NOVA Lite ANCA (Ethanol) Kit with DAPI Per uso diagnostico In Vitro

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1 NOVA Lite ANCA (Ethanol) Kit with DAPI Per uso diagnostico In Vitro Codice prodotto: Complessità CLIA: elevata Uso previsto Il test NOVA Lite ANCA è un test per la determinazione semiquantitativa di anticorpi anti-citoplasma dei neutrofili (ANCA) nel siero umano. La presenza di anticorpi anti-citoplasma dei neutrofili può essere usata insieme ad altri test sierologici e risultati clinici nella valutazione di varie vasculiti sistemiche. Introduzione e descrizione del test Il test degli anticorpi anti-citoplasma dei neutrofili (ANCA) ha rivoluzionato la diagnosi e il trattamento delle varie vasculiti mediate autoimmuni. 1-4 Gli autoanticorpi perinucleari o panca e citoplasmatici o canca hanno dimostrato di essere utili nell'individuazione di malattie come la granulomatosi con poliangite (precedentemente nota come granulomatosi di Wegener 17 ) Ci sono almeno sei antigeni ANCA identificati e molti sono ancora da identificare. 1,5 La maggior parte di questi antigeni sembrano essere enzimi che risiedono nei granuli primari dei neutrofili. Tra questi enzimi figurano la mieloperossidasi (MPO), la serina proteasi 3 (PR3), l'elastasi, la lactoferrina, la catepsina G e la proteina cationica 57 (CAP-57). Sono stati sviluppati dei test ELISA per il rilevamento di molti dei più importanti anticorpi ai neutrofili tuttavia la maggior parte degli esperti nel campo delle vasculiti autoimmuni raccomandano di utilizzare il test di immunofluorescenza (IFA) per lo screening iniziale. Due pattern ANCA sono individuabili utilizzando la procedura IFA ANCA standard. Il pattern ANCA classico appare come fluorescenza granulare, citoplasmatica. Questo pattern, suggestivo di granulomatosi con poliangite e in misura minore di poliarterite microscopica, è stato definito canca. 6 È stato descritto un secondo pattern ANCA 7,8 che colora la regione perinucleare dei neutrofili fissati in alcol. Questo pattern è stato definito panca. Il pattern panca è stato associato a una vasculite più limitata da organi, in particolare, 9 glomerulonefrite con semilune o rapidamente progressiva. La correlazione tra canca e Granulomatosi con poliangite è stata ben stabilita. 3,10 La granulomatosi di Wegener è caratterizzata da un processo infiammatorio necrotizzante con formazione di granuloma e vasculite che interessa principalmente i tratti respiratori superiore e inferiore e i reni. Questa triade di interessamento clinico è considerata il segno distintivo della Granulomatosi con poliangite, canca è presente fino nel 96% dei pazienti affetti da Granulomatosi con poliangite con malattia generalizzata attiva, ma si riduce al 65% nella malattia limitata attiva ed è presente nel 30-40% dei pazienti in remissione. Il titolo di canca segue il corso della malattia con titoli decrescenti nella remissione di malattia e titoli in aumento 4,12 nella ricaduta di malattia. Contrariamente a canca e alla sua associazione con il carattere prevalentemente sistemico della Granulomatosi con poliangite, l'anticorpo panca è stato frequentemente associato a glomerulonefrite necrotizzante. L'anticorpo panca tipicamente non viene osservato nelle sindromi sistemiche. L'antigene bersaglio più comune associato a panca è la mieloperossidasi, ma è stata osservata anche reattività all'elastasi e alla lactoferrina. Quasi il 90% dei sieri panca positivi ottenuti da pazienti con glomerulonefrite sono reattivi alla mieloperossidasi; tuttavia, nei pazienti con malattie diverse dalla glomerulonefrite che presentano anche panca, solo una percentuale molto inferiore è reattiva alla mieloperossidasi. 