NOVA Lite HEp-2 ANA Kit with DAPI Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata

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1 NOVA Lite HEp-2 ANA Kit with DAPI Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata Codice prodotto Uso previsto Il test NOVA Lite HEp-2 è un test immunofluorescente indiretto per lo screening e la determinazione semiquantitativa di anticorpi antinucleari (ANA) nel siero umano. La presenza di anticorpi antinucleari può essere utilizzata, assieme ad altre analisi sierologiche e ai riscontri clinici, quale ausilio nella diagnosi del lupus eritematoso sistemico (LES) e di altre patologie a carico del tessuto connettivo o reumatico. Introduzione e descrizione del test Il termine "anticorpi antinucleari" descrive una varietà di autoanticorpi che reagiscono con i costituenti dei nuclei delle cellule inclusi DNA, RNA e varie proteine e ribonucleoproteine. 1 Questi autoanticorpi ricorrono con alta frequenza nei pazienti con patologie a carico del tessuto connettivo o reumatiche, specialmente il lupus eritematoso sistemico. Potenzialmente tutti i pazienti SLE sono positivi a ANA. Questa sensibilità diagnostica ha portato all'incorporazione dei test ANA nei criteri di classificazione per il lupus eritematoso sistemico rivisti nel 1982 da un sottocomitato dell'american College of Rheumatology. 2 Anche se il test ANA è un test di screening eccellente per SLE (un risultato negativo esclude potenzialmente l'sle attivo 3 ) non è in nessun caso un test specifico. I pazienti affetti da altre patologie a carico del tessuto connettivo come l'artrite reumatoide, lo scleroderma e la dermatomiosite sono di frequente positivi e negli altri stati patologici e nella popolazione normale è possibile osservare bassi titoli ANA. I risultati ANA positivi possono verificarsi a seguito di ustioni gravi o infezioni virali e sono stati riportati in alcune persone normali, sane, specialmente in popolazioni più anziane. A causa della mancanza di specificità, si raccomanda di titolare tutti i campioni ANA positivi al punto finale e test più specifici per gli autoanticorpi per il DNA a doppio filamento (dsdna) e gli autoanticorpi con antigene nucleare estraibile (ENA) da eseguire. L'immunofluorescenza indiretta è il metodo di riferimento per il test ANA. I substrati comuni sono sezioni sottili degli organi di roditori o vari tipi di linee cellulari. Si ritiene generalmente che i substrati di linee cellulari sono preferibili alle sezioni degli organi dal momento che queste cellule che si dividono rapidamente presentano livelli superiori di alcuni antigeni rilevanti clinicamente, incluso il centromero, SS-A(Ro), Scl-70 e PCNA/Ciclina. Al di là del tipo di substrato, tre altri fattori sono critici per la prestazioni di un test ANA: 1) il fissante usato per preparare il vetrino, 2) il rapporto fluoresceina-proteina (F/P) e 3) la specificità della sottoclasse dell'immunoglobulina del coniugato. Alcuni fissanti o combinazioni degli stessi sono noti per distruggere determinati antigeni nucleari e quindi il loro utilizzo deve essere evitato. La sensibilità e la colorazione del background non specifica di un coniugato viene determinata dal rapporto F/P mentre la specificità patologica di un coniugato viene determinata dalla reattività della sottoclasse del coniugato. Potenzialmente tutti gli autoanticorpi clinicamente significativi esibiscono una specificità di sottoclasse IgG anche in presenza di IgM e IgA specifici ANA. 4 Per contrasto, ANA riscontrato nei donatori di sangue sani sono in genere solo della sottoclasse IgM e IgA. 5 Per questo motivo, i coniugati specifici per IgG sono più specifici per patologia. Il substrato scelto per NOVA Lite HEp-2 ANA è una linea di cellule epiteliali fissata in modo ottimale (HEp-2) e il coniugato e anti-igg umana purificata per affinità che presenta un rapporto F/P selezionato con cura. Questi parametri di reagente consentono al test NOVA Lite HEp-2 ANA di rilevare gli autoanticorpi clinicamente rilevanti (inclusi SS-A e Scl-70) che possono rimanere non rilevati da altri test ANA