NOVA Gel TM SS-A/SS-B S Per uso diagnostico In Vitro
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- Gennara Carbone
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1 NOVA Gel TM SS-A/SS-B S Per uso diagnostico In Vitro Finalità d uso Il NOVA Gel TM SS-A/SS-B è un sistema di analisi a doppia diffusione per lo screening e la determinazione semi-quantitativa nel siero umano di autoanticorpi contro l SS-A/SS-B, un antigene nucleare estraibile (ENA). La presenza di anticorpi verso l SS-A/SS-B può essere utilizzata, assieme ad altre analisi sierologiche e ai riscontri clinici, come ausilio nella diagnosi di lupus eritematoso sistemico (LES) e di altre patologie a carico del tessuto connettivo, come la Sindrome di Sjogrens. Riassunto e Spiegazione del test La definizione anticorpi antinucleo (ANA) descrive una varietà di autoanticorpi che reagisce con costituenti dei nuclei delle cellule come il DNA, l RNA e diverse proteine e ribonucleoproteine. 1 Questi autoanticorpi si riscontrano con frequenza elevata in pazienti affetti da malattie reumatiche o del tessuto connettivo, soprattutto nel LES. Praticamente tutti i pazienti affetti da LES sono positivi agli ANA. Questa sensibilità diagnostica ha portato ad includere l analisi degli ANA nella revisione del 1982 dei criteri per la classificazione del lupus eritematoso sistemico compilata da un sottocomitato della Arthritis and Rheumatism Association (associazione per patologie artritiche e reumatiche). 2 Malgrado l analisi degli ANA sia un test di screening eccellente per il LES (un risultato negativo esclude praticamente il LES in fase attiva 3 ) non è affatto un test specifico. La tendenza attuale nella diagnosi e nella gestione delle malattie del tessuto connettivo è di abbinare un test iniziale di screening sensibile agli ANA a test di follow-up più specifici come il dsdna e/o gli ENA. I test ENA sono particolarmente importanti perché forniscono sia informazioni diagnostiche che prognostiche. Gli autoanticorpi verso gli SS-A si riscontrano nel 40-50% dei pazienti affetti dalla sindrome di Sjogren e nel 25% dei pazienti affetti da LES ANA positivi. 4,5 Gli anticorpi verso gli SS-B si riscontrano nel 23% dei pazienti affetti dalla sindrome di Sjogren e nel 5-10% dei pazienti affetti da LES. 4,5 Gli anticorpi SS-A ed SS-B sono stati riscontrati in alcuni pazienti con manifestazioni cliniche del LES, fra cui manifestazioni cutanee importanti, ma con negatività agli ANA, specialmente quando sono state utilizzate come substrato sezioni di roditori. 6,7 Gli anticorpi contro gli SS-A e gli SS-B sono fortemente associati al LES neonatale ed al blocco cardiaco congenito. 5,8 Diversi studi suggeriscono di utilizzare gli anticorpi SS-B come marker sierologico per il complesso SS-sicca, dato che gli anticorpi SS-B si riscontrano in circa il 60% di questi pazienti. 9,10 Principio della Metodica Il test a doppia diffusione, descritto da Ouchterlony, 11 consente la diffusione passiva di una soluzione di antigene attraverso una matrice di supporto in forma di gel verso il campione del paziente e/o un controllo contenente l anticorpo. Dei pozzetti di forma speciale perforati nella matrice gelatinosa fungono da serbatoi dai quali le soluzioni di antigene e di anticorpo diffondono l una verso l altra. Nel punto di equivalenza antigene/anticorpo si forma una linea di precipitina visibile nel gel. Lo stato immunologico del paziente può essere quindi determinato osservando i pattern di linee di precipitina adiacenti che si sono formate nel gel e tramite un campione di controllo di specificità conosciuta e del siero del paziente sconosciuto. La tecnica a doppia diffusione può essere utilizzata con una preparazione purificata di SS-A/SS-B, un controllo con quantità conosciuta di autoanticorpi anti-ss-b o SS-A e del siero del paziente che si sospetta contenga autoanticorpi SS-B e/o SS-A per mostrare identità o non identità immunologica. La conferma dell attività autoanticorpale SS-B e/o SS-A nel siero del paziente può essere data se la relativa linea di precipitina si fonde in maniera caratteristica con la linea formata da un campione di controllo conosciuto. 1
