% anti-c1q nella malattia renale attiva (n. pazienti)

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1 QUANTA Lite TM Anti-C1q ELISA Solo per esportazione. Non autorizzato alla vendita negli Stati Uniti Per uso diagnostico in vitro Complessità CLIA: elevata Uso previsto Il test QUANTA Lite TM Anti-C1q è un test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per la determinazione semiquantitativa di anticorpi anti-c1q nel siero umano. La presenza di anticorpi anti-c1q nei pazienti con lupus eritematoso sistemico può essere utilizzata in combinazione con riscontri clinici e altri test di laboratorio quale ausilio nell individuazione di soggetti a rischio di glomerulonefrite. Introduzione e descrizione del test La presenza di anticorpi a un frammento del primo componente del complemento, C1q, è stata riscontrata in numerose patologie autoimmuni 1, 2. Nel corso degli ultimi 21 anni molti studi diversi hanno mostrato che, nei soggetti con lupus eritematoso sistemico (LES), gli autoanticorpi anti-c1q sono associati alla presenza di glomerulonefrite attiva Questi autoanticorpi possono aumentare durante una fase attiva nel LES 3-9. La presenza di autoanticorpi C1q è stata osservata nelle lesioni renali dei pazienti con LES affetti da glomerulonefrite 11 e gli anticorpi anti-c1q contribuiscono alla glomerulonefrite nei modelli murini di nefrite lupica 12. Presi globalmente, questi studi dimostrano che la presenza di autoanticorpi anti-c1q aumenta il rischio che un paziente con LES sviluppi glomerulonefrite attiva, probabilmente perché gli anticorpi anti-c1q sono patogeni quando il paziente ha anche immunocomplessi circolanti. Tabella 1. Correlazione tra gli autoanticorpi anti-c1q e la nefrite lupica Rif. n. N. pazienti con LES Correlazione con la malattia renale attiva Migliore che anti- DNA % anti-c1q nella malattia renale attiva (n. pazienti) % anti-c1q in caso di nella malattia renale non attiva o assente (n. pazienti) Correlazione con SLEDAI o ECLAM Le misurazioni seriali mostrano variazione p<0,0003 Sì 44% (139) 18% (101) N.E. Sì p=0,017 N.E. 50% (22) 23% (107) p=0,006 Sì p=0,0001 Sì 74% (77) 32% (74) N.S.** Sì 6 43 p<0,005 Sì 82% (17) 31% (26) N.E. Sì 7 61 p<0,0001 Sì 87% (23) 8% (38) p<0,0001 Sì 8 68 p<0,01 Sì 71% (21) 30% (47) p<0,01 Sì p<0,0001 N.E. 95% (38) 35% (62) N.E. Sì In 58 p=0,054 Sì 44% (16) 26% (42) p=0,005 Sì Prep.^ Totale % (353) 25% (625) *N.E. = Non eseguito, **N.S. = Non significativo, ^Studio con impiego di QUANTA Lite Anti-C1q ELISA, è in preparazione il manoscritto per il secondo studio Principi della procedura L'antigene C1q purificato viene legato nei pozzetti di una piastra di micropozzetti di polistirene in condizioni che consentono la conservazione dell antigene al suo stato reattivo. Gli autoanticorpi alla regione collagenosimile dell antigene C1q sono correlati a malattia attiva nei pazienti con LES. Per ridurre il legame degli immunocomplessi ad altre parti di C1q, nel diluente per campioni viene utilizzato un elevato quantitativo di sale. I controlli prediluiti e i sieri diluiti dei pazienti vengono aggiunti a pozzetti separati consentendo agli anticorpi anti-c1q presenti di legarsi all antigene immobilizzato. Il campione non legato viene lavato via e in ogni pozzetto si aggiunge un coniugato anti IgG umane marcato con un enzima. Una seconda incubazione consente agli anticorpi anti IgG umane marcati con enzima di legarsi agli anticorpi del paziente che sono rimasti attaccati alle pareti dei pozzetti. Dopo il lavaggio per allontanare gli anticorpi anti IgG umane marcati con enzima in eccesso, l attività dell enzima rimasto viene misurata aggiungendo un substrato cromogeno e misurando l intensità del colore che si sviluppa. Il test può essere valutato spettrofotometricamente misurando e confrontando l intensità del colore che si sviluppa nei pozzetti dei pazienti e nei pozzetti di