campioni di siero non devono essere inattivati al calore, poichè questo può dare risultati falsi positivi. Procedura Materiali forniti Foglietto illustrativo: Dà esaurienti dettagli del test. Certificato Controllo Qualità (CQ): Indica i risultati attesi del lotto. Pozzetti rivestiti di transglutaminasi umana: 12 strisce separabili di 8 pozzetti sensibilizzati l antigene dsdna estratto da timo di vitello. Ogni piastra è confezionata in una busta di alluminio risigillabile contenente due bustine essiccanti. Controllo negativo ELISA: 1 flacone contenente 1,2mL di siero umano diluito. Il valore atteso è fornito sul certificato CQ. Pronto per l uso. Calibratori dsdna SC: 5 flaconi, ciascuno contenente 1,2mL di siero umano diluito, con le seguenti concentrazioni di autoanticorpi anti-dsdna: 1000; 333; 111; 37; 12,3 IU/mL. Pronto per l uso. Controllo positivo dsdna SC: 1 flacone contenente 1,2mL di siero umano diluito. Il valore atteso è fornito sul certificato CQ. Pronto per l uso. Diluente del campione Type III: 2 flaconi contenenti 50mL di tampone per la diluizione del campione. Colorato giallo, pronto per l uso. Soluzione di lavaggio HRP Concentrata (40X): 1 flacon contenente 25mL di un tampone concentrato 40 volte per lavare i pozzetti. 2

3 Controlo a singola elica dsdna: 1 flacone contenente 1,2mL de siero umano diluto. Il valore atteso è fornito sul certificato CQ. Pronto per l uso. HRP Coniugato dsdna SC IgG: 1 flacone contenente 10mL di anticorpi purificati anti-igg umane, coniugati con perossidasi. Colorato in blu, pronto per l uso. Cromogeno TMB: 1 flacone contenente 10mL di substrato TMB. Pronto per l uso. Soluzione di arresto HRP: 1 flacone contenente 10mL di acido solforico 0,344M. Pronto per l uso. Materiali richiesti ma non forniti Lavatore automatico per micropiastre: È consigliato, sebbene il lavaggio della piastra possa essere eseguito manualmente. Lettore per piastre: In grado di misurare la densità ottica a 450nm, calibrato contro aria. Acqua distillata o deionizzata: Si raccomanda l uso di acqua della migliore qualità disponibile. Micropipette calibrate: Per dosare 1000, 100 e 10µL. Pipetta multicanale: Consigliata per dosare volumi di 100µL di coniugato, substrato e soluzione bloccante. Provette di vetro/plastica: Per la diluizione dei campioni. Metodica Prima di incominciare 1. Portare il kit a temperatura ambiente Il kit è stato messo a punto per una procedura a temperatura ambiente (20-24 C). Togliere il kit dal luogo di conservazione e attendere che raggiunga la temperatura ambiente (per circa 60 minuti). I pozzetti non devono essere rimossi dalla custodia di alluminio finché non abbiano raggiunto la temperatura ambiente. Nota: I kit si mantengono a temperatura ambiente per una settimana. 2. Componenti del kit Miscelare uniformemente ciascun componente del kit prima dell uso. 3. Diluizione del tampone di lavaggio (concentrato 40x) Diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone fornito con il kit a 975mL di acqua distillata o deionizzata. Se non si usa l intera piastra in una sola volta, si può preparare una minore quantità di soluzione di lavaggio aggiungendo 2,0mL di concentrato a 78mL di acqua distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 1 settimana a 2-8 o C. 4. Diluizione dei campioni Diluire 10µL di ciascun campione con 1000µL di diluente dei campioni (1:101) e miscelare accuratamente. Nota: I campioni diluiti devono essere utilizzati entro 8 ore. 5. Manipolazione degli strip e del supporto Inserire il numero desiderato di pozzetti negli strip, a partire dal pozzetto A1, riempiendo le colonne da sinistra a destra, fino a completare l intera piastra. Durante tale procedura è opportuno premere sui lati più lunghi del supporto, per evitare la fuoriuscita dei pozzetti. Nota: Riporre immediatamente i pozzetti non utilizzati nella custodia di alluminio con le 2 bustine di essiccante, richiudendo saldamente per ridurre al minimo l esposizione all umidità. Assicurarsi che non vi siano strappi o forature nella custodia di alluminio: AVVERTENZA: L esposizione dei pozzetti all umidità, la contaminazione da polvere o da qualsiasi altro tipo di particelle può dar luogo al deterioramento degli antigeni, con risultati del dosaggio poco attendibili. Esecuzione del test 1. Dispensazione dei campioni Dispensare 100µL di ciascun calibratore, controllo e campione prediluito (1:101) nei rispettivi pozzetti, all interno della piastra. Nota: I campioni devono essere dispensati il più velocemente possibile per ridurre al minimo l effetto deriva sul dosaggio. Far partire il timer dopo aver dispensato l ultimo campione. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. 2. Lavaggi La procedura di lavaggio rappresenta un passaggio critico e richiede particolare attenzione. Una piastra non lavata correttamente può dare risultati inaccurati, con scarsa precisione ed elevati rumori di fondo. Terminata l incubazione, lavare la piastra 3 volte con µL di tampone di lavaggio per pozzetto. Utilizzare un lavatore automatico oppure procedere manualmente come qui di seguito riportato. Dopo l ultimo lavaggio automatico, capovolgere la piastra su carta assorbente picchiettando delicatamente. Le piastre possono essere lavate manualmente come segue: a. Rovesciare il contenuto della piastra in uno scarico. b. Capovolgere la piastra su carta assorbente picchiettando delicatamente. c. Con una multicanale, dispensare µL di tampone di lavaggio. d. Agitare la piastra delicatamente su una superficie piana. e. Ripetere a-d due volte. f. Ripetere a e b. 3. Dispensazione del coniugato Dispensare 100µL di coniugato in tutti i pozzetti. Rimuovere eventuali schizzi sulla superficie dei pozzetti con carta assorbente. Nota: Per evitare contaminazioni, non versare il coniugato in eccesso nuovamente nel flacone d origine.incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. 4. Lavaggio Procedere come al punto Dispensazione del substrato (TMB) Dispensare 100µL di substrato TMB in tutti i pozzetti. Rimuovere eventuali schizzi sulla superficie dei pozzetti con carta assorbente. Nota: Per evitare contaminazioni, non versare il substrato in eccesso nuovamente nel flacone d origine. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al riparo dalla luce. 6. Dispensazione del bloccante Dispensare 100µL di soluzione bloccante in tutti i pozzetti. Il colore virerà dal blu al giallo. 3

