NOVA Lite IgG F-Actin Uso previsto Introduzione e descrizione del test Principi della procedura Reagenti Avvertenze
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- Felice Miele
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1 NOVA Lite IgG F-Actin Solo per esportazione. Non autorizzato alla vendita negli Stati Uniti. Per uso diagnostico in vitro Complessità CLIA: elevata Uso previsto Il kit NOVA Lite IgG F-Actin è un dosaggio di immunofluorescenza diretta (IFA) sul substrato epiteliale dell intestino di ratto per lo screening e la determinazione semi-quantitativa degli anticorpi IgG anti-f- Actina nel siero umano. La presenza di anticorpi IgG anti-f-actina può essere utilizzata in associazione ai risultati clinici e agli altri esami di laboratorio come ausilio nella diagnosi delle malattie epatiche autoimmuni come l'epatite autoimmune (AIH) e la cirrosi biliare primitiva (PBC). Introduzione e descrizione del test Gli autoanticorpi IgG anti-f-actina sono il componente principale dei cosiddetti anticorpi anti muscolo liscio (ASMA). 1-6 Questi anticorpi sono presenti fino nell 80% dei pazienti con epatite autoimmune (AIH) e fino nel 30% dei pazienti con cirrosi biliare primitiva 2,6, ma possono essere osservati, di solito a bassi titoli, in soggetti senza AIH. Gli ASMA sono eterogenei e includono anticorpi alle forme filamentose (F) e globulari (G) dell actina nonché a componenti non actinici come la tubulina e i filamenti intermedi. 3,4,7 Gli autoanticorpi associati all AIH sono molti. Tuttavia, gli anticorpi IgG all F-Actina sono gli autoanticorpi più specifici per l AIH. 2,5 Mentre i dosaggi per l IgG F-Actina, come il QUANTA Lite Actin IgG, consentono di rilevare la presenza di anticorpi IgG anti-f-actina in modo obiettivo e quantificabile, alcuni laboratori preferiscono la metodologia IFA per lo screening degli anticorpi IgG anti-f-actina oppure per confermarne la presenza quando questi vengono individuati mediante le convezionali sezioni tissuali di rene/stomaco/fegato di roditore. Differenziare l'anti-f-actina da altri anticorpi dei componenti del muscolo liscio è spesso difficile utilizzando i substrati IFA convenzionali come le sezioni tissutali di rene/stomaco/fegato. 2,5 L identificazione dell anti-f-actina è un ausilio importante nella diagnosi di AIH. Al momento non esiste un metodo "gold standard" per la discriminazione dell'anti-f-actina da altre reattività. 1,2 I vetrini realizzati con cellule epiteliali di intestino di ratto preparati utilizzando metodi di coltura e fissazione brevettati offrono un nuovo substrato per l individuazione di anticorpi IgG anti-f- Actina tramite IFA. Questo substrato supera alcuni dei limiti di altre procedure IFA dato che il pattern IgG anti-f-actina è distinto e gli altri anticorpi che causano un pattern di interferenza sui vetrini con rene/stomaco/fegato non interferiscono sul substrato di cellule epiteliali. Principi della procedura Nella tecnica di immunofluorescenza indiretta, i campioni vengono incubati con il substrato antigenico e gli anticorpi non legati vengono rimossi mediante lavaggio. Il substrato viene quindi incubato con coniugato specifico marcato con fluoresceina e lavato per rimuovere il reagente non legato. All'osservazione con un microscopio a fluorescenza, i campioni mostreranno una fluorescenza verde mela corrispondente alle aree in cui si è legato l autoanticorpo. Un campione viene considerato positivo se si osserva una colorazione specifica nelle fibre di F-Actina che circondano la maggior parte delle cellule secondo un pattern esagonale e talvolta nelle fibre che attraversano le cellule. Reagenti 1. Vetrini di F-Actina; 6 pozzetti/vetrino, con essiccante 2. Coniugato IgG antiumano (di capra), 1 fiala di fluoresceina marcata in tampone contenente blu di Evans e 0,09% di sodio azide 3. Controllo Positivo IgG F-Actina, 1 fiala di tampone contenente 0,09% di sodio azide e anticorpi da siero umano all F-Actina, prediluito 4. Controllo Negativo Sistemi IFA, 1 fiala di tampone contenente 0,09% di sodio azide e nessun anticorpo da siero umano all F-Actina, prediluito 5. PBS Concentrato (40x), 2 fiale 6. Mezzo di montaggio, 0,09% di sodio azide, 1 fiala 7. Coprivetrini Avvertenze 1. Tutto il materiale di origine umana utilizzato nella preparazione dei controlli per questo prodotto è stato testato ed è risultato negativo alla presenza di anticorpi