2 La procedura corretta del test a doppia diffusione richiede la prova con vari rapporti di concentrazione antigene-anticorpo per evitare un eccesso di antigene o di anticorpo. Infatti si possono formare delle linee di precipitina scorrette o fuorvianti se esiste un eccesso di antigene o di anticorpo. Per evitare che ciò accada si dovrebbero testare diverse diluizioni del siero del paziente contro la stessa preparazione di antigeni. Le piastre NOVA Gel a S sono state ideate per portare a termine questo compito con facilità. I pozzetti esagonali grandi sono calibrati per contenere la concentrazione 1:1 o pura del siero del paziente o dei controlli. I pozzetti rettangolari piccoli, per via del loro design, formano automaticamente una diluizione approssimativamente dell 1:4 del campione di siero puro del paziente. Reagenti 1. Piastre di screening in gel NOVA Gel a S, 7 pozzetti ognuna, contenenti stabilizzatori ed azoturo di sodio allo 0,09% 2. 0,4 ml antigene SS-A/SS-B (da timo di vitello), liofilizzato in tampone contenente stabilizzatori ed azoturo di sodio allo 0,09% 3. 0,7 ml controllo SS-B, siero umano contenente autoanticorpi verso SS-B in tampone contenente azoturo di sodio allo 0,09% 4. 0,7 ml controllo SS-A, siero umano contenente autoanticorpi verso SS-A in tampone contenente azoturo di sodio allo 0,09% Avvertenze 1. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-hiv, per HBsAg e per anticorpi anti- HCV mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controlli SM ed SS-A devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. 3. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 4. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili. 3. Si raccomanda di utilizzare acqua sterile distillata o deionizzata per reidratare l antigene. 4. La performance dell analisi è influenzata da una varietà di fattori. Questi includono la temperatura iniziale dei reagenti, l eventuale trabocco dai pozzetti dei reagenti o dei campioni da analizzare e la qualità dell acqua utilizzata per reidratare l antigene. È necessario prestare attenzione alla coerenza per ottenere risultati accurati e riproducibili. 5. Si raccomanda di attenersi strettamente al protocollo. Condizioni di conservazione Conservare tutti i reagenti a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e maneggiati conformemente alle istruzioni. Una volta reidratato, l antigene è stabile per 2 settimane a 2-8 C. Se si desidera si possono preparare aliquote di antigene di 100 μl e conservarle a < -70 o C. L antigene conservato in questo modo è stabile per almeno un anno. 2
3 Raccolta dei campioni Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L aggiunta al campione di sodio azide o di altri conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l uso di sieri fortemente emolizzati o lipemici. Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A2 dell NCCLS raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8 C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a -20 C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati. Procedura Materiali forniti 8 piastre per screening preforate NOVA Gel a S 2 0,4 ml antigene SS-A/SS-B, liofilizzato 1 0,7 ml controllo SS-B 1 0,7 ml controllo SS-A Materiali richiesti ma non forniti Micropipette che rilasciano un volume di μl Punte per micropipette monouso Salina allo 0,85% Acqua distillata o deionizzata (preferibilmente sterile) Fonte di luce o cassetta per osservare il gel Metodica 1. Reidratare l antigene SS-A/SS-B Aprire con cura una boccetta con l antigene ed aggiungere 0,4 ml di acqua distillata o deionizzata all antigene liofilizzato. Per ottenere risultati ottimali si raccomanda vivamente di utilizzare acqua distillata o deionizzata sterile. Lasciare riposare l antigene reidratato per 5 minuti e poi mescolarlo accuratamente con movimento rotatorio prima di utilizzarlo. 