11,13 Questo indica che più antigeni sono individuabili come colorazione perinucleare dei neutrofili fissati in etanolo tra cui sieri che contengono anticorpi antinucleari. Inoltre è possibile confermare i pattern perinucleari rilevati con i neutrofili fissati in etanolo come panca eseguendo l'ifa su neutrofili fissati in formalina. L'antigene bersaglio primario degli anticorpi panca, la mieloperossidasi, resta nel citoplasma delle cellule fissate in formalina mentre nelle cellule fissate in etanolo l'antigene migra al nucleo causano il pattern perinucleare. Principi della procedura Nella tecnica di immunofluorescenza indiretta, i campioni vengono incubati con il substrato antigenico e gli anticorpi privi di reazione vengono rimossi mediante lavaggio. Il substrato viene incubato con coniugato marcato alla fluoresceina specifico e quindi un reagente non legato viene lavato. All'osservazione con un microscopio a fluorescenza, i campioni positivi agli autoanticorpi mostreranno una fluorescenza verde mela corrispondente alle aree della cellula o dei nuclei a cui si è legato l autoanticorpo. Reagenti 1. ANCA (Etanolo), vetrini QR - 12 pozzetti/vetrino, con essiccante 2. Coniugato FITC IgG con DAPI, contenente 0,09% di azoturo di sodio 3. Controllo canca Positivo, 1 fiala di tampone contenente 0,09% di azoturo di sodio e anticorpi da siero umano agli antigeni canca, prediluito 4. Controllo panca Positivo, 1 fiala di tampone contenente 0,09% di azoturo di sodio e anticorpi da siero umano agli antigeni panca, prediluito 5. Controllo Negativo Sistemi IFA, 1 fiala di tampone contenente 0,09% di azoturo di sodio e nessun anticorpo da siero umano verso ANCA, prediluito 6. PBS II Concentrato (40x) 7. Mezzo di montaggio, contenente 0,09% di azoturo di sodio 8. Coprivetrini 1

2 Avvertenze 1. Tutto il materiale di origine umana utilizzato nella preparazione dei controlli per questo prodotto è stato testato ed è risultato negativo alla presenza di anticorpi al virus dell'immunodeficienza umana (HIV), dell antigene superficiale dell epatite B (HBsAg) e dell epatite C (HCV) in base a metodi approvati dall FDA. Nessun metodo di prova tuttavia può offrire l'assicurazione completa dell assenza del virus dell HIV, HCV o altri agenti infettivi. Pertanto, i controlli panca Positivo, canca Positivo e 14 Negativo Sistemi IFA devono essere trattati come materiali potenzialmente infettivi. 2. L azoturo di sodio viene usato come conservante. L azoturo di sodio è un veleno e può essere tossico se ingerito o assorbito attraverso la pelle o gli occhi. L azoturo di sodio può reagire con le tubature in piombo o rame e formare azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lavare i lavandini, se usati per lo smaltimento dei reagenti, con grandi volumi di acqua per evitare l accumulo di azide. 3. Utilizzare attrezzatura di protezione idonea quando si manipolano i reagenti forniti. 4. I reagenti rovesciati devono essere puliti immediatamente. Durante lo smaltimento delle scorie, rispettare tutti i regolamenti ambientali federali, statali e locali. Precauzioni 1. Questo prodotto è destinato a un uso diagnostico In Vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel sistema può causare risultati incoerenti. 3. Un lavaggio incompleto o inefficiente dei pozzetti IFA può causare un elevato rumore. 4. L adattamento di questo dosaggio all uso con unità di sviluppo automatiche dei campioni e altri dispositivi per la manipolazione dei liquidi, anche parziale, può produrre differenze nei risultati del test rispetto a quelli ottenuti utilizzando la procedura manuale. È responsabilità di ogni laboratorio verificare che la procedura automatica dia risultati dei test entro limiti accettabili. 5. Le prestazioni del dosaggio sono influenzate da molti fattori. Tra questi figurano la temperatura iniziale dei reagenti, l intensità della lampadina del microscopio usato, la precisione e la riproducibilità della tecnica di pipettamento, l accuratezza del lavaggio e la lunghezza dei periodi di incubazione durante il test. Per ottenere risultati accurati e riproducibili è necessario prestare grande attenzione alla coerenza. 6. Nel tempo, il coniugato può cambiare di colore a causa dell'esposizione alla luce. Tuttavia, il cambio di colore non altera le prestazioni del dosaggio. 7. Si raccomanda un rigido rispetto del protocollo. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta apposta sulla confezione se conservati e maneggiati in accordo alle istruzioni. 2. Una volta volta che i vetrini sono stati rimossi dall'involucro in alluminio, devono essere utilizzati immediatamente. 