controllo. Reagenti 1. Piastra di micropozzetti di polistirene ELISA rivestita di un antigene purificato anti-c1q, (12-1 x 8 pozzetti), con supporto in involucro contenente un essiccante 2. ELISA Controllo negativo, 1 fiala di tampone contenente conservante e siero umano senza anticorpi umani all antigene anti-c1q, prediluito, 1,2 ml 3. Anti-C1q ELISA Low Positive (debolmente positivo), 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi da siero umano all antigene anti-c1q, prediluito, 1,2 ml 4. Anti-C1q ELISA High Positive (fortemente positivo), 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi da siero umano all antigene anti-c1q, prediluito, 1,2 ml 1

2 5. Diluente per campioni anti-c1q, 1 fiala di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween 20, stabilizzanti proteici e conservante, 50 ml 6. Concentrato di lavaggio HRP, 1 fiala di concentrato 40x di colore rosso contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris e Tween 20, 25 ml. Per istruzioni relative alla diluizione vedere la sezione dedicata ai metodi. 7. Coniugato IgG HRP (capra), anti IgG umane, 1 fiala di colore blu contenente tampone, stabilizzanti proteici e conservante, 10 ml 8. Cromogeno TMB, 1 fiala contenente stabilizzanti, 10 ml 9. Soluzione di arresto HRP, acido solforico 0,344M, 1 fiala incolore, 10 ml Avvertenze 1. AVVISO: questo prodotto contiene una sostanza chimica (cloramfenicolo allo 0,02%) nel diluente per campioni, nei controlli e nel coniugato nota allo Stato della California come causa di cancro. 2. Tutto il materiale con origine umana utilizzato nella preparazione dei controlli per questo prodotto è stato testato ed è risultato negativo alla presenza di anticorpi al virus dell'immunodeficienza umana (HIV), dell antigene superficiale dell epatite B (HBsAg) e dell epatite C (HCV) in base a metodi approvati dall FDA. Nessun metodo di prova tuttavia può offrire l'assicurazione completa dell assenza del virus dell HIV, HCV o altri agenti infettivi. Pertanto, i reagenti anti-c1q ELISA Low Positive, Anti- C1q ELISA High Positive ed ELISA Controllo negativo devono essere manipolati come materiali potenzialmente attivi L azoturo di sodio viene usato come conservante. L azoturo di sodio è un veleno e può essere tossico se ingerito o assorbito attraverso la pelle o gli occhi. L azoturo di sodio può reagire con le tubature in piombo o rame e formare azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lavare i lavandini, se usati lo smaltimento dei reagenti, con grandi volume di acqua per evitare l accumulo di azide. 4. Il coniugato HRP contiene una sostanza chimica diluita velenosa/corrosiva che può essere tossica se ingerita in grandi quantità. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la pelle e con gli occhi. 5. Il cromogeno TMB contiene un irritante che può essere pericoloso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la pelle. Per evitare lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la pelle e con gli occhi. 6. La soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione diluita di acido solforico. Evitare l esposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L acido solforico è un veleno ed è corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire ustioni chimiche, evitare il contatto con la pelle e con gli occhi. 7. Utilizzare attrezzatura di protezione idonea quando si manipolano i reagenti forniti. 8. I reagenti rovesciati devono essere puliti immediatamente. Durante lo smaltimento delle scorie, rispettare tutti i regolamenti ambientali federali, statali e locali. Precauzioni 1. Questo prodotto è destinato a un uso diagnostico in vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel sistema può causare risultati incoerenti. 3. Un lavaggio incompleto o inefficiente e un insufficiente rimozione del liquido dalle strip di pozzetti ELISA causa scarsa precisione e/o un elevato rumore. 