2. Riempire la piastra in gel Riempire la piastra in gel con l antigene ed i controlli (approssimativamente 80 μl per i pozzetti grandi) come illustrato qui di sotto. Ogni campione del paziente si dovrebbe applicare, fino a riempirlo, sia in un pozzetto grande esagonale (approssimativamente 80 μl) che in uno piccolo rettangolare (approssimativamente 20 μl) come da illustrazione. Non è necessario che i volumi di riempimento siano assolutamente esatti, mentre è importante NON FARE TRABOCCARE IL LIQUIDO DAI POZZETTI. I pozzetti di controllo possono essere riempiti utilizzando direttamente le bottiglie a spruzzo in plastica oppure le micropipette. Se si utilizzano le bottiglie a spruzzo in plastica, posizionare la punta del dispensatore nel pozzetto e spremere delicatamente la bottiglia fino a che il livello del liquido raggiunge quasi il bordo del pozzetto. Coprire la piastra immediatamente dopo aver riempito i pozzetti. Nota: il volume inferiore dei pozzetti rettangolari riduce la concentrazione locale dell anticorpo del paziente SENZA CHE SIA NECESSARIO DILUIRE IL CAMPIONE. La diluizione effettiva dei pozzetti piccoli è approssimativamente 1:4. Ciò riduce la possibilità di falsi negativi per via dell eccesso di anticorpo. 3
4 3. Incubazione Lasciare incubare la piastra o le piastre coperte a temperatura ambiente per 24 ore, su una superficie stabile e piatta. Esaminare le piastre e rilevare l eventuale presenza di linee di precipitina che si sono formate fra il campione del paziente e l antigene. Esaminare la relazione fra questa linea e le linee di precipitina dei controlli. Riesaminare le piastre dopo 48 ore per verificare se si sono formate altre linee prima di interpretare definitivamente i risultati. Controllo di qualità Per essere sicuri che tutti i reagenti abbiano agito in maniera adeguata e di aver seguito in maniera corretta tutte le procedure, per ogni analisi si dovrebbero effettuare anche le prove con i controlli SS-B e SS-A. Si può preparare dell ulteriore siero di controllo formando ed aliquotando un pool di siero umano e conservandolo a < -70 o C. I risultati possono essere considerati validi solo se risulta visibile una linea di precipitina fra i pozzetti dei controlli SS-B ed SS-A e quelli degli antigeni SS-A/SS-B. Interpretazione dei risultati Per osservare in maniera ottimale le linee di precipitazione, si raccomanda di seguire la seguente procedura: 1. Rimuovere il coperchio della piastra. 2. Mantenere la piastra in una posizione che renda minima la riflessione della superficie del gel. 3. Illuminare la piastra in maniera che la luce arrivi parallela alla superficie del gel. Nota: assicurarsi che la fonte di luce sia coperta da vista diretta. 4. Le linee di precipitina si scorgono in maniera migliore se osservate contro uno sfondo scuro e mantenendo un angolo. 5. Una lente di ingrandimento può essere di aiuto nella osservazione di linee deboli o per distinguere campioni che non presentano identità. Reazione negativa. Un campione viene considerato negativo se dopo 48 ore non si formano linee di precipitina visibili fra i pozzetti del paziente e quello dell antigene. Interpretazione della specificità. Nella doppia diffusione la specificità è determinata notando la relazione fra le linee di precipitina del campione e quelle dei controlli conosciuti. Si possono verificare le seguenti possibilità con il test NOVA Gel TM SS-A/SS-B: Fig. 1: Non-Identità Fig. 2: Identità SS-B Fig. 3: Identità SS-B e SS-A La linea di precipitina del paziente 1 attraversa o mostra non-identità sia con il controllo SS-B che con l SS-A. Ciò sta ad indicare che il paziente reagisce con un antigene ENA diverso dall SS- B o dall SS-A. La linea di precipitina del paziente 1 si fonde o mostra identità con la linea di controllo SS-B. Il paziente 1 ha due linee di precipitina. Una delle linee mostra identità con il controllo SS-B e l altra con il controllo SS-A. Questo paziente presenta autoanticorpi verso entrambi gli antigeni SS-B e SS-A. 4