3. Il tampone PBS diluito è stabile per 4 settimane a 2-8 C.. 4. Il coniugato del kit deve essere tenuto lontano dalla luce del sole, dalla luce fluorescente e dai raggi UV, quando possibile. Prelievo del campione Questa procedura deve essere eseguita con un campione di siero. L aggiunta di azide o altri conservanti ai campioni del test può influenzare negativamente i risultati. I campioni microbicamente contaminati, sottoposti a trattamento termico o contenenti particolato visibile non devono essere usati. Evitare campioni o sieri lipemici o fortemente emolizzati. Dopo il prelievo, separare il siero dal coagulo. Il CLSI (in passato NCCLS) Document H18-A4 raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) conservare i campioni a temperatura ambiente per un massimo di 8 ore; 2) se il test non verrà completato entro 8 ore, refrigerare il campione a 2-8 C; 3) se il test non verrà completato entro 48 ore, oppure per la spedizione del campione, congelare a -20 C o a una temperatura inferiore. I campioni congelati devono essere miscelati dopo il decongelamento e prima di eseguire il test. Evitare il congelamento e lo congelamento ripetuti. Procedura Materiale fornito ANCA (Etanolo), vetrini QR - 12 pozzetti 1 15 ml di coniugato FITC IgG con DAPI 1 0,5 ml di controllo canca Positivo 1 0,5 ml di controllo panca Positivo 1 0,5ml di Controllo Negativo Sistemi IFA 2 25 ml di PBS II Concentrato (40x) 1 7 ml di Mezzo di montaggio 1 20 Coprivetrini 1 Inserto per istruzioni 2

3 Materiale aggiuntivo richiesto ma non fornito 1. Acqua distillata 2. Contenitore da 1l (per la diluizione del PBS) 3. Micropipette e puntali monouso 4. Camera umida 5. Spruzzette o Pipette pipette Pasteur 6. Vaschetta di Coplin 7. Microscopio a fluorescenza Metodo Prima di iniziare 1. Portare tutti i reagenti e i campioni a temperatura ambiente (20-26 C) e miscelare bene. 2. Diluire il PBS Concentrato:IMPORTANTE: diluire il concentrato PBS concentrato nella misura di 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone di concentrato PBS concentrato a 975 ml di acqua distillata o deionizzata e miscelare accuratamente. Il tampone PBS viene usato per diluire i campioni dei pazienti e come tampone di lavaggio. Il tampone diluito può essere conservato fino a 4 settimane a 2-8 C. 3. Diluire i campioni dei pazienti: a. Screening iniziale: Diluire i campioni dei pazienti nella misura di 01:20:00 con tampone PBS diluito (p.es., aggiungere 50μl di siero fino a 950μl di tampone PBS). b. Titolazione: preparare diluizioni seriali doppie dalla diluizione di screening iniziale per tutti i campioni positivi con tampone PBS diluito (ossia 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, ecc). Per esempio, Prendere 100μl della diluizione 1:20, miscelare con 100μl di PBS per ottenere una diluizione 1:40. Ripetere per ottenere ulteriori diluzioni. Procedura del dosaggio 1. Preparare i vetrini di substrato: lasciare che il vetrino di substrato raggiunga la temperatura ambiente prima di rimuoverlo dalla busta. Marcare il vetrino con una matita e collocarlo in una camera umida idonea. Aggiungere 1 goccia (20-25μl) di controllo positivo e negativo non diluito rispettivamente ai pozzetti 1 e 2. Aggiungere 1 goccia (20-25μl) di campione del paziente diluito ai pozzetti restanti. 2. Incubazione del vetrino: incubare il vetrino per 30 ± 5 minuti in una camera umida (la carta assorbente inumidita posta sul fondo di un contenitore chiuso in vetro o in plastica conserverà le condizioni di umidità idonee). Non consentire al substrato di seccare durante la procedura di dosaggio 3. Lavare i vetrini: dopo l incubazione, utilizzare una spruzzetta in plastica per eliminare delicatamente il siero con il tampone PBS diluito. Orientare il vetrino e il flusso di tampone PBS in modo da ridurre al minimo il wash-over dei campioni tra i pozzetti. Evitare di dirigere il flusso direttamente sui pozzetti per evitare di danneggiare il substrato. Se lo si desidera, collocare i vetrini in una vaschetta di Coplin di tampone PBS diluito per massimo 5 minuti. 