disponibili in commercio. In aggiunta, la specificità del coniugato IgG elimina i risultati falsi positivi fisiologici dovuti a autoanticorpi IgM di basso titolo che si verificano normalmente, spesso riscontrati negli anziani altrimenti sani. Principi della procedura Nella tecnica di immunofluorescenza indiretta, i campioni vengono incubati con il substrato antigenico e gli anticorpi privi di reazione vengono rimossi mediante lavaggio. Il substrato viene incubato con coniugato marcato alla fluoresceina specifico e quindi un reagente non legato viene lavato. All'osservazione con un microscopio a fluorescenza, i campioni positivi agli autoanticorpi mostreranno una fluorescenza verde mela corrispondente alle aeree della cellula o dei nuclei in cui si è legato l'autoanticorpo. 2 1

2 Reagenti Vetrini di substrato di HEp-2 (cellule epiteliali umane), 12 pozzetti/vetrino, con essiccante Coniugato anti-igg umano (di capra), fluoresceina marcata in tampone contenente DAPI e 0,09% di azoturo di sodio ANA Controllo Titolabile Pattern Estremo, 1 fiala di tampone contenente < 0.09% di azoturo di sodio e anticorpi da siero umano anti-hep-2, prediluito Controllo Negativo Sistemi IFA, 1 fiala di tampone contenente 0,09% di azoturo di sodio e nessun anticorpo da siero umano all HEp-2, prediluito Concentrato PBS II (40x), sufficiente per 2000 ml Mezzo di montaggio, 0,09% di azoturo di sodio Coprivetrini Avvertenze 1. Tutto il materiale di origine umana utilizzato nella preparazione dei controlli in kit per questo prodotto è stato testato ed è risultato negativo alla presenza di anticorpi al virus dell'immunodeficienza umana (HIV), dell antigene superficiale dell epatite B (HBsAg) e dell epatite C (HCV) in base a metodi approvati dall FDA. Nessun metodo di prova tuttavia può offrire l'assicurazione completa dell assenza del virus dell HIV, HCV o altri agenti infettivi. Pertanto, ANA Controllo Titolabile Pattern Estremo e il Controllo Negativo Sistemi IFA devono essere trattati come materiali potenzialmente infettivi L'azoturo di sodio viene usato come conservante in alcuni componenti del kit. L azoturo di sodio è un veleno e può essere tossico se ingerito o assorbito attraverso la pelle o gli occhi. L azoturo di sodio può reagire con le tubature in piombo o rame e formare azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lavare i lavandini, se usati per lo smaltimento dei reagenti, con grandi volumi di acqua per evitare l accumulo di azide. 3. Utilizzare attrezzatura di protezione idonea quando si manipolano i reagenti forniti. 4. I reagenti rovesciati devono essere puliti immediatamente. Durante lo smaltimento delle scorie, rispettare tutti i regolamenti ambientali federali, statali e locali. Precauzioni 1. Questo prodotto è per Uso diagnostico In Vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel sistema può causare risultati incoerenti. 3. Un lavaggio incompleto o inefficiente dei pozzetti IFA può causare un elevato rumore di fondo. 4. L adattamento di questo dosaggio all uso con unità di sviluppo automatiche dei campioni e altri dispositivi per la manipolazione dei liquidi, anche parziale, può produrre differenze nei risultati del test rispetto a quelli ottenuti utilizzando la procedura manuale. È responsabilità di ogni laboratorio verificare che la procedura automatica dia risultati dei test entro limiti accettabili. 5. Le prestazioni del dosaggio sono influenzate da molti fattori. Tra questi figurano la temperatura iniziale dei reagenti, l intensità della lampadina del microscopio usato, la precisione e la riproducibilità della tecnica di pipettamento, l accuratezza del lavaggio e la lunghezza dei periodi di incubazione durante il test. Per ottenere risultati accurati e riproducibili è necessario prestare grande attenzione alla coerenza. 6. Nel tempo, il coniugato anti-igg umano può cambiare di colore a causa dell'esposizione alla luce. Tuttavia, il cambio di colore non altera le prestazioni del dosaggio. 7. Si raccomanda un rigido rispetto del protocollo. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e maneggiati in accordo alle istruzioni. 