Dal campione al risultato: valutazione delle performance analitiche di Helios System nella determinazione di ANA e ANCA
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1 Dal campione al risultato: valutazione delle performance analitiche di Helios System nella determinazione di ANA e ANCA Nicoletta Gallo UOC Medicina di Laboratorio Azienda Ospedaliera di Padova
2 Ricerca di ANA quale metodo? ACR ANA Task Force Reccomendations (Meroni & Schur. Ann Rheum Dis 2010;69: ) The Task force has reviewed the relevant literature published to date and has concluded that solid phase immunoassays may not be appropriate at present for replacing IFA as a screening test for the detection of ANA Il metodo IFA su cellule Hep2 è il gold standard per la ricerca di ANA data la maggiore sensibilità vs i test in fase solida
3 Metodi di riferimento per la determinazione degli ANA Metodo di riferimento: immunofluorescenza indiretta Substrato consigliato: Cellule Hep-2 (ATCC-CCL-23) che consentono di evidenziare: titolo di positività tipo di pattern fluoroscopico Titolo di screening consigliato: 1:80 Lettura consigliata: a 400x
4 Cellule Hep-2: vantaggi Substrato più sensibile: identificazione di molti pattern Origine umana: miglior specificità rispetto ai tessuti animali Nuclei più grandi: si possono osservare anche dettagli nucleari complessi Il monostrato cellulare assicura la visualizzazione di tutte le strutture cellulari, nucleari e citoplasmatiche Elevato indice mitotico: gli antigeni associati alla divisione cellulare sono facilmente rilevabili (es. centromero, fuso mitotico) Le cellule non sono racchiuse in una matrice intercellulare: ridotta autofluorescenza La distribuzione degli antigeni è uniforme ini
5 ANA QUADRI FLUOROSCOPICI E PATOLOGIE ASSOCIATE QUADRI FLUOROSCOPICI PATOLOGIA ANTIGENI ASSOCIATI OMOGENEO LES dsdna/istoni FINEMENTE PUNTEGGIATO S SIOGREN, SSP SSA, SSB GRANULARE MCTD Sm, U1-RNP QUADRI NUCLEARI CLASSICI CENTROMERICO CREST, SCLERODERMIA LIMITATA, RAYNAUD CENP-B NUCLEOLARE SS, SSP FIBRILLARINA, T0/Th, RNA polimerasi I GRANULIA DIFFUSA SCLERODERMIA DIFFUSA SCL-70 QUADRI NUCLEARI RARI QUADRI CITOPLASMATICI MULTIPLE NUCLEAR DOTS CBP Sp 100 FEW NUCLEAR DOTS S SJOGREN P 80 COILINA LAMINA NUCLEARE CBP, LES LAMININA A,B,C PCNA LES CICLINA RIBOSOMIALE LES PROTEINA P RIBOSOMIALE PUNTEGGIATO FINE POLIMIOSITE JO-1, PL7, PL12 MITOCONDRIALE CBP AMA-M2 CITOSCHELETRO-ACTINA EPATITE AUTOIMMUNE F-ACTINA CITOSCHELETRO- VIMENTINA ARTRITE REUMATOIDE VIMENTINA
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7 ANA in soggetti sani e in pazienti con LES: prevalenza Healthy SLE Arthritis Rheum 1997;40:1601
8 QUANDO ESEGUIRE IL TEST ANA? Non sorprende che il test ANA, come test di screening, non abbia un forte PPV ed è spesso considerato un test overutilizzato. Senza un forte razionale clinico il PPV è molto debole! Lo stesso dicasi per gli ANCA (Savige et al Am J Clin Pathol '99). Scoraggiare il test anche in casi limitati solo con forte sospetto clinico è pericoloso per il rischio di perdere alcuni pazienti potenziali (soprattutto per i non reumatologi). ANA può essere rilevato anche anni prima che la malattia conclamata (Arbuckle et al NEJM 03) Dato il costo di un singolo test ANA e l'eventuale costo diretto/indiretto di una mancata o ritardata diagnosi di una malattia autoimmune ANA-associata il rapporto costi/ benefici è a favore del test. ANA 78% Anti Ro/SSA 47% Anti La/SSB 34% Anti fosfolipidi 18% Anti ds/dna 55% Anti Sm 32% Anti RNP 26% 115/130 pz con LES (88%) presentano almeno un autoanticorpo nel siero prima della diagnosi (in media 3,3 anni prima!) Arbuckle MR, et al, N.Engl J Med 2003
9 ANA HEp-2 IFI: non tutto oro. Ma anche zone d ombra: Variabilità dell analisi (isotipo del coniugato, microscopio, diluizione dei campioni, corretta preparazione dei vetrini) Soggettività interpretativa Automazione solo parziale Mancanza del consenso nella nomenclatura dei pattern Difficoltà di confronto inter-laboratorio
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11 IFA DIGITALE Standardizzazione dell interpretazione dei vetrini ANA Hep-2 in IIF per migliorare l affidabilità e la comparabilità dei risultati Software d immagine digitale per la lettura, la caratterizzazione e l archiviazione Inserimento in una piattaforma totalmente automatizzata per ridurre il tempo dell esecuzione manuale
12 ANA Hep-2 IFA: standardizzazione meta raggiungibile Armonizzazione computerizzata della classificazione dei pattern Hep-2 & creazione di un nomenclatore supportato da immagini digitali catalogate (Wiik AS et al. J Autoimmun 2010) Possibile l analisi della variabilità intra- ed inter osservatore Introduzione dell automazione della lettura al microscopio dei vetrini Hep-2 (Aklides, EUROPattern, Helios, Image Navigator, NOVAView, Zenit G-Sight) Possibile l analisi oggettiva
13 Valutare le prestazioni analitiche e il livello di accuratezza di Helios system (Aesku Diagnostics, Wendelsheim, Germania) nella preparazione, lettura (acquisizione delle immagini) ed elaborazione degli anticorpi antinucleo (ANA) e degli anticorpi anti citoplasma dei neutrofili (ANCA).
