NOVA Lite Skin Antibody Primate Esophagus Autoantibody Screen Assay Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata

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1 NOVA Lite Skin Antibody Primate Esophagus Autoantibody Screen Assay Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata Finalità d uso NOVA Lite SA è un test immunofluorescenza indiretta per lo screening e la determinazione semi-quantitativa degli autoanticorpi diretti verso la cute nel siero umano. La presenza di anticorpi anti-cute può essere utilizzata assieme ad altre analisi sierologiche e ai riscontri clinici come ausilio nella diagnosi di malattie cutanee autoimmuni, soprattutto il pemfigo ed il pemfigoide. Riassunto e Spiegazione del test La definizione autoanticorpi cutanei include una varietà di autoanticorpi che reagisce con costituenti della superficie cutanea e mucosa. Questi autoanticorpi si riscontrano con frequenza elevata in pazienti con malattie autoimmuni della cute, specialmente nel pemfigo e nel pemfigoide. Gli autoanticorpi che reagiscono contro un antigene intercellulare della cute e della mucosa si riscontrano in praticamente tutti i casi di pemfigo. 1 Il titolo di questi anticorpi segue il decorso della malattia e diminuisce dopo una terapia efficace. 2,3,4 Il pemfigoide bolloso, un altra malattia cutanea autoimmune importante, è caratterizzato sierologicamente dalla presenza di anticorpi diretti contro la membrana basale della cute e della mucosa. Gli anticorpi diretti contro la membrana basale si riscontrano nel 70-80% dei pazienti affetti da pemfigoide. 5,6,7 La correlazione fra la gravità della malattia ed il titolo anticorpale non è ovvia come nel pemfigo, ma esiste. Nei periodi di remissione, spontanea o in seguito a terapia, gli anticorpi diretti contro la membrana basale diminuiscono, in genere a livelli talmente bassi da non essere più rilevabili. 7 Nella maggior parte dei casi di ricaduta riappaiono gli autoanticorpi diretti contro la membrana basale. Il metodo utilizzato più di frequente per la determinazione degli autoanticorpi cutanei è la immunofluorescenza indiretta. I substrati più comuni sono sezioni sottili di cute e mucosa di topo o di primati. Il substrato migliore è l esofago dei primati. 8,9,10 Oltre al tipo di substrato, esistono altri fattori di vitale importanza per la performance dell analisi per la determinazione degli autoanticorpi cutanei: 1) il fissativo utilizzato per preparare il vetrino con il substrato 2) la specificità ed il rapporto fluoresceina/proteina (F/P) del coniugato utilizzato marcato FITC. È noto, infatti, che alcuni fissativi o loro combinazioni distruggono certi antigeni cutanei e si dovrebbe quindi evitarne l utilizzo. Il rapporto F/P di un coniugato determina la sensibilità ed il grado di colorazione di fondo. La specificità di un coniugato è di vitale importanza. La maggioranza degli autoanticorpi appartiene alla sottoclasse delle IgG. Quando si riscontrano autoanticorpi in donatori di sangue sani, questi appartengono quasi sempre alle sottoclassi IgM ed IgA e solo molto raramente IgG. 11 Per questo motivo i coniugati specifici per le IgG sono più specifici per la malattia. Il substrato scelto per il NOVA Lite Skin Antibody è una sezione di stomaco di primato fissata in maniera ottimale. Il coniugato è costituito da anti-igg umane purificate per affinità. Principio della Metodica Nel test all immunofluorescenza indiretta dei campioni vengono incubati con il substrato dell antigene e gli anticorpi che non hanno reagito vengono lavati via. Il substrato viene incubato con un coniugato specifico marcato con fluoresceina e successivamente il reagente che non si è legato viene lavato via. Quando i campioni positivi agli autoanticorpi vengono osservati con un microscopio a fluorescenza, mostrano una fluorescenza color verde chiaro che corrisponde alle aree delle cellule o dei nuclei dove si è legato l autoanticorpo. 1

