DIAGNOSTICA DI LABORATORIO 2

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Elvira Boscolo
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1 DIAGNOSTICA DI LABORATORIO 2

2 Gli autoanticorpi più comunemente ricercati nelle malattie autoimmuni sistemiche Fattore reumatoide Anticorpi anti-fosfolipidi ANA (anticorpi anti-nucleo) Anticorpi anti-dna Anticorpi anti-ena ANCA

3 Gli autoanticorpi: significato clinico Valore diagnostico: anticorpi marker Valore prognostico: correlazione fra anticorpi di determinate specificità e danno d organo o attività di malattia

4 Il ruolo del laboratorio nella diagnostica delle connettiviti sistemiche Metodiche: immunofluorescenza immunoelettroforesi ELISA immunoblot Fonte di antigeni: tessuti estratti tissutali proteine purificate proteine ricombinanti

6 Anticorpi anti-nucleo Determinati mediante immunofluorescenza indiretta su fegato di ratto o su linee cellulari umane (Hep2). Il diverso pattern di fluorescenza si correla con la specificità degli anticorpi. Diffuso: anti-complesso DNA-istoni Periferico: anti-dna Speckled: anti-snrnp o anti-ssa o anti-ssb Nucleolare: anti-rna nucleolare Centromerico: anti-centromero.

7 Determinazione di ANA Substrato: linee cellulari es HEp2 (linea( epiteliale da carcinoma laringeo umano) Le linee cellulari contengono più cromatina contengono antigeni espressi in tutte le fasi del ciclo cellulare consentono di determinare anticorpi specie-specifici specifici

8 Anticorpi anti-nucleo La determinazione dei pattern di fluorescenza non è nè sensibile nè specifica. Spesso si modifica con la diluizione del siero per la presenza simultanea di anticorpi di diversa specificità. Necessarie altre tecniche per determinare la natura dell antigene riconosciuto.

9 Utili per la diagnosi Anticorpi anti-nucleo Talvolta utili per la diagnosi Malattia % Positività Malattia % Positività LES SS SSc PM/DM Utili per il monitoraggio o per la prognosi Parte integrante per la diagnosi Malattia % Positività Malattia % Positività RA giovanile (uveite) LES da farmaci 100 Fen. Raynaud Epatite Autoimm. 100 MCTD 100 Non utili per la prognosi Non utili per la diagnosi Malattia % Positività Malattia % Positività RA Imp. Silicone MS 25 Fibromialgia ITP Parenti di paz. autoimmuni 5-25 M. Tiroide M.Infettive varia DLE 5-25 Neoplasie varia

10 ANA in malattie non autoimmuni Malattie infettive (ascessi cronici, TBC, endocardite batterica subacuta, malaria, EBV) In corso di neoplasie In corso di terapie con farmaci noti per indurre questo tipo di autoanticorpi e non sempre associati con manifestazioni cliniche (procainamide, idralazina, isoniazide, cloropromazina, beta bloccanti etc) Parenti (apparentemente sani) di pazienti con malattie autoimmuni sistemiche

11 ANA positive healthy subjects 1:40 32% 1:160 5% (Tan et al, Arthritis Rheum, 1997) 1:40 27% (34% women, 18% men) 1:160 8% (13%women, 3% men) SPECIFICITY 1: : SENSITIVITY 92 (Hayashi et al, Clin Chem,, 2001)

12 Specificity of anti-dna antibodies in lupus Denatured DNA Native and denatured DNA Native Base sequences Z-DNA

13 Antigenic determinants in DNA Purines and pyrimidines Nucleosides Sugar-phosphate backbone

14 Structure of anti-dna antibodies Minority: encoded by unmutated germ line genes Majority: mutated in third hypervariable region high replacement/silent mutations increase in arginine and asparagine

15 Specificity of anti-dna antibodies Polyspecific in the binding of: Nucleic acids Cardiolipin and phospholipids Proteins

16 Comparison of assays that detect anti-ndna antibodies assay high affinity low affinity specificity sensitivity anti-dna anti-dna Farr assay + - high high ELISA + + low high Crythidia Luciliae + + high low Sensitivity Specificity CLIF ELISA 70 84

