QUANTA Lite TM h-ttg Screen Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata

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1 QUANTA Lite TM h-ttg Screen Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata Finalità d uso Il test QUANTA Lite TM h-ttg Screen è un dosaggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per la determinazione semiquantitativa degli anticorpi IgA e IgG contro transglutaminasi tissutale umana (h-ttg) nel siero umano. La presenza di questi anticorpi, unitamente ai risultati clinici e ad altri esami di laboratorio, può agevolare la diagnosi di celiachia con o senza deficit di IgA nonché della dermatite herpetiforme. Riassunto e Spiegazione del test La malattia celiaca o enteropatia sensibile al glutine è una condizione cronica i cui sintomi principali comprendono infiammazione ed un caratteristico appiattimento istologico della mucosa intestinale con conseguente sindrome da malassorbimento. L eziologia esatta di questa malattia rimane sconosciuta ma la gliadina, o la frazione solubile in alcool del glutine di grano rappresenta chiaramente l agente tossico. 1 Originariamente, per diagnosticare la celiachia e le patologie correlate venivano eseguite una serie di biopsie intestinali multiple. Negli ultimi anni è stato consigliato di utilizzare dei test sierologici per lo screening dei pazienti con sospetta enteropatia sensibile al glutine come pure per controllare la corretta osservanza delle regole dietetica. 2-5 La European Society of Pediatric Gastroenterology and Nutrition (ESPGAN) ha raccomandato l uso di marker sierologici come la presenza di anticorpi anti-gliadina come pure anti-reticolina ed anti-endomisio per ridurre il numero di biopsie intestinali necessarie per la diagnosi. 6 L antigene endomisiale è stato identificato come l enzima legante la proteina noto come transglutaminasi tissutale (ttg). 7,8 Le procedure ELISA specifiche per l antigene che incorporano il ttg costituiscono un alternativa affidabile e obiettiva ai tradizionali dosaggi basati sulle metodiche a immunofluorescenza che incorporano sezioni sottili di esofago di primati come substrato La procedura ELISA può essere adattata a grosse o piccole quantità di campioni di pazienti. Nel corso degli ultimi due anni, l antigene umano ttg è stato prodotto mediante tecnologia ricombinante. L'antigene umano ricombinante può avere determinati vantaggi rispetto al più tradizionale antigene epatico di cavia. 9,10,13 Due sviluppi più recenti nella sierologia del morbo celiaco sono l uso della transglutaminasi tissutale umana nativa isolata dai globuli rossi e l'uso di test in grado di individuare transglutaminasi tissutali di glasse IgG. L uso di ttg umana nativa isolate dai globuli rossi al posto dell antigene di cavia o umano derivato ricombinante presenta il vantaggio della semplicità di purificazione e consente di ottenere preparazioni prive di proteine di batteri, di insetti o altre proteine contaminanti. 14,15,16,17 I dosaggi ELISA che utilizzano come antigene la ttg umana presentati in letteratura sembrano funzionare bene rispetto ai più tradizionali test basati sull antigene di cavia. 9,10,13-16 I kit di anticorpi anti-gliadina di classe IgG sono ormai usati da tempo, prevalentemente come ausilio nella valutazione dei soggetti con deficit delle IgA. Numerosi ricercatori hanno dimostrato l utilità clinica del rilevamento degli anticorpi di classe IgT anti-ttg. 10,13,14 In uno studio, la sensibilità del test è aumentata dal 91,5% per l anticorpo IgA da solo al 98,5% quando sono stati considerati i risultati sia di IgA che di IgG. 10 La dermatite herpetiforme (DH) è una malattia della pelle che, come la celiachia, è causata dall ingestione di glutine di grano. La maggior parte dei pazienti con DH presenta atrofia dei villi del digiuno identica a quella riscontrata nella celiachia e una dieta rigida priva di glutine determina un miglioramento delle lesioni sia intestinali sia cutanee. 