2 Reagenti 1. Vetrini per anticorpi cutanei (esofago di primati), vetrino ad 8 pozzetti, con disidratante 2. Coniugato anti-igg umano (capra), marcato alla fluoresceina in tampone contenente Blu di Evans ed azoturo di sodio allo 0,09%, 7 ml 3. Pemfigoide positivo 1 fiala di tampone contenente azoturo di sodio allo 0,09% ed anticorpi da siero umano diretti verso il pemfigoide, prediluto, 0,5 ml 4. Controllo Negativo Sistemi IFA, 1 fiala di tampone contenente azoturo di sodio allo 0,09%, senza anticorpi di siero umano anti pemfigoide, prediluto, 0,5 ml 5. Concentrato PBS II (40x), sufficiente per 1000 ml 6. Liquido di montaggio, azoturo di sodio 0,09%, 7 ml 7. Coprivetrini Avvertenze 1. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-h I V, p e r H BsAg e per anticorpi anti- HCV mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Pemfigoide positivo ed Controllo Negativo Sistemi IFA devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. 3. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 4. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili. 3. Un lavaggio incompleto o non accurato dai pozzetti IFA può causare un un elevato background. 4. L'adattamento di questo test per l'uso con un processatore automatico di campioni ed altri dispositivi di manipolazione di liquidi, in tutto od in parte, può portare differenze nei risultati dei test rispetto a quelli ottenuti eseguendo la procedura manuale. E' responsabilità di ogni laboratorio validare la loro procedura automatizzata affinché fornisca risultati dei test entro limiti accettabili. 5. La prestazione del test è influenzata da diversi fattori. Questi includono la temperatura iniziale dei reagenti, la luminosità della lampada del microscopio usato, l'accuratezza e riproducibilità della tecnica di pipettamento, la precisione del lavaggio e la lunghezza dei tempi d'incubazione durante il test. E' richiesto di prestare particolare attenzione alla consistenza per ottenere risultati accurati e riproducibili. 6. Nel tempo, il Coniugato anti IgG Umana può cambiare colore a causa di esposizione alla luce. In ogni caso, il cambiamento del colore non ha effetto sulla prestazione del test. 7. Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. 2. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 4 settimana a 2-8 C. 2

3 Raccolta dei campioni Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L aggiunta al campione di sodio azide o di altri conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l uso di sieri fortemente emolizzati o lipemici. Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A2 dell CLSI (NCCLS) raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8 C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a -20 C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati. Procedura Materiali forniti 10 8-pozzetti Vetrini Pelle anticorpi 1 7 ml Coniugato anti-igg umano 1 0,5 ml Pemfigoide positivo 1 0,5 ml Controllo Negativo Sistemi IFA 1 25 ml Concentrato PBS II (40x) 1 7 ml Liquido di montaggio 1 10 Coprivetrini Materiali richiesti ma non forniti Micropipette in grando di erogare volume di µl Acqua distillata o deionizzata Bottiglie di plastica a spruzzo o pipette Pasteur Camera umida Beuta da 1l per diluire il PBS II Vaschette Coplin Microscopio a fluorescenza con eccitatore a 495 nm e filtro barriera 515 nm Metodica Prima di incominciare 1. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20 26 C) e mescolarli bene. 2. Diluire il concentrato PBS II: IMPORTANTE: diluire il concentrato PBS II 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone contenente il concentrato PBS II in 975 ml di acqua distillata o deionizzata e mescolare accuratamente. Il tampone PBS II viene utilizzato per diluire i campioni dei pazienti e come tampone di lavaggio. Il tampone diluito può essere conservato al massimo per 4 settimane 2-8 C. 3. Diluire i campioni del paziente: a. Screening iniziale: diluire i campioni 1:10 con il tampone PBS II diluito (ovvero, aggiungere 100 µl di siero a 900 µl di tampone PBS II). b. Titolazione: preparare delle diluizioni seriali doppie dalla diluizione di screening iniziale per tutti i campioni positivi con il tampone PBS II diluito (ovvero 1:20, 1:40,... 1:2560). Esecuzione del test 1. Preparare i vetrini del substrato: lasciare raggiungere la temperatura ambiente al vetrino del substrato prima di toglierlo dal sacchetto. Contrassegnarlo con una matita e porlo in una camera umida adeguata. Aggiungere 1 goccia (70-90µL) dei controlli positivi e negativi non diluiti rispettivamente nei pozzetti 1 e 2. Aggiungere 1 goccia (70-90µL) del campione diluito del paziente nei rimanenti pozzetti. 2. Incubazione dei vetrini: incubare il vetrino per minuti in una camera umida (un tovagliolo di carta inumidito disteso sul fondo di un contenitore in plastica o vetro manterrà le condizioni di umidità adeguate). Non lasciare asciugare il substrato durante la procedura d esame. 3