4 7. Lettura delle densità ottiche Leggere le densità ottiche (DO) dei pozzetti a 450nm in un lettore per micropiastre, entro 30 minuti dalla dispensazione del bloccante. Controllo di qualità 1. Controllo qualità Per essere valido il dosaggio deve rispettare i seguenti requisiti: I calibratori e i controlli negativo, positivo e a singola elica devono essere inclusi in ogni seduta. I valori ottenuti per ciascun controllo devono rientrare nei range specificati sul Certificato QC. La forma della curva dovrà essere simile a quella riportata sul Certificato QC. Se non vengono rispettati i suddetti criteri, il dosaggio sarà invalidato e si dovrà ripetere la seduta. 2. Calcolo delle densità ottiche medie (solo per dosaggi in doppio) Calcolare la DO media delle due letture per ciascun calibratore, controllo e campione dispensato in doppio. Il C.V.% di ciascun replicato dovrà essere inferiore al 15%. 3. Tracciare la curva di calibrazione La curva di calibrazione potrà essere tracciata in automazione o manualmente come segue, con la concentrazione degli autoanticorpi anti-dsdna su scala log, rispetto alle DO su scala lin, per ciascun calibratore: In automazione utilizzare un software adeguatamente validato, scegliendo il fitting che meglio si adatta ai dati. Manualmente utilizzando carta log/lineare (semilogaritmica) tracciare una curva uniforme attraverso i punti (non una retta o una punto-punto). 4. Trattamento dei punti anomali Se uno dei punti fuoriesce dalla curva, questo potrà essere rimosso. Se in seguito a tale rimozione la curva assume una forma diversa rispetto a quella riportata sul Certificato QC o se più punti risultano fuorvianti, il dosaggio dovrà essere ripetuto. 5. Calcolo dei livelli anticorpali nei controlli e nei campioni diluiti Leggere i livelli degli autoanticorpi anti-dsdna nei controlli e nei campioni prediluiti direttamente sulla curva di calibrazione. I valori dei controlli dovrebbero rientrare nei range riportati sul Certificato QC. Nota: I valori dei calibratori sono già corretti considerando un fattore 100 per la prediluizione 1:101 dei campioni. Non sono pertanto necessarie ulteriori correzioni. 6. Calibrazione del dosaggio Il dosaggio è calibrato in IU/mL rispetto al calibratore di riferimento OMS Wo80 7. Limitazioni del test 1. Il presente kit va utilizzato unicamente come sussidio diagnostico. Un risultato positivo è indice di alcune patologie che andranno confermate attraverso i parametri clinici e ulteriori test sierologici. 2. I risultati ottenuti nel dosaggio non rappresentano una prova diagnostica dell insorgere o meno di una determinata patologia. 3. I risultati borderline dovrebbero essere ripetuti, con un nuovo prelievo o a distanza di tempo. È fondamentale analizzare i pazienti regolarmente, per seguire gli sbalzi nei livelli di autoanticorpi antidsdna. Valori attesi Il range di normalità è stato determinato sul siero di 113 donatori sani adulti. Il limite superiore di normalità è espresso come concentrazione media + 5 DS ed equivale a 30 IU/mL, con una media di 9,2 e DS di 4,4 IU/mL. I range rappresentano unicamente un parametro guida. I dosaggi ELISA risultano molto sensibili e in grado rivelare differenze minime nelle popolazioni dei campioni. Si raccomanda pertanto che ciascun laboratorio stabilisca i propri limiti di normalità, in base alla popolazione locale, alla strumentazione e alle tecniche impiegate. INTERPRETAZIONE < 30 IU/mL Negativo IU/mL Borderline > 75 IU/mL Positivo Precisione La precisione intra- ed inter-saggio è stata determinata su 3 campioni che rientravano nei range della curva di calibrazione. Le medie ed i C.V.% di ciascun campione sono qui di seguito riportati: PRECISIONE INTRA-SAGGIO n=16 Concentrazione (IU/mL) C.V. % Campione ,0 Campione ,7 Campione ,1 PRECISIONE INTER-SAGGIO n=3 Concentrazione (IU/mL) C.V. % Campione ,2 Campione ,5 Campione ,6 4