2. Il tampone PBS II diluito è stabile per 4 settimane a 2 8 C. Prelievo del campione Questa procedura deve essere eseguita con un campione di siero. L aggiunta di azide o altri conservanti ai campioni del test può influenzare negativamente i risultati. I campioni microbicamente contaminati, sottoposti a trattamento termico o contenenti particolato visibile non devono essere usati. Evitare campioni o sieri lipemici o fortemente emolizzati. dopo il prelievo, separare il siero dal coagulo. Il CLSI (NCCLS) Document H18-A3 raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) conservare i campioni a temperatura ambiente per un massimo di 8 ore; 2) se il test non verrà completato entro 8 ore, refrigerare il campione a 2-8 C; 3) se il test non verrà completato entro 48 ore, oppure per la spedizione del campione, congelare a -20 C o a una temperature inferiore. I campioni congelati devono essere miscelati dopo il decongelamento e prima di eseguire il test. 2

3 Procedura Materiale fornito Materiale fornito Vetrini di substrato HEp-2 a 12 pozzetti Coniugato anti-igg umano FITC con DAPI Quantità 20 x 12 pozzetti 1 x 15 ml ANA Controllo Titolabile Pattern Estremo 1 x 0,5 ml Controllo Negativo Sistemi IFA 1 x 0,5 ml PBS II Concentrato (40x) 2 x 25 ml Mezzo di montaggio 1 x 7 ml Coprivetrini 1 x 20 Materiale aggiuntivo richiesto ma non fornito Micropipette per l erogazione di μL di volume Acqua distillata o deionizzata Spruzzette o Pipette pipette Pasteur Camera umida Contenitore da 1l (per la diluizione del PBS II) Vaschetta di Coplin Microscopio a fluorescenza con eccitatore a 495nm e filtro barriera da 515nm. Metodo Prima di iniziare 1. Portare tutti i reagenti e i campioni a temperature ambiente (20-26 C) e miscelare bene. 2. Diluire il concentrato di PBS II: IMPORTANTE: diluire il concentrato PBS II concentrato nella misura di 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone di concentrato PBS II concentrato a 975 ml di acqua distillata o deionizzata e miscelare accuratamente. Il tampone PBS II viene usato per diluire i campioni dei pazienti e come tampone di lavaggio. Il tampone diluito può essere conservato fino a 4 settimane a 2-8 C. 3. Diluire i campioni dei pazienti: a. Screening iniziale: Diluire i campioni dei pazienti nella misura di 1:40 con tampone PBS II diluito (p.es., aggiungere 50μL di siero fino a 1,95 ml di tampone PBS II). b. Titolazione: preparare diluizioni seriali doppie dalla diluizione di screening iniziale per tutti i campioni positivi con tampone PBS II diluito (ossia 1:80, 1:160, 1:2560). Procedura del dosaggio 1. Preparare i vetrini di substrato: lasciare che il vetrino di substrato raggiunga la temperatura ambiente prima di rimuoverlo dalla busta. Marcare il vetrino con una matita e collocarlo in una camera umida idonea. Aggiungere 1 goccia (20-25μL) di controllo positivo e negativo non diluito rispettivamente ai pozzetti 1 e 2. Aggiungere 1 goccia (20-25μL) di campione del paziente diluito ai pozzetti restanti. 2. Incubazione del vetrino: incubare il vetrino per minuti in una camera umida (la carta assorbente inumidita posta sul fondo di un contenitore chiuso in vetro o in plastica conserverà le condizioni di umidità idonee). Non consentire al substrato di seccare durante la procedura di dosaggio 3. Lavare i vetrini: dopo l incubazione, utilizzare una spruzzetta in plastica per eliminare delicatamente il siero con il tampone PBS II diluito. Orientare il vetrino e il flusso di tampone PBS II in modo da ridurre al minimo il wash-over dei campioni tra i pozzetti. Evitare di dirigere il flusso direttamente sui pozzetti per evitare di danneggiare il substrato. Se lo si desidera, collocare i vetrini in una vaschetta di Coplin di tampone PBS II diluito per massimo 5 minuti. 4. Aggiunta di coniugato fluorescente: Eliminare l eccesso di tampone PBS II scuotendo. Collocare nuovamente il vetrino nella camera umida e coprirlo immediatamente con una goccia di coniugato fluorescente. Incubare i vetrini per altri minuti. 5. Lavare i vetrini: ripetere il punto 3. 3