4. Aggiunta di coniugato fluorescente: Picchiettare per rimuovere l eccesso di tampone PBS. Collocare nuovamente il vetrino nella camera umida e coprirlo immediatamente con una goccia di coniugato fluorescente. Incubare i vetrini per altri minuti al buio. 5. Lavare i vetrini: ripetere il punto Coprivetrino: le procedure da utilizzare con i coprivetrini variano da un laboratorio all altro; tuttavia, si raccomanda la seguente procedura: a. Collocare un coprivetrino su carta assorbente. b. Applicare il mezzo di montaggio in linea continua sul bordo inferiore del coprivetrino. c. Picchiettare per rimuovere l'eccesso di tampone PBS e toccare il bordo inferiore del vetrino con il bordo del coprivetrino. Abbassare delicatamente il vetrino sul coprivetrino in modo che il mezzo di montaggio fluisca sul bordo superiore del vetrino senza formazione o intrappolamento di bolle d aria. 7. Osservare i vetrini al microscopio a fluorescenza: I vetrini finiti devono essere conservati a 2-8 C e osservati il più presto possibile. Controllo della qualità Un controllo positivo (canca Positivo o panca Positivo) e il Controllo Negativo Sistemi IFA devono essere eseguiti su ogni vetrino per garantire che tutti i reagenti e tutte le procedure vengano eseguite correttamente. Sieri di controllo aggiuntivi idonei possono essere preparati suddividendo in aliquote campioni di siero umano e conservandoli a < -70 C. Affinché i risultati di test possano essere considerati validi, devono essere soddisfatti tutti i criteri seguenti. Se uno qualsiasi di questi non viene soddisfatto, il dosaggio deve essere considerato non valido e deve essere ripetuto. 1. Il controllo canca Positivo non diluito deve essere > Il controllo panca Positivo non diluito deve essere > Il Controllo controllo Negativo negativo Sistemi del sistema IFA deve essere negativo. Se i controlli non appaiono come descritto, il test non è valido e deve essere ripetuto. 3

4 Interpretazione dei risultati Reattività negativa. Un campione viene considerato negativo se una colorazione nucleare e citoplasmatica specifica è uguale o inferiore al Controllo Negativo Sistemi IFA. I campioni possono mostrare vari gradi di colorazione di sfondo dovuta agli anticorpi eterofili o ad autoanticorpi di basso livello ai costituenti citoplasmatici come le proteine contrattili. Reattività positiva. Un campione è considerato positivo se la colorazione nucleare e/o citoplasmatica specifica descritta di seguito è maggiore del controllo negativo e l'intensità della colorazione è pari a 1+ o superiore. Determinare il grado o l'intensità di fluorescenza utilizzando questi criteri: 4+ Fluorescenza verde mela brillante 3+ Fluorescenza verde mela intensa 2+ Fluorescenza positiva chiaramente distinguibile 1+ Fluorescenza specifica minima che consente di differenziare chiaramente la colorazione nucleare e/o citoplasmatica dalla fluorescenza di fondo. Interpretazione del pattern. Possono essere presenti una varietà di pattern di colorazione nucleare e citoplasmatica in base ai tipi e alle quantità corrispondenti di autoanticorpi presenti nel campione. È possibile osservare i seguenti tipi di pattern di colorazione: canca o colorazione citoplasmatica: Questo pattern in generale presenta una fluorescenza citoplasmatica con punteggiatura grossolana, spesso con fluorescenza accentuata nei lobi nucleari o attorno a questi. Questo pattern di solito è prodotto dagli anticorpi che reagiscono con l'enzima granulare primario Serina Proteasi 3 (PR3). Colorazione panca o perinucleare: In generale questo pattern compare come colorazione omogenea dei lobi nucleari, spesso con un'accentuazione perinucleare, prodotta dagli anticorpi che reagiscono con l'enzima granulare primario migrato mieloperossidasi (MPO). Dato che alcuni anticorpi antinucleari (ANA) possono reagire anche con i nuclei dei neutrofili umani fissati in etanolo, si raccomanda di sottoporre questi campioni anche all'analisi degli ANA. Inoltre, questi campioni possono essere sottoposti ad analisi sui neutrofili umani fissati in formalina anziché in etanolo. La formalina, un fissativo di cross-linking, distrugge la maggior parte degli antigeni nucleari e sposta il pattern di colorazione da perinucleare a citoplasmatico se il campione contiene mieloperossidasi. I vetrini fissati in formalina a questo scopo sono disponibili separatamente. Limiti della procedura 1. I campioni inattivati con il calore, emolizzati, microbicamente contaminati o defibrinati in modo completo possono causare una forte colorazione di sfondo e rendere difficile l'interpretazione. Ottenere un campione fresco e ripetere il test. L'aggiunta del 2% di albumina e siero bovino al tampone PBS usato per diluire i campioni può ridurre la colorazione di sfondo dei campioni problematici. 