5 Limitazioni del test 1. L interpretazione dei risultati può risultare difficile in presenza di più linee di precipitina. In questi casi si raccomanda di ripetere l esame diluendo il campione con soluzione salina 1:2 o 1:4, ponendo ogni diluizione sia in un pozzetto esagonale che in uno rettangolare. Ciò rende le diluizioni nel pozzetto rettangolare rispettivamente 1:8 o 1:16. Diluire il campione può eliminare linee deboli o allontanare fra di loro le linee congiunte, rendendo così più facile l interpretazione. 2. Malgrado la geometria unica di questo test lo renda una cosa poco probabile, il fenomeno della prozona è una possibilità. Il fenomeno della prozona si ha quando la quantità di autoanticorpo del paziente è notevolmente in eccesso rispetto alla quantità dell antigene. Ciò fa si che la linea di precipitina si formi sulla facciata del pozzetto dell antigene. Per via di questo fenomeno, per evitare una erronea interpretazione del test come falso negativo, si raccomanda di ripetere l esame dei campioni che si sospetta siano positivi a diluizione, con soluzione salina, di 1:2 o di 1:4. 3. Se per la reidratazione dell antigene si utilizza acqua non sterile o contaminata, l antigene potrebbe subire una degradazione immediata o progressiva. In questo caso si potrebbe non formare una linea di precipitina o potrebbe formarsi una linea molto debole. 4. Il controllo SS-B non è monospecifico e potrebbe contenere dell SS-A. 5. I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e del risultato degli altri test sierologici. 6. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero. Valori attesi Il test a doppia diffusione NOVA Gel TM SS-A/SS-B è stato utilizzato per valutare vari pazienti affetti da malattie del tessuto connettivo nonché 200 donatori di sangue scelti in maniera casuale. I risultati sono riassunti qui di sotto: Gruppo di pazienti Numero Numero di positivi al NOVA Gel ENA Test Positivi SS-B Positivi SS-A LES Lupus indotto da droghe Artrite reumatoide Sclerodermia Dermatomiosite Sindrome di Sjogren Normali
6 Bibliografía 1. Tan E. Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: , Tan E, et. al. The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: , Casalo SP, Friou GJ, Myers LL. Significance of antibody to DNA in systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: , Alexander, EL et al. Ro(SS-A) and La(SS-B) antibodies in the clinical spectrum of Sjogren's Syndrome, J Rheumatol 9: , Kephart DC et al. Neonatal Lupus Erythematosus: New Serologic Findings, J Invest Derm 77: , Provost TT et al. Antibodies to cytoplasmic antigens in lupus erythematosus-serologic disease. Arth and Rheum 20: , Maddison PJ, Provost TT, Reichlin M. Serological findings in patients with "ANA negative" systemic lupus erythematosus. Medicine 60:87-93, Franco HL et al. Autoantibodies directed against sicca syndrome antigens in the neonatal lupus syndrome. J. Am Acad Dermatol 4:67-72, Alspaugh MA, Tan EM. Serum antibody in rheumatoid arthritis reactive with a cell associated antigen, Arth and Rheum 19: , Scopelitis E, Biundo JJ and Alspaugh MA. Anti-SS-A antibody and other anti-nuclear antibodies in systemic lupus erythematosus, Arth and Rheum 23: , Ouchterlony O: Diffusion-in-gel methods for immunological analysis. Prog Allergy 5:1, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. Fornitore: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Rappresentante Autorizzato: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service ITA November 2009 Revision 12 6
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