4 3. Lavare i vetrini: dopo l incubazione utilizzare una bottiglia di plastica a spruzzo o una pipetta per lavare via delicatamente il siero utilizzando il tampone PBS II diluito. Orientare il vetrino e la direzione del flusso del tampone PBS II in modo da impedire il più possibile al tampone di scavalcare i vari pozzetti. Evitare di dirigere il flusso direttamente nei pozzetti per evitare danni al substrato. Se voluto, disponga gli vetrini i in un vaso di Coplin dell'amplificatore diluito di PBS II per fino a 5 minuti. 4. Aggiunta del coniugato fluorescente eliminare il tampone PBS II in eccesso. Porre nuovamente il vetrino nella camera umida ed immediatamente coprire tutti i pozzetti con una goccia di coniugato fluorescente. Incubare i vetrini per ulteriori minuti. 5. Lavare i vetrini: ripetere la fase Coprire i vetrini: le procedure per coprire i vetrini variano da laboratorio a laboratorio. Le seguenti procedure sono raccomandate: a. Porre un coprivetrino su un tovagliolo di carta. b. Applicare il liquido di montaggio in una linea continua lungo il bordo inferiore del coprivetrino. c. Eliminare il tampone PBS II in eccesso e fare combaciare il bordo inferiore del vetrino con il bordo del coprivetrino. Abbassare con delicatezza il vetrino sul coprivetrino in modo che il collante scorra fino al bordo superiore del vetrino senza formare bolle d aria. Controllo di qualità Il Pemfigoide positivo ed il Controllo negativo sistema IFA dovrebbero essere effettuati su ogni vetrino in modo da assicurarsi che tutti i reagenti e le procedure siano state eseguite nel modo corretto. Si può preparare dell ulteriore siero di controllo formando ed aliquotando un pool di siero umano e conservandolo a < -70 o C. I risultati dell analisi devono soddisfare tutti i criteri elencati qui di seguito per essere considerati validi. Se uno qualunque non viene soddisfatto, si dovrebbe considerare non valido il risultato dell esame e si dovrebbe ripetere il test. 1. Il Pemfigoide positivo non diluito deve essere > Il Controllo negativo sistema IFA deve risultare negativo. Interpretazione dei risultati Reazione negativa. Un campione viene considerato negativo se la colorazione specifica delle aree intercellulari, della membrana basale e di altre strutture è uguale o minore rispetto al controllo negativo. I campioni possono mostrare vari gradi di colorazione di fondo dovuta ad anticorpi eterofili o ad altre reazioni specifiche dovute agli anticorpi anti-reticolina, antinucleo, anti-endomisio o anti-muscolo liscio. Reazione positiva per gli anticorpi intercellulari e della membrana basale. Un campione può essere considerato positivo se si osserva una colorazione specifica delle zone intercellulari o della membrana basale della mucosa esofagea. Determinare il grado o l intensità di fluorescenza utilizzando questi criteri: 4+ Fluorescenza verde chiaro brillante 3+ Fluorescenza verde chiara accesa 2+ Fluorescenza positiva chiaramente distinguibile 1+ La fluorescenza specifica più bassa che permette di distinguere chiaramente la colorazione delle zone della membrana basale e/o intercellulare dalla fluorescenza di fondo Limitazioni del test 1. La presenza di autoanticorpi cutanei è suggestiva di alcune malattie cutanee bollose autoimmuni ma non dovrebbe essere considerata quale indicazione diagnostica. Il risultato della ricerca degli autoanticorpi dovrebbe essere valutato in combinazione con altre analisi sierologiche o bioptiche e con la storia clinica del paziente. 2. Oltre agli autoanticorpi cutanei altri autoanticorpi possono reagire con il substrato esofageo. Alcuni di questi includono autoanticorpi anti-nucleo (ANA), anti-mitocondrio (AMA), anti-muscolo liscio ed anti muscolo scheletrico. La presenza di questi anticorpi dovrebbe essere notata, e la loro presenza dovrebbe essere confermata e titolata su altri substrati approvati. 3. Si dovrebbe notare che in seguito a danni tissutali, alcuni pazienti ustionati producono anticorpi debolmente reattivi che si legano anche ad aree intercellulari. Questi cosiddetti anticorpi similpemfigo danno una colorazione debole e disomogenea della mucosa, sono di natura transitoria e non reagiscono con la cute del paziente in vivo. 13,14,15 4