4. L adattamento di questo test all uso con unità di sviluppo automatiche dei campioni e altri dispositivi per la manipolazione dei liquidi, anche parziale, può produrre differenze nei risultati del test rispetto a quelli ottenuti utilizzando la procedura manuale. È responsabilità di ogni laboratorio verificare che la procedura automatica dia risultati dei test entro limiti accettabili. 5. Le prestazioni del test sono influenzate da molti fattori. Tra questi figurano la temperature iniziale dei reagenti, la temperature ambiente, la precisione e la riproducibilità della tecnica di pipettamento, l'accuratezza del lavaggio e della rimozione del liquido dai micropozzetti delle strip ELISA, il fotometro usato per misurare i risultati e la lunghezza dei periodi di incubazione durante il test. Per ottenere risultati accurati e riproducibili è necessario prestare grande attenzione alla coerenza. 6. Si raccomanda un rigido rispetto del protocollo. 7. Una risigillatura incompleta della borsa con cerniera contenente le strip di pozzetti e gli essiccanti causa una degradazione dell antigene e una scarsa precisione. 8. Capacità di assorbimento eccessivamente basse possono essere osservate dopo due o più impieghi da un singolo flacone di coniugato HRP nell arco di un periodo di tempo. Per evitare che questo avvenga è importante seguire tutte le procedure raccomandate per la manipolazione del coniugato HRP. 9. La contaminazione chimica del coniugato HRP può derivare da una pulizia o un risciacquo inadeguati dell attrezzatura o degli strumenti. I residui di comuni sostanze di laboratorio come la formalina, la candeggina, l etanolo o un detergente causano degradazione del coniugato HRP nel tempo. Risciacquare accuratamente tutta l attrezzatura o gli strumenti dopo l uso di detergenti/disinfettanti chimici. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e maneggiati in accordo alle istruzioni. 2. Le strip di pozzetti rivestite con antigeni non utilizzate devono essere risigillate in modo sicuro nel sacchetto di alluminio contenente i disseccanti e conservate a 2-8 C. 3. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 1 settimana a 2-8 C. 2

3 Prelievo del campione Questa procedura deve essere eseguita con un campione di siero. L aggiunta di azide o altri conservanti ai campioni del test può influenzare negativamente i risultati. I campioni microbicamente contaminati, sottoposti a trattamento termico o contenenti particolato visibile non devono essere usati. Evitare campioni o sieri lipemici o fortemente emolizzati. Dopo il prelievo, separare il siero dal coagulo. Il CLSI Document H18-A3 raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) conservare i campioni a temperatura ambiente per un massimo di 8 ore; 2) se il test non verrà completato entro 8 ore, refrigerare il campione a 2-8 C; 3) se il test non verrà completato entro 48 ore, oppure per la spedizione del campione, congelare a -20 C o a una temperature inferiore. I campioni congelati devono essere miscelati dopo il decongelamento e prima di eseguire il test. Procedura Materiale fornito 1 Piastra di micropozzetti ELISA Anti-C1q, (12-1 x 8 pozzetti), con supporto 1 1,2 ml di ELISA Controllo negativo prediluito 1 1,2 ml di reagente Anti-C1q ELISA Low Positive prediluito 1 1,2 ml di reagente Anti-C1q ELISA High Positive prediluito 1 50 ml di diluente per campioni Anti-C1q 1 25 ml di concentrato di lavaggio HRP, 40x concentrato 1 10 ml di coniugato IgG HRP, (capra), anti IgG umane 1 10 ml di cromogeno TMB 1 10 ml di soluzione di arresto HRP, 0,344M acido solforico Materiale aggiuntivo richiesto ma non fornito Micropipette per l erogazione di 5, 100, e 500 µl Punte per micropipette monouso Provette per diluizione del campione del paziente, 4 ml di volume Acqua distillata o deionizzata Contenitore da 1l per il concentrato di lavaggio HRP diluito Lettore