al virus dell'immunodeficienza umana (HIV), dell antigene superficiale dell epatite B (HBsAg) e dell epatite C (HCV) in base a metodi approvati dall FDA. Nessun metodo di test tuttavia può offrire l'assicurazione completa dell assenza del virus dell HIV, HCV o altri agenti infettivi. Pertanto, il Controllo Positivo IgG F- Actina e il Controllo Negativo del sistema IFA devono essere trattati come materiali potenzialmente infettivi Il sodio azide viene usato come conservante. Il sodio azide è un veleno e può essere tossico se ingerito o assorbito attraverso la pelle o gli occhi. Il sodio azide può reagire con le tubature in piombo o rame e formare azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lavare i lavandini, se usati per lo smaltimento dei reagenti, con grandi volume di acqua per evitare l accumulo di azide. 1
2 3. Utilizzare attrezzatura di protezione idonea quando si manipolano i reagenti forniti. 4. I reagenti versati devono essere puliti immediatamente. Durante lo smaltimento delle scorie, attenersi a tutte le normative in materia in vigore a livello locale e nazionale. Precauzioni 1. Questo prodotto è destinato a un uso diagnostico in vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati incoerenti. 3. Un lavaggio incompleto o inefficiente dei pozzetti IFA può causare un elevato rumore di fondo. 4. L adattamento di questo dosaggio all uso con unità di sviluppo automatiche dei campioni e altri dispositivi per la manipolazione dei liquidi, anche parziale, può produrre differenze nei risultati del test rispetto a quelli ottenuti utilizzando la procedura manuale. È responsabilità di ogni laboratorio verificare che la procedura automatica dia risultati dei test entro limiti accettabili. 5. Le prestazioni del dosaggio sono influenzate da molti fattori. Tra questi figurano la temperatura iniziale dei reagenti, l intensità della lampadina del microscopio usato, la precisione e la riproducibilità della tecnica di pipettamento, l accuratezza del lavaggio e la lunghezza dei periodi di incubazione durante il dosaggio. Per ottenere risultati accurati e riproducibili è necessario prestare grande attenzione alla coerenza. 6. Si raccomanda un rigido rispetto del protocollo. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e maneggiati in accordo alle istruzioni. 2. Il tampone PBS diluito è stabile per 4 settimane a 2-8 C. Prelievo del campione Questa procedura deve essere eseguita con un campione di siero. L aggiunta di azide o altri conservanti ai campioni del test può influenzare negativamente i risultati. I campioni microbicamente contaminati, sottoposti a trattamento termico, fortemente emolizzati oppure i campioni lipemici contenenti particolato visibile non devono essere usati. Dopo il prelievo, separare il siero dal coagulo. L CLSI (NCCLS) Document H18-A3 raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) conservare i campioni a temperatura ambiente per un massimo di 8 ore; 2) se il dosaggio non verrà completato entro 8 ore, refrigerare il campione a 2-8 C; 3) se il dosaggio non verrà completato entro 48 ore, oppure per la spedizione del campione, congelare a -20 C o a una temperature inferiore. I campioni congelati devono essere miscelati dopo il decongelamento e prima di eseguire il test. Procedura Materiale fornito 5 Vetrini di F-Actina con 6 pozzetti 1 7ml di coniugato FITC IgG antiumano 1 0,8ml di controllo positivo IgG F-Actina 1 0,5ml di controllo negativo del sistema IFA 2 25 ml di concentrato PBS (40x) 1 7ml di mezzo di montaggio 1 Confezione di 10 coprivetrini Materiale aggiuntivo richiesto ma non fornito Micropipette per l erogazione di ìl di volume Acqua distillata o deionizzata Spruzzette o pipette Pasteur Camera umida Contenitore da 1l (per la diluizione del PBS) Vaschetta di Coplin Microscopio a fluorescenza con eccitatore a 495nm e filtro barriera da 515nm Metodo Prima di iniziare 1. Portare tutti i reagenti e i campioni a temperatura ambiente (20-26 o C). 2. Diluire il concentrato PBS: IMPORTANTE: diluire il concentrato PBS nella misura di 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone di concentrato PBS a 975 ml di acqua distillata o deionizzata e miscelare accuratamente. Il tampone PBS viene usato per diluire i campioni dei pazienti e come tampone di lavaggio. Il tampone diluito può essere conservato fino a 4 settimane a 2-8 C. 3. Diluire i campioni dei pazienti: a. Screening iniziale: Diluire i campioni dei pazienti nella misura di 1:40 con tampone PBS diluito (p.es., aggiungere 50ìl di siero fino a 1,95 ml di tampone PBS). 2