18,19 Gli attuali metodi sierologici come i test EMA e ttg evidenziano prestazioni deludenti quando usati per la DH, con sensibilità che variano dal 60 al 75% 20,21 rispetto alle sensibilità pari al 95% e superiori riferite per la celiachia. Il test QUANTA Lite TM h-ttg Screen è un test di screening per gli anticorpi rilevati nei soggetti con celiachia e per il disturbo sensibile dalla dermatite herpetiforme. Consente di rilevare simultaneamente gli anticorpi IgA e IgG rispetto a un peptide sintetico selettivamente deamidato e alla h-ttg e consente di rilevare la celiachia anche in presenza di un coesistente deficit IgA. Principio della Metodica Transglutaminasi tissutale umana nativa si legano ai pozzetti di una piastra a micropozzetti in polistirene in condizioni che consentono la conservazione degli antigeni allo stato nativo. I controlli pre-diluiti ed i sieri diluiti dei pazienti vengono distribuiti nei pozzetti corrispondenti, consentendo agli anticorpi h-ttg IgA o IgG eventualmente presenti di legarsi all antigene adsorbito. L eccesso di campione non legato viene allontanato mediante il lavaggio e successivamente si aggiunge a ciascun pozzetto un anticorpo anti-iga e IgG umane marcato con un enzima. Una seconda incubazione consente agli anticorpi anti-iga e IgG umane marcati con l enzima di legarsi agli anticorpi del paziente che si sono eventualmente legati alla parete dei pozzetti. Dopo ulteriore lavaggio per allontanare l eccesso di anticorpi anti-iga e IgG umane marcati con l enzima, l attività dell enzima rimasto viene misurata aggiungendo un substrato cromogenico e misurando l intensità del colore che si sviluppa. Il test può essere letto mediante uno spettrofotometro ed interpretato confrontando l intensità del colore che si sviluppa nei pozzetti dei campioni con quella dei pozzetti dei controlli. Reagenti 1. Piastra ELISA di micropozzetti di polistirene rivestita con transglutaminasi tissutale umana purificata (12-1 x 8 pozzetti), con supporto, in busta chiusa contenente materiale essicante 2. Controllo ELISA Negativo, 1 flacone di tampone contenente conservante e siero umano senza anticorpi umani IgA o IgG anti-h-ttg, prediluito, 1,2mL 3. Controllo ELISA fortemente positivo per h-ttg Screen 1 flacone di tampone contenente conservante ed IgA e IgG umane anti-h-ttg, prediluito, 1,2mL 4. Controllo ELISA debolmente positivo per h-ttg Screen, 1 flacone di tampone contenente conservante ed IgA e IgG umane anti-h-ttg, prediluito, 1,2mL 5. Diluente per campioni HRP, 1 flacone di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween 20, stabilizzatori delle proteine e conservante, 50mL 6. Soluzione di lavaggio HRP Concentrata, 1 flacone di soluzione concentrata 40x di colore rosso contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris e Tween 20, 25mL. Vedi la Sezione Metodi per le istruzioni sulla diluizione. 7. Coniugato HRP h-ttg IgG/IgA, (montone), anti-igg e IgA umane, 1 flacone incolore contenente tampone, stabilizzatori delle proteine e conservante, 10mL 8. Cromogeno TMB, 1 flacone contenente stabilizzatori, 10mL 9. Soluzione di arresto HRP, Acido solforico 0,344M, 1 flacone incolore, 10mL 1

2 Avvertenze 1. ATTENZIONE: Questo prodotto contiene un composto chimico (cloramfenicolo allo 0,02%) nel diluente per i campioni, nei controlli e nel coniugato, noto allo Stato della California come causa di tumori. 2. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-hiv, per HBsAg e per anticorpi anti-hcv mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre le certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controlli ELISA fortemente positivo, ELISA debolmente positivo ed ELISA Negativo devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. 4. Il Coniugato HRP contiene un composto chimico velenoso/corrosivo, che può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 5. Il Cromogeno TMB contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. 6. La Soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. Evitare l esposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L acido solforico è velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 7. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 8. I reagenti eventualemente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili. 3. Un lavaggio incompleto o non efficiente e l insufficiente aspirazione del liquido dai pozzetti ELISA può causare una scarsa precisione e/o un elevato background. 4. L adattamento di questo test all uso con apparecchiature automatiche e altri dispositivi per trattamento dei campioni liquidi, in toto o in parte, può causare differenze nei risultati rispetto a quelli ottenuti mediante la procedura manuale. E responsabilità di ciascun Laboratorio confermare che le procedure automatizzate utilizzate diano risultati entro limiti di accettabilità. 