di micropiastre in grado di misurare l assorbanza OD a 450 nm (e 620 nm per le letture a doppia lunghezza d onda) Metodo Prima di iniziare 1. Portare tutti i reagenti e i campioni a temperature ambiente (20-26 o C) e miscelare bene. 2. Diluire il concentrato di lavaggio HRP nella misura di 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone di concentrato di lavaggio HRP a 975 ml di acqua distillata o deionizzata. Se durante questo periodo non viene eseguita l analisi dell intera piastra, è possibile preparare una quantità minore aggiungendo 2,0 ml di concentrato a 78 ml di acqua distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. Il tampone diluito è stabile per 1 settimana a 2-8 o C. 3. Preparare una diluizione 1:101 di ogni campione del paziente aggiungendo 5 µl di campione a 500 µl di diluente per campioni anti-c1q. I campioni diluiti devono essere usati entro 8 ore dalla preparazione. NON DILUIRE il reagente Anti-C1q ELISA Low Positive, Anti-C1q ELISA High Positive ed ELISA Controllo negativo. 4. La determinazione della presenza o dell assenza di anticorpi anti-c1q utilizzando unità arbitrarie richiede due pozzetti per ciascuno dei tre controlli e uno o due pozzetti per ogni campione del paziente. Si consiglia di testare i campioni in doppio. Procedura del test 1. TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26 C) PRIMA DI COMINCIARE IL TEST. Collocare il numero richiesto di micropozzetti/strip nel supporto. Riporre immediatamente le strip non utilizzate nel sacchetto con l'essiccante e chiuderlo bene per ridurre al minimo l esposizione al vapore acqueo. 2. Aggiungere ai pozzetti 100 µl di reagente Anti-C1q ELISA Low Positive prediluito, Anti-C1q ELISA High Positive, ELISA Controllo negativo e i campioni diluiti dei pazienti. Coprire i pozzetti e incubare per 30 minuti a temperature ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione comincia dopo l ultima aggiunta. 3. Ciclo di lavaggio: aspirare completamente il contenuto di ogni pozzetto. Aggiungere a tutti i pozzetti µl del tampone di lavaggio diluito HRP quindi aspirare. Ripetere questa sequenza altre due volte per un totale di tre lavaggi. Ribaltare la piastra e percuoterla delicatamente su materiale assorbente per rimuovere eventuale liquido residuo dopo l ultimo lavaggio. È importante svuotare completamente ogni pozzetto dopo ogni ciclo di lavaggio. Rispettare la stessa sequenza di aspirazione impiegata per l aggiunta del campione. 4. Aggiungere a ogni pozzetto 100 μl di coniugato IgG HRP. Il coniugato deve essere rimosso dai flaconi in condizioni asettiche standard e impiegando buone tecniche di laboratorio. Estrarre dal flacone solo la quantità di coniugato necessaria per il test. PER EVITARE UNA POTENZIALE CONTAMINAZIONE MICROBICA E/O CHIMICA, NON REINTRODURRE MAI NEL FLACONE IL CONIUGATO NON UTILIZZATO. Incubare i pozzetti per 30 minuti come nel ciclo Ciclo di lavaggio: ripetere il punto 3. 3

4 6. Aggiungere a ogni pozzetto 100 µl di cromogeno TMB e incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. 7. Aggiungere a ogni pozzetto 100 µl di soluzione di arresto. Per l'aggiunta della soluzione di arresto HRP rispettare la stessa sequenza e la stessa tempistica utilizzate per il cromogeno TMB. Percuotere delicatamente la piastra con un dito per miscelare accuratamente i pozzetti. 8. Leggere l assorbanza (OD) di ogni pozzetto a 450 nm entro un ora dall arresto della reazione. Se si desiderano misurazioni bicromatiche, come lunghezza d onda di riferimento è possibile utilizzare 620 nm. Controllo della qualità 1. I reagenti Anti-C1q ELISA Low Positive, Anti-C1q ELISA High Positive ed ELISA Controllo negativo devono essere analizzati con tutti i lotti di campioni per garantire che tutti i reagenti e tutte le procedure vengano eseguiti correttamente. 