3 b. Titolazione: preparare diluizioni seriali doppie dalla diluizione di screening iniziale per tutti i campioni positivi con tampone PBS diluito (ossia 1:80, 1:160, 1: fino al punto finale). Procedura del dosaggio 1. Preparare i vetrini di substrato: lasciare che il vetrino di substrato raggiunga la temperatura ambiente prima di rimuoverlo dalla busta. Marcare il vetrino con una matita e collocarlo in una camera umida idonea. Aggiungere 1 goccia (20-25ìl) di controllo positivo e negativo non diluito rispettivamente ai pozzetti 1 e 2. Aggiungere 1 goccia (20-25ìl) di campione del paziente diluito ai pozzetti restanti. 2. Incubazione del vetrino: incubare il vetrino per 30 ± 5 minuti in una camera umida (la carta assorbente inumidita posta sul fondo di un contenitore chiuso in vetro o in plastica conserverà le condizioni di umidità idonee). Non consentire al substrato di seccare durante la procedura del dosaggio. 3. Lavare i vetrini: dopo l incubazione, utilizzare una spruzzetta in plastica per eliminare delicatamente il siero con il tampone PBS diluito. Orientare il vetrino e il flusso di tampone PBS in modo da ridurre al minimo il wash-over dei campioni tra i pozzetti. Evitare di dirigere il flusso direttamente sui pozzetti per evitare di danneggiare il substrato. Se lo si desidera, collocare i vetrini in una vaschetta di Coplin di tampone PBS diluito per massimo 5 minuti. 4. Aggiunta di coniugato fluorescente: Eliminare l eccesso di tampone PBS scuotendo. Collocare nuovamente il vetrino nella camera umida e coprirlo immediatamente con una goccia di coniugato fluorescente. Incubare i vetrini per altri 30 ± 5 minuti. 5. Lavare i vetrini: ripetere il punto Coprivetrini: le procedure da utilizzare con i coprivetrini variano da un laboratorio all altro; tuttavia, si raccomanda la seguente procedura: a. Collocare un coprivetrino su carta assorbente. b. Applicare il mezzo di montaggio in linea continua sul bordo inferiore del coprivetrino. c. Eliminare l'eccesso di tampone PBS scuotendo e toccare il bordo inferiore del vetrino con il bordo del coprivetrino. Abbassare delicatamente il vetrino sul coprivetrino in modo che il mezzo di montaggio fluisca sul bordo superiore del vetrino senza formazione o intrappolamento di bolle d aria. Controllo della qualità Il Controllo Positivo IgG F-Actina e il Controllo Negativo Sistemi IFA devono essere analizzati su tutti i vetrini per garantire che tutti i reagenti e tutte le procedure vengano eseguiti correttamente. Sieri di controllo aggiuntivi idonei possono essere preparati suddividendo in aliquote campioni di siero umano e conservandoli a < -70 o C. Affinché i risultati di test possano essere considerati validi, devono essere soddisfatti tutti i criteri seguenti. Se qualsiasi di questi non viene soddisfatto, i risultati del dosaggio devono essere considerati non validi e deve essere ripetuti. 1. Il controllo positivo IgG F-actina non diluito deve essere > Il controllo negativo del sistema IFA deve essere negativo. Interpretazione dei risultati Reazione negativa: un campione è considerato negativo se la colorazione specifica descritta di seguito nella sezione Reazione positiva è inferiore o uguale al Controllo Negativo Sistemi IFA. I campioni possono mostrare vari gradi di colorazione di fondo o specifica per altri componenti cellulari, ma devono essere negativi per gli anticorpi IgG anti- F-actina. Reazione positiva: Un campione viene considerato positivo se si osserva una colorazione specifica con un intensità superiore rispetto al controllo negativo del sistema IFA nelle fibre di F-actina che circondano la maggior parte delle cellule secondo un pattern esagonale e talvolta nelle fibre che attraversano le cellule. Determinare il grado o l'intensità di fluorescenza utilizzando questi criteri: 4+ Fluorescenza verde mela brillante 3+ Fluorescenza verde mela intensa 2+ Fluorescenza positiva chiaramente distinguibile 1+ Fluorescenza specifica minima che consente di differenziare chiaramente la colorazione della F-Actina dalla fluorescenza di fondo. Interpretazione del pattern: possono essere presenti una varietà di pattern di colorazione nucleare e/o citoplasmatica in base ai tipi e alle quantità corrispondenti di autoanticorpi presenti nel campione. Solo il pattern sopra descritto nella sezione Reazione positiva deve essere considerato positivo agli anticorpi IgG anti-f-actina. Tutti gli altri pattern devono essere considerati negativi. Limiti della procedura 1. Il pattern IgG anti-f-actina con titoli elevati è indicativo di AIH ma non può avere valore diagnostico. Il risultato dell IgG anti-f-actina deve essere considerato in associazione ad altri risultati di laboratorio nonché all anamnesi clinica generale del paziente. 