17 Determinazione degli ENA Controimmunoelettroforesi (estratti antigenici: timo o milza o rene) ELISA (proteine( purificate e/o proteine ricombinanti) immunoblot (estratti antigenici) dot blot (proteine( purificate e/o proteine ricombinanti)

18 Determinazione degli ENA CIE: molto specifico, poco sensibile,, non automatizzabile,, non quantitativo, risultati in 3 giorni. ELISA: molto sensibile, risultati in poche ore, automatizzabile, quantitativo, specificità variabile. Western blot: sensibile, di difficile interpretazione. Dot blot: caratteristiche simili ad ELISA Le specificità comunemente determinate sono 6: anti-ssa; anti-ssb; anti-sm Sm; ; anti-rnp; anti-scl 70; anti-jo1.

19 Anticorpi anti-ena Anti-Sm: marker di LES; la sensibilitˆ clinica varia dal 15 al 30%. Anti-U 1 RNP: Presenti nel 30-40% dei pazienti con LES; ad alto titolo costituiscono criterio diagnostico irrinunciabile per la diagnosi di MCTD. Anti-SSA/Ro: Nei pazienti con SS sono presenti fino al 60% se testati con immunodiffusione e fino al 90% se testati con ELISA; si associano più frequentemente a interessamento extraghiandolare. Possono inoltre essere presenti in circa il 30% dei pazienti con LES. Alti titoli sono un fattore di rischio per lupus neonatale.

20 Anticorpi anti-ena Anti-SSB/La:Sia nei pazienti con SS che in quelli con LES sono presenti con frequenza inferiore rispetto agli anticorpi anti SSA/Ro. Si associano a lupus neonatale. Anti-centromero: associati a SSc limitata. Anti-Topoisomerasi I (Scl70): associati a SSc diffusa. Anti-Jo-1: specifici per PM/DM. Associati ad interstiziopatia polmonare e artrite.

21 Anticorpi anti-ena: specificità rare Anti-PM-Scl, si associa a miopatia. Anti-U3-RNP (fibrillarina), presente nel 4-8% dei pazienti con SSc. Anti-RNA polimerasi I, più frequente nelle forme progressive di SSc. Anti-polimerasi III, comune nella SSc. Anti-PCNA, si associa a LES in fase attiva.

23 A) 3D Rekonstruktion von U1 snrnp bei 1 nm Auflösung. B) U1 snrnp (semitransparent) mit Interpretation des molekularen Aufbaus. Das erhaltene Strukturmodell zeigt die Lage der einzelnen Proteine (A, 70K, C und Sm Heptamer-Ring) und der RNA (dunkelblau, rot und orange) von U1 snrnp.

24 Anti-ribosomal antibodies Directed against the ribosomal P proteins P0, P1 e P2, acidic proteins localized in the major ribosomal subunit. These proteins share the C-terminal C sequence which is the target of anti-p P antibodies. The antibodies are detected by immunoblot on ribosomal extracts or by ELISA on the C-terminal C sequence of P proteins

25 Anti-ribosomal antibodies in SLE First described in 1985 (Elkon( et al, J Exp Med,162, 459) Association with neuropsychiatric manifestations suggested in 1987 (Bonfa( et al, N Engl J Med, 317, 265) Several studies thereafter (retrospective or prospective) gave very discordant results

26 Anti-ribosomal antibodies and neuropsychiatric manifestations Discordant results may be due to: different methods to detect anti-p P antibodies different study format heterogeneity in the diagnostic criteria for neuropsychiatric disorders limited role of anti-p P antibodies in the pathogenesis of neuropsychiatric disorders

27 Anti-ribosomal antibodies: clinical associations Associated with: skin manifestations hepatic involvement renal involvement disease activity leukopenia Frequently are detected in anti-sm and anti-dsdna positive sera: coexpression of 2 autoantibodies or double specificity of the same antibody population?

28 Anti-C1q antibodies Directed against the collagen-like like region of C1q Detected in: SLE Urticaria vasculitis syndrome IgA nephropathy Rheumatoid vasculitis IgG 20-80% IgG 100% IgA 30% IgG 2,5 % IgA 29% IgG 61%

31 ANCA anti-citoplasma dei neutrofili Anti-mieloperossidasi: sindrome di Churg-Strauss. Anti-proteinasi 3: granulomatosi di Wegener.

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