2. Si noti che i reagenti Anti-C1q ELISA Low Positive, Anti-C1q ELISA High Positive ed ELISA Controllo negativo sono are prediluiti e pertanto non controllano i metodi procedurali associati alla diluizione dei campioni. 3. È possibile testare controlli aggiuntivi attenendosi alle linee guida o ai requisiti delle normative locali e/o statali o di organizzazioni accreditate. Sieri di controllo aggiuntivi idonei possono essere preparati suddividendo in aliquote campioni di siero umano e conservandoli a < -20 C. 4. Affinché i risultati di test possano essere considerati validi, devono essere soddisfatti tutti i criteri seguenti. Se qualsiasi di questi non viene soddisfatto, il test deve essere considerato non valido e deve essere ripetuto. a. L assorbanza del reagente Anti-C1q ELISA High Positive prediluito deve essere superiore all assorbanza del reagente Anti-C1q ELISA Low Positive prediluito, che deve essere superiore all assorbanza di ELISA Controllo negativo prediluito. b. Il reagente Anti-C1q ELISA High Positive prediluito deve avere un assorbanza superiore a 1.0 mentre l assorbanza di ELISA Controllo negativo non può essere superiore a 0,2. c. L assorbanza di Anti-C1q ELISA Low Positive deve pertanto essere oltre due volte superiore a quella di ELISA Controllo negativo o superiore a 0,25 ma non superiore a 0,6. d. I reagenti ELISA Controllo negativo e Anti-C1q ELISA High Positive forniscono indicazioni di massima sui errori dei reagenti, mentre Anti-C1q ELISA High Positive non garantisce la precisione del cutoff. e. Per indicazioni sulle corrette pratiche di controllo della qualità si raccomanda all utente di fare riferimento a CLSI Document C24-A3. Calcolo dei risultati In primo luogo viene determinata l assorbanza media per ogni set di duplicati. La reattività di ogni campione può quindi essere calcolata dividendo l assorbanza media del campione per l assorbanza media del reagente Anti-C1q ELISA Low Positive. Il risultato viene moltiplicato per il numero di unità assegnate ad Anti- C1q ELISA Low Positive riportato sull etichetta. Assorbanza campione Valore campione = x Anti-C1q ELISA Low Positive (unità) Assorbanza Anti-C1q ELISA Low Positive (unità) La reattività viene quindi correlata alla quantità di anticorpi presenti secondo un metodo non lineare. Benché gli aumenti e le riduzioni nelle concentrazioni di anticorpi in un paziente si riflettano in un corrispondente aumento o abbassamento della reattività, la variazione non è proporzionale (p.es. raddoppiando la concentrazione di anticorpi non si ottiene un raddoppiamento della reattività). Se occorre una quantificazione più accurata degli anticorpi del paziente, è necessario eseguire diluizioni seriali del campione del paziente e l ultima diluizione con risultato positivo nel test deve essere riferita quale titolo anticorpale del paziente. Interpretazione dei risultati Il test ELISA è molto sensibile alla tecnica ed è in grado di rilevare persino differenze minime nelle popolazioni di pazienti. I valori illustrati di seguito sono solo valori suggeriti. Ogni laboratorio deve definire il proprio intervallo normale in base alle tecniche, ai controlli, all'attrezzatura e alla popolazioni di pazienti propri secondo le procedure consolidate. Il campione può quindi essere classificato come negativo, debolmente positivo, moderatamente positivo o fortemente positivo in base alla tabella seguente. Unita Negativo <20 Debolmente positivo Moderatamente positivo Fortemente positivo >80 1. Un risultato positivo indica la presenza di anticorpi anti-c1q e suggerisce un maggior rischio di nefrite lupica nei pazienti con LES. 2. Un risultato negativo indica l assenza di anticorpi anti-c1q o livelli inferiori al cut-off negativo del test. 4