2. I campioni ANA positivi possono reagire con i neutrofili fissati in etanolo. I campioni nucleari positivi devono essere sottoposti ad analisi per gli ANA e/o testati su vetrini con substrato di neutrofili fissato in formalina. 3. Dato che è noto che i neutrofili fissati in etanolo contengono più antigeni di granuli primari come elastasi, lactoferrina, catepsina G, proteina cationica 57 e forse altri antigeni dei neutrofili non ancora identificati, è possibile che i campioni che appaiono panca o canca positivi non risultino sempre positivi agli anticorpi specifici di mieloperossidasi (MPO) o serina proteasi 3 (PR3). 4. Oltre agli ANA, vi sono determinati altri autoanticorpi che possono reagire con i neutrofili umani fissati in etanolo. Questi anticorpi includono quelli anti muscolo liscio (actina) e determinati alloanticorpi come Mart o NB1. 15 L'actina o gli anticorpi anti muscolo liscio reagiscono con il citoplasma dei neutrofili ma producono un pattern di colorazione omogeneo invece del tipico pattern c-anca con colorazione grossolana. Anche gli alloanticorpi appaiono come un pattern citoplasmatico, ma con una punteggiatura molto più fine rispetto agli anticorpi canca e solo una percentuale ridotta di cellule (tipicamente il 40%) o meno produce fluorescenza. 5. Occasionalmente possono essere osservati campioni con più di un autoanticorpo. Per esempio canca e panca o ANCA più ANA. 6. I risultati IFA positivi devono essere confermati mediante i test immunoenzimatici (EIA) mieloperossidasi (MPO) e proteinase 3 (PR3) 7. Alcuni pazienti con malattia intestinale infiammatoria o colite ulcerosa presentano anticorpi reattivi ai neutrofili. 16 Questi campioni appaiono come un pattern di tipo panca sul substrato di neutrofili fissato in etanolo con una colorazione perinucleare molto accentuata. Tipicamente questi campioni sembrano negativi o presentano una fluorescenza citoplasmatica omogenea debole sui vetrini con substrato di neutrofili fissato in formalina. 8. Un uso improprio dei vetrini durante la procedura di colorazione, in particolare il fatto di permettere ai vetrini di asciugarsi tra le fasi, può causare un pattern "slavato" e un elevato livello di colorazione di sfondo. 9. L'uso di reagenti ottenuti da altri tipi di kit di anticorpi fluorescenti (in particolare coniugato) può influenzare negativamente la sensibilità e la specificità dei vetrini con substrato di neutrofili fissato in etanolo. 10. La sensibilità del test è influenzata da una varietà di fattori esterni tra cui il tipo di microscopio a fluorescenza utilizzato, l intensità e l'età della lampadina, l'ingrandimento usato, il sistema di filtro e l'osservatore. 4

5 11. La fonte luminosa, i filtri e le ottiche di microscopi di fluorescenza diversi influenzano la sensibilità del kit. Le prestazioni del microscopio vengono influenzate in modo significativo da una corretta manutenzione specialmente se si centra la lampada al vapore e si cambia la lampada dopo il periodo di tempo raccomandato. 12. Per contrassegnare i vetrini utilizzare solo la matita. L'uso di qualsiasi altro materiale di scrittura può causare artefatti di colorazione. 13. Tutte le vaschette di Coplin usate per il lavaggio dei vetrini devono essere ripulite da tutti i residui di colorante. L uso di vaschette di Coplin contenenti un residuo di coloranti può causare artefatti di colorazione. 14. Questo test da solo non deve essere considerato diagnostico. Occorre tenere in considerazione tutti gli altri fattori tra cui l'anamnesi clinica del paziente e altri risultati sierologici o di biopsie. 