5 4. Dato che la mucosa esofagea può contenere delle sostanze derivate dai gruppi sanguigni, gli isoanticorpi dei gruppi sanguigni anti-a ed anti-b possono reagire con l esofago. 16 Il pattern di reattività può imitare, in alcuni pazienti, il pattern osservato con gli autoanticorpi per il pemfigo intercellulare (anche se gli anticorpi dei gruppi sanguigni coloreranno i capillari sanguigni della muscolatura della sezione esofagea). La reattività dovuta agli anticorpi dei gruppi sanguigni può essere assorbita con antigeni dei gruppi sanguigni La sensibilità del test è influenzata da una serie di fattori esterni fra cui il tipo di microscopio a fluorescenza utilizzato, la forza e l età della lampadina, l ingrandimento utilizzato, il filtro utilizzato e l osservatore. 6. Se viene utilizzato un filtro a banda invece di un filtro barriera 515, si può osservare un numero maggiore di artefatti di colorazione. 7. Si dovrebbe utilizzare solamente una matita per marcare i vetrini. Qualunque altro tipo di materiale per scrivere può causare artefatti. 8. Le vaschette Coplin utilizzate per lavare i vetrini non dovrebbero contenere residui di colorante. L utilizzo di vaschette Coplin che contengono residui di colorante può causare artefatti. 9. I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e del risultato degli altri test sierologici. 10. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero. Valori attesi Il substrato NOVA Lite Skin Antibody è stato utilizzato per analizzare campioni provenienti da pazienti affetti da pemfigo e da pemfigoide ed anche 100 campioni provenienti da donatori di sangue scelti in maniera casuale. I risultati appaiono qui di seguito: Numero di positivi Gruppo di pazienti Numero intercellulare membrana basale Pemfigo Pemfigoide Normali

6 Bibliografia 1. Chorzelski TP, Beutner EH, Jablonska S: "The Role and Nature of Autoimmunity of Pemphigus" in Immunopathology of the Skin, second edition (EH Beutner, TP Chorzelski, SF Bean, eds.) John Wiley and Sons, NY, pp , Chorzelski TP, von Weiss JF, Lever WF: Clinical significance of autoantibodies in pemphigus. Arch. Dermatol.: 93:570, Jablonska S, et.al.: Pathogenesis of pemphigus erythematosus. Arch. Dermatol. Res. 258:135, Peck SM, et.al.: Studies in Bullous diseases. Arch. Dermatol. 103:141, Jordon RE, et.al.: Basement zone antibodies in bullous pemphigoid. JAMA 200:751, Person JR, Rogers RS: Bullous and cicatricial pemphigoid. Mayo Clin. Proc. 52:54, Chorzelski TP, Jablonska S, Beutner EH: "Pemphigoid" in Immunopathology of the Skin, second edition (EH Beutner, TP Chorzelski, SF Bean, eds.) John Wiley and Sons, NY, pp , Sabolinski ML, et.al.: Substrate specificity of anti-ephithelial antibodies of pemphigus vulgaris and pemphigus foliaceous sera in immunofluorescence tests on monkey and guinea pig esophagus sections. J. Invest. Dermatol. 88:545, O'Loughlin S, Goldman GC, Provost TT: Fate of pemphigus antibody following successful therapy. Preliminary evaluation of pemphigus antibody determination to regulate therapy. Arch. Dermatol. 114:1769, Feibeleman C, Stolzner G, Provost TT: Pemphigus vulgaris. Superiority of monkey esophagus in the determination of pemphigus antibody. Arch. Dermatol. 117:561, Wiik A: Antinuclear factors in sera from healthy blood donors. Acta. Path. Microbiol. Scand. 84: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5 th Edition. Centers for Disease Control/National Institute of Health, Ablin RJ, et.al.: Pemphigus-like antibodies in patients with skinburns. Vox Sang 16:73, Quismorio FP, Bland SL, Friou GJ: Autoimmunity in thermal injury: Occurrence of rheumatoid factors, antinuclear antibodies and antiepithelial antibodies. Clin. Exp. Immunol. 8:701, Trifthauser C, et.al.: Fluorescent antibody studies of pemphigus-like antibodies in burn sera. Ann. NY Acad. Sci. 177:227, Szulman AE: The histological distribution of blood group substances A and B in man. J. Exp. Medicine 115:977, Beutner EH, et. al.: "Defined immunofluorescence-basic concepts and their application to clinical immunodermatology." Immunopathology of the Skin, second edition (EH Beutner, TP Chorzelski, SF Bean, eds.) John Wiley and Sons, NY, pp ,

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