5 Limiti della procedura 1. La presenza di immunocomplessi o altri aggregati immunoglobulinici nel campione del paziente non produce falsi positivi in questo test grazie allo speciale diluente per campioni ad alto contenuto di sale Non tutti i pazienti con LES e nefrite lupica sono positivi per l'anti-c1q. 3. I risultati del test devono essere usati in combinazione ai reperti clinici e ad altri test sierologici. 4. Non sono stabilite prestazioni per matrici diverse dal siero. Valori previsti La capacità del test QUANTA Lite Anti-C1q ELISA di individuare anticorpi anti-c1q nei pazienti con LES è stata valutata conducendo due studi su pazienti con LES clinicamente definito. Per un confronto dei risultati tratti dalla letteratura e il test QUANTA Lite Anti-C1q ELISA vedere la tabella seguente. Sensibilità e specificità clinica LES N=139 Totale Sensibilità e specificità Anti-C1q GN+ GN+ ELISA Positivo Sensibilità = 50% Negativo Specificità = 70% Totale In questa analisi, la presenza di glomerulonefrite (GN+) è considerata come stato patologico mentre l assenza di glomerulonefrite (GN-) è interpretata come assenza di malattia. Intervallo di normalità Come ausilio all identificazione dell intervallo di riferimento sono stati sottoposti a test Anti-C1q ELISA un totale di 184 campioni prelevati da donatori di sangue casuali. Sono stati ottenuti 15 campioni positivi all Anti-C1q, con una specificità del 91,8%. Controlli per le malattie reumatiche e infettive Sono stati sottoposti a test con Anti-C1q ELISA 71 campioni prelevati da pazienti con diagnosi accertata di malattie reumatiche e 76 campioni con anticorpi a organismi patogeni infettivi, tra cui 28 campioni positivi per sclerodermia, 16 campioni positivi per la Sindorme di Sjögren s, 27 campioni positivi all artrite reumatoide, 52 positivi all'hcv, 8 positivi all HSV, 8 positivi al CMV, 3 positivi alla toxoplasmosi e 5 campioni positivi alla rosolia. Un campione positivo alla Sindorme di Sjögren s, 1 campione positivo all'artrite reumatoide, 1 alla sclerodermia, 2 all HCV, 2 al CMV, 1 all HSV 1 alla toxoplasmosi sono risultati positivi all Anti-C1q con una specificità in questo gruppo del 93,9%. Confronto metodologico I campioni prelevati da donatori di sangue normali, i controlli con patologie reumatiche e infettive sopra elencati e 58 pazienti con LES sono stati analizzati utilizzando i test ELISA QUANTA Lite Anti-C1q e antidsdna. I risultati sono riportati nella tabella seguente. Concordanza delle percentuali positive e negative con il test anti-dsdna Tutti i dsdna IgG ELISA Totale % di concordanza pazienti Positivo Negativo N=389 Anti-C1q ELISA Positivo Concordanza % positive =37% Negativo Concordanza % negative =96% Totale Totale concordanza % =90% Reattività crociata Per valutare la potenziale reattività crociata dell antigene C1q con altri autoanticorpi, il test QUANTA Lite Anti-C1q ELISA è stato valutato con 16 campioni, tutti con livelli elevati di altri autoanticorpi. Il gruppo includeva due campioni ciascuno che reagivano a SS-A, SS-B, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, Ribo-P e DNA. Tutti i campioni erano negativi per anti-c1q. Precisione e riproducibilità Le valutazioni delle prestazioni intra-dosaggio per il test QUANTA Lite Anti-C1q ELISA sono state eseguite analizzando 9 campioni un totale di 9 o 10 volte ciascuna su 3 lotti di kit. Di seguito sono riportati i risultati rappresentativi. C1q 1 C1q 2 C1q 3 N209 C1q 4 C1q 5 Lis 22 Media 93 U 39 U 25 U 9 U 18 U 29 U 77 U SD 2,01 1,37 21,05 1,09 1,59 0,94 1,67 CV 2 % 3 % 4 % 12 % 9 % 3 % 2 % Le valutazioni delle prestazioni intra-dosaggio per il test QUANTA Lite Anti-C1q ELISA sono state eseguite analizzando 12 campioni in 6 occasioni distinte lungo un arco di otto giorni. Questi test sono stati eseguiti su tre lotti di piastre Anti-C1q ELISA. Di seguito sono presentati i risultati rappresentativi. C1q 1 C1q 2 C1q 5 C1q 6 N207 Lis 14 Lis 22 Media 94 U 43 U 33 U 27 U 7 U 71 U 61 U SD 4,09 3,40 2,32 3,35 0,52 2,47 6,51 CV 4 % 8 % 7 % 13 % 8 % 3 % 11 % 5

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