4 6. Coprivetrino: le procedure da utilizzare con i coprivetrini variano da un laboratorio all altro; tuttavia, si raccomanda la seguente procedura: a. Collocare un coprivetrino su carta assorbente. b. Applicare il mezzo di montaggio in linea continua sul bordo inferiore del coprivetrino. c. Eliminare l'eccesso di tampone PBS II scuotendo e toccare il bordo inferiore del vetrino con il bordo del coprivetrino. Abbassare delicatamente il vetrino sul coprivetrino in modo che il mezzo di montaggio fluisca sul bordo superiore del vetrino senza formazione o intrappolamento di bolle d aria. Controllo della qualità ANA Controllo Titolabile Pattern Estremo e il Controllo Negativo Sistemi IFA devono essere analizzati su tutti i vetrini per garantire che tutti i reagenti e tutte le procedure vengano eseguiti correttamente. Sieri di controllo aggiuntivi idonei possono essere preparati suddividendo in aliquote campioni di siero umano e conservandoli a < -70 C. Affinché i risultati di test possano essere considerati validi, devono essere soddisfatti tutti i criteri seguenti. Se uno qualsiasi di questi non viene soddisfatto, il dosaggio deve essere considerato non valido e deve essere ripetuto. 1. ANA Controllo Titolabile Pattern Estremo deve essere > Il Controllo Negativo Sistemi IFA deve essere negativo. Interpretazione dei risultati Reazione negativa. Un campione viene considerato negativo se una colorazione specifica è uguale o inferiore al Controllo Negativo Sistemi IFA. I campioni possono mostrare vari gradi di colorazione di fondo a causa degli anticorpi eterofili o degli anticorpi di basso livello per i costituenti citoplasmatici, ad esempio le proteine contrattili. Reazione positiva. Un campione viene considerato positivo se una colorazione specifica è superiore Controllo Negativo Sistemi IFA. Determinare il grado o l'intensità di fluorescenza utilizzando questi criteri: 4+ Fluorescenza verde mela brillante 3+ Fluorescenza verde mela chiaro 2+ Fluorescenza positiva chiaramente distinguibile 1+ Fluorescenza specifica minima che consente di differenziare chiaramente la colorazione nucleare e/o citoplasmica dalla fluorescenza du fondo. Rilevamento del pattern. Possono essere presenti una varietà di pattern di colorazione nucleare e/o citoplasmatica in base ai tipi e alle quantità corrispondenti di autoanticorpi presenti nel campione. È possibile osservare i seguenti tipi di pattern di colorazione: Omogeneo: una colorazione del nucleo uniforme con o senza mascheramento apparente dei nucleoli. Antigeni nucleari presenti: dsdna, ssdna, istone Associazione con patologie: titoli alti suggeriscono LES; titoli bassi suggeriscono LSE o altre patologie del tessuto connettivo. Periferico: una colorazione uniforme, principalmente intorno alle regione esterna del nucleo con colorazione più debole verso il centro del nucleo. Antigeni nucleari presenti: dsdna, ssdna, DNP, istone. Associazione con patologie: titoli alti suggeriscono LES; titoli bassi suggeriscono LSE o altre patologie del tessuto connettivo. Punteggiato: una colorazione grossolana o finemente granulare del nucleo in genere senza colorazione fluorescente dei nucleoli. Antigeni nucleari presenti: Sm; RNP; Scl-70; SSA-A; SS-B e altri sistemi antigene/anticorpo non ancora caratterizzati. Associazione con patologie: titoli alti suggeriscono LES (antigene Sm), malattia mista del tessuto connettivo (antigene RNP), sclerodermia (antigene Scl-70) o complesso sindrome di Sjögren-sicca (antigene SS-B); titoli bassi possono suggerire LES o altre patologie del tessuto connettivo. Nucleolare: grande colorazione a chiazze grossolana all interno del nucleo, in genere meno di 6 per cellula, con o senza chiazze sottili occasionali. Antigeni nucleari presenti: 4-6s RNA e altri antigeni nucleari sconosciuti. Associazione con patologie: titoli alti sono prevalenti nella sclerodermia e nella sindrome di Sjögren. Centromero: un pattern a chiazze discreto. Le chiazze nucleari sono molto discrete e in genere in qualche in alcuni multipli di 46. Antigeni nucleari presenti: centromero cromosomico (cinetocoro). 4