2. La sensibilità del test è influenzata da una varietà di fattori esterni tra cui il tipo di microscopio a fluorescenza utilizzato, l intensità e l'età della lampadina, l'ingrandimento usato, il sistema di filtro e l'osservatore. 3
4 3. Se viene utilizzato un filtro passa banda invece di un filtro barriera da 515nm, è possibile che vengano osservati artefatti di colorazione aumentati. 4. Per contrassegnare i vetrini utilizzare solo la matita. L'uso di qualsiasi altro materiale di scrittura può causare artefatti di colorazione. 5. Tutte le vaschette di Coplin usate per il lavaggio dei vetrini devono essere ripulite da tutti i residui di colorante. L uso di vaschette di Coplin contenenti un residuo di coloranti può causare artefatti di colorazione. 6. Sono state stabilite prestazioni per il siero ma non per il plasma o altri tipi di campioni. Valori previsti La capacità del kit NOVA Lite IgG F-Actin di individuare gli anticorpi IgG F-actina è stata valutata mediante confronto con il test disponibile in commercio QUANTA Lite F-Actin IgG (INOVA Diagnostics, Inc). I risultati sono stati ritenuti positivi se il campione del paziente era pari o superiore a 20 unità e negativo se invece era inferiore a 20 unità. Intervallo di normalità Sono stati analizzati 493 campioni prelevati da donatori di sangue normali utilizzando il kit NOVA Lite IgG F-Actin. Tutti i 493 campioni normali tranne 4 (specificità del 99,2%) sono risultati negativi al test NOVA Lite IgG F-Actin. Confronto tra i test NOVA Lite IgG F-Actin IFA e QUANTA Lite F-Actin IgG Per determinare il valore percentuale di concordanza positiva e negativa dei dosaggi, sono stati esaminati 992 campioni contenenti anticorpi a una vasta gamma di antigeni utilizzando il kit NOVA Lite IgG F-Actin IFA kit e il test QUANTA Lite Actin IgG. Questi campioni comprendevano 493 donatori di sangue normali, 60 pazienti con malattie clinicamente definite (artrite reumatoide, LES e sclerodermia), 40 campioni con anticorpi definiti (malattie infettive e autoanticorpi) e 399 campioni prelevati da pazienti con sospetta malattia epatica. N=992 QUANTA Lite Actin IgG Positivo QUANTA Lite Actin IgG Negativo Totale NOVA Lite IgG F-Actin Positivo ** 290 NOVA Lite IgG F-Actin Negativo 69* Totale Accordo % positivo 269/338 (80%) Accordo % negativo 633/654 (97%) Accordo % complessivo 902/992 (91%) *39 dei 69 erano risultati debolmente positivi ** 14 dei 21 erano 1+ IFA (reattività ridotta) QUANTA Lite, NOVA Lite e INOVA Diagnostics sono marchi registrati Copyright 2011 Tutti i diritti riservati 4
5 Bibliografia 1. Chretien-Leprince P, Ballot E, Andre C, et al. Diagnostic value of anti-f-actin antibodies in a French multicenter study. Ann NY Acad Sci 1050: , Villalta D, Bizzaro N, Da Re M, et al. Diagnostic accuracy of four different immunological methods for the detection of anti-f-actin autoantibodies in type 1 autoimmune hepatitis and other liver related disorders. Autoimmunity 41: , Czaja A, Norman G: Autoantibodies in the diagnosis and management of liver disease. J Clin Gastroenterol 37: , Toh BH. Smooth muscle autoantibodies and autoantigens. Clin exp Immunol 38: , Fusconi M, Cassani F, Zauli D, et al. Anti-actin antibodies: a new test for an old problem. Journal of Immunological Methods 130: 1-8, Granito A, Muratori L, Muratori P, et al. Antibodies to filamentous actin (F-actin) in type 1 autoimmune hepatitis. J Clin Path 59: , Dighiero G, Lymberi P, Monot C. Sera with high levels of anti-smooth muscle and antimitochondrial antibodies frequently bind to cytoskeleton proteins. Clin exp Immunolol 82: 52-56, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. Fornitore: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Rappresentante Autorizzato: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: ITA August 2011 Revision 0 5
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