14 HELIOS System (Aesku Diagnostics, Wendelsheim, Germania) IFA PROCESSING: esegue tutte le fasi del processo automaticamente SLIDE AND SAMPLE BARCODE READER: garantisce la tracciabilità del campione e del vetrino per tutto il processo BUILT-IN LED MICROSCOPE + IMAGE CAPTURE. Fotocamera esegue un autofocus high tech e le immagini sono salvate e archiviate automaticamente
15 724 sieri non selezionati Processazione manuale Processazione su piattaforma Helios Preparazione vetrini (cellule Hep-2, Inova Dianostics, USA) Lettura con microscopio da parte di due operatori Refertazione su Lis Preparazione Vetrini (Hep-2 Aesku, Germany) Acquisizione immagini Refertazione
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20 RISULTATI 1: ANA IIF HELIOS Neg Pos Failed Neg Basso titolo Pos % ANA PPV 98% NPV con agreement totale del 94%.
21 Risultati discrepanti potrebbero dipendere da: differenze del substrato e del coniugato utilizzato con le due metodiche; differenze nel cut-off setting (Helios mostra però flessibilità nelle impostazioni di cut off, permettendo di dare preferenza alla sensibilità o alla specificità) Valutazione dei campioni a basso titolo (aspetto raramente preso in considerazione)
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24 Il titolo ANCA CORRELA con l attività di malattia In base ai diversi pattern ottenuti in immunofluorescenza possono essere distinti in c-anca marker specifico di Granulomatosi di Wegener p-anca riscontrati in alta percentuale in vasculiti sistemiche con glomerulonefrite idiopatica progresssiva (85-95%) si trovano anche nella poliarterite nodosa, snd di Churg Strauss, AR associata a vasculiti p-anca atipici sono presenti soprattutto nelle MICI con una prevalenza variabile da 5-20% per il morbo di Crhon e dal 40-70% nella rettocolite ulcerosa Esistono positività ANCA in alcune malattie non propriamente vasculitiche: malattie infettive (HIV, amebiasi, tubercolosi, epatiti, endocarditi), neoplasie (linfomi, mielodisplasie, ca colon e polmonari), silicosi, snd di Goodpasture, epatiti autoimmuni e CSP
25 RISULTATI 2: ANCA IIF HELIOS NEG POS NEG POS TOT Sensibilità 90,3%, Specificità 81% European Vasculitis Group Recommendations (Villa Forte A., et al European League Against Rheumatism/European Vasculitis Study Group Recommendations for the management of vasculitis. Curr Opin rheumatol Jan;22(1):49-53)
26 RISULTATI 3: ANCA HELIOS POS NEG PR MPO Sensibilità 69,5%, Specificità 82,6% European Vasculitis Group Recommendations (Villa Forte A., et al European League Against Rheumatism/European Vasculitis Study Group Recommendations for the management of vasculitis. Curr Opin rheumatol Jan;22(1):49-53)
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32 OSSERVAZIONI CONCLUSIVE Helios è un processore automatico che include un sistema ottico integrato per la lettura delle immagini, soprattutto dedicato alla discriminazione positivo / negativo. I risultati possono essere registrati, memorizzati e trasmessi al sistema informativo di laboratorio. La piattaforma Helios può ridurre la variabilità intra e interlaboratorio, migliorare efficienza di laboratorio e sostenere la standardizzazione soprattutto nei laboratori caratterizzati da elevati flussi di lavoro.
33 L'obiettivo primario della Medicina di Laboratorio è quello di fornire informazioni utili alla formulazione della corretta decisione clinica, al fine di contribuire significativamente alla qualità dell assistenza sanitaria. Tale obiettivo non può essere raggiunto che tramite la produzione da parte del laboratorio clinico di risultati attendibili dal punto di vista analitico e confrontabili indipendentemente dal laboratorio e/o dal metodo utilizzato per produrli. Infatti, un inadeguata prestazione da parte del laboratorio può causare un errata interpretazione e decisione da parte del clinico, con gravi conseguenze per la pratica della medicina, per la tutela della salute e, in definitiva, per il paziente stesso. In altre parole, come recentemente ricordato, la standardizzazione dei risultati degli esami di laboratorio racchiude in sé una dimensione etica di grande importanza
34 IL CONCERTO «quel vorticare di strumenti e di volti e di suoni che si trasfigurano nella passione di creare, tutti insieme, quella che il protagonista chiama "l'armonia suprema", è un'esperienza di profondo incanto, come capita di rado»
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