5 Associazione con patologie: fortemente indicativo della sindrome CREST variante della sclerosi sistemica progressiva (SSP). CREST è una forma di SSP con calcinosi prominente, fenomeno di Raynaud, disfunzione esofagea, coinvolgimento limitato della pelle (spesso confinati alle dita o alla faccia) e teleangectasia. Mitocondriale: chiazze discrete del citoplasma con relativa colorazione dell'area del nucleo. Antigeni presenti: vari tipi di antigeni mitocondriali. Associazione con patologie: titoli alti indicano principalmente cirrosi biliare. È importante avvisare l'utente di affidarsi ai pattern per determinare la specificità degli autoanticorpo, a eccezione dei pattern nucleolare e centromero all'interno dei quali ogni antigene è molto ben definito e i relativi pattern sono caratteristici. Dal momento che molti autoanticorpi o combinazioni possono indurre un pattern omogeneo o a chiazze, si raccomando si eseguire esami specifici di follow-up degli autoanticorpi (ad esempio per dsdna ed ENA) sui campioni a chiazze e omogenei. Limiti della procedura 1. Sebbene un ANA con titolo alto possa essere fortemente indicativo di una malattia del tessuto connettivo, ciò non deve essere considerato come diagnostico. Il risultato ANA deve essere considerato in associazione ad altri risultati sierologici nonché all anamnesi clinica generale del paziente. 2. I pattern ANA spesso cambiano con la progressiva titolazione del campione al punto finale. Questo fenomeno è dovuto alla caduta degli anticorpi di titolo basso sotto il livello di sensibilità del sistema dal momento che vengono analizzati più campioni. 3. La sensibilità del test è influenzata da una varietà di fattori esterni tra cui il tipo di microscopio a fluorescenza utilizzato, l intensità e l'età della lampadina, l'ingrandimento usato, il sistema di filtro e l'osservatore. 4. Se viene utilizzato un filtro a banda passantepassa banda invece di un filtro barriera da 515, è possibile che vengano osservati artefatti di colorazione aumentati. 5. Per contrassegnare i vetrini utilizzare solo la matita. L'uso di qualsiasi altro materiale di scrittura può causare artefatti di colorazione. 6. Tutte le vaschette di Coplin usate per il lavaggio dei vetrini devono essere ripulite da tutti i residui di colorante. L uso di vaschette di Coplin contenenti un residuo di coloranti può causare artefatti di colorazione. 7. I risultati del test devono essere usati in combinazione ai reperti clinici e ad altri test sierologici. 8. Non sono stabilite prestazioni per matrici diverse dal siero. I vetrini venduti separatemente vengono classificati come Reagenti specifici per l'analita. Fatta eccezione di un componente di NOVA Lite HEp-2 ANA Kit con DAPI, le caratteristiche analitiche e delle prestazioni non vengono stabilite. Valori previsti Utilizzando il kit di analisi NOVA Lite HEp-2 ANA, sono stati sottoposti a test numerosi pazienti affetti da malattia del tessuto connettivo e 200 donatori di sangue casuali. Di seguito sono riportati oi risultati: Gruppo di pazienti Numero sottoposto a test Numero di positivi LES Lupus farmaco-indotto Artrite reumatoide Sclerodermia Dermatomiosite Sindrome di Sjögren Normale

6 Bibliografia 1. Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: , Tan EM, et al.: The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: , Casalo SP, Friou GJ and Myers LL: Significance of antibodies to DNA in systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: , Gonzalez E and Rothfield N: Immunoglobulin class and pattern of nuclear fluorescence in systemic lupus erythematosus. The New England Journal of Medicine 274: , Wiik A: Antinuclear factors in sera from healthy blood donors. Acta Path Microbiology Scand. 84: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5 th Edition. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2009 Fornitore: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Rappresentante Autorizzato: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: ITA December 2012 Revision 2 NOVA Lite e INOVA Diagnostics, Inc. sono marchi registrati. Copyright 2012 Tutti i diritti riservati. 6