5 Range normale Sono stati determinati i livelli degli autoanticorpi anti-dsdna nei sieri provenienti da 113 donatori sani. I risultati sono illustrati nel seguente grafico. In base a un cut-off negativo di 30 IU/mL, nessuno dei campioni è risultato borderline o positivo. Numero di campioni < >25 Anti-dsDNA IU/mL Specificità, Sensibilità e Concordanze Sono state determinate specificità, sensibilità e concordanza relative, rispetto a un kit EIA alternativo per antidsdna ed immunofluorescenza su Crithidia luciliae, utilizzando 69 campioni. Per un confronto con Crithidia, i campioni borderline al kit ELISA sono stati considerati positivi. EIA EIA Alternativo + Dubbi BINDAZYME Dubbi Anti-dsDNA EIA Sensibilità relativa 97,8% Specificità relativa 95,7% Concordanza relativa 97,1% Crithidia luciliae Crithidia luciliae + - BINDAZYME Anti-dsDNA EIA Sensibilità relativa 95,7% Specificità relativa 91,3% Concordanza relativa 94,2% Sensibilità Analitica La sensibilità è stata determinata come concentrazione media + 2 DS, su 20 determinazioni del diluente dei campioni, ottenendo un valore di 4,6 IU/mL. Sostanze Interferenti Sono stati dosati vari tipi di siero per verificare i possibili effetti di sostanze interferenti, utilizzando un kit Interference Check A plus (Kokusai, Giappone). Sostanza Bilirubina F (libera) Bilirubina C (coniugata) Emoglobina emolizzata Chilo Fattore reumatoide Concentrazione 18,3mg/dL 19,0mg/dL 490mg/dL 1930 Units 50 IU/mL Non sono state osservate interferenze con bilirubina libera o coniugata, emoglobina, lipidi o fattore reumatoide. Range di Misurazione Il range di misurazione del dosaggio è tra 12, IU/mL. 5

6 Riassunto del metodo 1. Dispensare 100µL di ciascun controllo e calibratore pronto per l uso e dei campioni diluiti 1:101 nei rispettivi pozzetti. Incubare per 30 minuti. Lavare. 2. Dispensare 100µL di coniugato in tutti i pozzetti. Incubare per 30 minuti. Lavare. 3. Dispensare 100µL di substrato in tutti i pozzetti. Incubare per 30 minuti. 4. Dispensare 100µL di soluzione bloccante in tutti i pozzetti. Misurare l assorbanza a 450nm. Schema Piastra A B C D E F G H 6

7 Bibliografia 1. Stollar B D. Antibodies to DNA. CRC Critical Review of Biochemistry, 1986; 20: Stollar B D. The specificity and applications of antibodies to helical nucleic acids. CRC Critical Review of Biochemistry, 1975; 3: Swaak AJ et al. Anti-dsDNA and complement profiles as prognostic guides in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheumatism, 1979; 22: Koffler D et al. Systemic lupus erythematosis: Prototype of immune complex nephritis in man. J Exp Med, 1971; 134 (suppl): ter Borg EJ et al. Measurement of increases in anti-double stranded DNA antibody levels as a predictor of disease exacerbation on systemic lupus erythematosus, a long term, prospective study. Arthritis Rheumatism, 1990; 33: Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield Feltkamp T E W. et al. The First International Standard for Antibodies to Double Stranded DNA. Annals of Rheumatic diseases, 1988; 47: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. QUANTA Lite e INOVA Diagnostics são marcas registradas Copyright 2011 Todos os Direitos Reservados Fornitore: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Rappresentante Autorizzato: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: ITA July 2012 Revision 3 7