15. Non sono stabilite prestazioni per matrici diverse dal siero. Valori previsti Sono stati testati su vetrini ANCA NOVA Lite centoquindici campioni normali di donatori causali. Questi campioni erano stati presentati come esami fisici pre-assunzione o dei collaboratori e come tali difficilmente includevano soggetti anziani o in età pediatrica. I campioni erano un misto casuale di uomini e donne. Tutti e 115 i campioni erano negativi alla diluizione di screening 1:20. Inoltre, sono stati testati 45 pazienti affetti da glomerulonefrite di Wegener, 39 da poliarterite microscopica e 20 da glomerulonefrite a semilune nonché pazienti con una vasta gamma di malattie del tessuto connettivo. I risultati sono riepilogati nella tabella seguente: Gruppo di pazienti N di pazienti % Positivi Donatori normali casuali Granulomatosi di Wegener (tutti canca) Poliarterite microscopica (tutti panca) Glomerulonefrite a semilune (tutti panca) LES 27 7 (sia panca sia canca) Sindrome di Sjögrens 21 0 Sclerodermia 15 0 Polimiosite 6 0 I vetrini NOVA Lite ANCA sono stati messi confrontati con preparazioni di neutrofili centrifugate utilizzate di routine in un centro di riferimento ANCA con sede in Università. Sono stati testati cinque sieri positivi (23 canca, 28 panca, 4 atipici) e 14 campioni ANCA negativi. Dei 55 campioni positivi, 54 hanno prodotto un modello di colorazione identico sui vetrini ANCA NOVA Lite. Uno dei campioni canca con titolo basso ha prodotto un risultato negativo sul vetrino INOVA. Tutti e 14 i campioni ANCA negativi sono risultati negativi anche sui vetrini ANCA NOVA Lite. Le titolazioni dei 55 campioni positivi su entrambi i substrati hanno prodotto lo stesso risultato oppure una differenza dimezzando la concentrazione una volta con 53 dei campioni testati. Gli altri 2 campioni differivano dimezzando la concentrazione due volte. Quarantotto campioni di siero ottenuti da donatori casuali sono stati inviati a un importante laboratorio di riferimento degli USA per il test ANA e sono stati testati simultaneamente per gli ANCA con vetrini ANCA NOVA Lite e per gli anticorpi specifici MPO e PR-3 con kit ELISA INOVA QUANTA Lite. I risultati sono riepilogati nella tabella seguente. Risultato IFA N. di campioni % ELISA Positivi MPO PR3 negativo panca canca c e panca Atipica Otto campioni erano ANCA negativi al test di immunofluorescenza. Tutti e otto i campioni erano negativi per MPO e PR-3 con il test ELISA. I risultati per MPO e PR-3 variavano da 1-5 unità, ben al di sotto della soglia di positività di 20 unità. Tredici campioni sono stati valutati come panca positivi con il test IFA. Undici di questi erano MPO positivi e nessuno era PR-3 positivo. Ventuno campioni erano canca positivi al test di immunofluorescenza. Nessuno di questi campioni era MPO positivo, mentre 20 dei 21 campioni erano PR-3 positivi. Cinque campioni sembrano avere modelli di tipo sia panca sia canca mediante test IFA. Quattro di questi erano MPO positivi e nessuno era PR3 positivo. Un campione è stato classificato come un panca atipico. Questo campione panca atipico era negativo con entrambi i kit MPO e PR3. 5

6 Accorto tra i risultati ANCA - ELISA vs. IFA Mentre MPO e PR3 sono i principali antigeni che comprendono quelli che possono essere identificati come p e c ANCA, l'utente dovrebbe ricordare che gli anticorpi a numerosi altri enzimi nei granuli primari dei neutrofili possono produrre modelli c e p ANCA al test di immunofluorescenza su neutrofili fissati in etanolo. Questo è particolarmente vero nel caso degli anticorpi panca in cui almeno altri 3 autoanticorpi agli antigeni diversi da MPO possono produrre un modello IFA di tipo panca. Per illustrare quanto appena affermato, sono stati raggruppati campioni tratti dai suddetti gruppi con glomerulonefrite di Wegener, poliarterite microscopica e glomerulonefrite a semilune insieme ai 48 campioni inviati per il test sierologico di routine per la vasculite. Di seguito vengono riportati i risultati al test di immunofluorescenza dei neutrofili umani fissati in etanolo ed ELISA. QUANTA Lite PR-3 IgG Sensibilità relativa 90,9% canca IFA Specificità relativa 98,8% Accordo 95,4% QUANTA Lite MPO IgG Sensibilità relativa 61,0% panca IFA Specificità relativa 100% Accordo 80,3% Dei 66 campioni IFA canca positivi, 6 erano negativi per PR3 e 1 campione era positivo al dosaggio ELISA ma positivo al test IFA. Dei 77 campioni IFA panca positivi, 30 erano negativi al test ELISA specifico per MPO. Non sono stati individuati campioni IFA panca negativi mediante test ELISA per MOP. 6

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