5. Una serie di fattori influenza le prestazioni del test. Essi comprendono l iniziale temperatura dei reagenti, la temperatura dell ambiente, l accuratezza e la riproducibilità della tecnica di pipettamento, la scrupolosità delle operazioni di lavaggio e di aspirazione del liquido dai pozzetti delle ELISA, il tipo di spettrofotometro usato per leggere i risultati e la lunghezza dei tempi di incubazione durante l esecuzione del test. Bisogna prestare molta attenzione alla costanza per ottenere risultati accurati e riproducibili. 6. Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite. 7. Una chiusura incompleta della busta richiudibile contenente le strisce di pozzetti ed il materiale essicante causa la degradazione dell antigene ed una scarsa precisione nei risultati. 8. Valori di assorbanza inaccettabilmente bassi possono essere osservati dopo aver usato due o più volte lo stesso flacone di coniugato HRP per un certo periodo di tempo. E importante seguire attentamente le istruzioni fornite per il trattamento del coniugato HRP per evitare tale inconveniente. 9. Un eventuale contaminazione chimica del coniugato HRP può essere conseguenza di una impropria pulizia o risciacquo di apparecchi o di strumenti. Residui di comuni reagenti chimici di laboratorio quali formalina, candeggina, etanolo o detergenti causano la degradazione nel tempo del coniugato HRP. Risciacquare molto accuratamente tutti gli apparecchi e gli strumenti dopo l uso di detergenti chimici. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. 2. Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile contenente il materiale essicante e conservate nella busta ben chiusa a 2-8 C. 3. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 1 settimana a 2-8 C. Raccolta dei campioni Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L aggiunta al campione di sodio azide o di altri conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l uso di sieri fortemente emolizzati o lipemici. Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A3 dell CLSI (NCCLS) raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) conservare i campioni a temperatura ambiente per non più di 8 ore; 2) se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8 C; 3) se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a -20 C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati. 23 Procedura Materiali forniti 1 Piastra microtiter ELISA h-ttg Screen (12-1 x 8 pozzetti), con supporto 1 1,2mL Controllo ELISA Negativo prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA debolmente positivo h-ttg Screen prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA fortemente positivo h-ttg Screen prediluito 1 50mL Diluente per campioni HRP 1 25mL Soluzione di lavaggio HRP concentrata, 40x concentrata 1 10mL Coniugato HRP h-ttg IgG/IgA, (montone), anti-igg e IgA umane 1 10mL Cromogeno TMB 1 10mL Soluzione di arresto HRP, 0,344M Acido solforico 2

3 Materiali richiesti ma non forniti Micropipette in grado di erogare volume di 5, 100, e 500µL Puntali monouso per micropipette Provette per la diluizione dei sieri, volume 4mL Acqua distillata o deionizzata Beuta da 1L per diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata Lettore per piastre ELISA in grado di leggere a 450nm (e 620nm per le letture a doppia lunghezza d onda) Metodica Prima di incominciare 1. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26 o C) e mescolarli bene. 2. Diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone fornito con il kit a 975mL di acqua distillata o deionizzata. Se non si usa l intera piastra in una sola volta, si può preparare una minore quantità di soluzione di lavaggio aggiungendo 2,0mL di concentrato a 78mL di acqua distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 1 settimana a 2-8 o C. 3. Preparare una diluizione 1:101 di ciascun campione da testare aggiungendo 5µL di siero a 500µL di Diluente per campioni HRP. I campioni diluiti devono essere testati entro 8 ore dalla preparazione. NON DILUIRE i Controllo ELISA debolmente positivo h-ttg Screen, ELISA fortemente positivo h-ttg Screen ed ELISA Negativo. 4. La determinazione della presenza o dell assenza di anticorpi h-ttg della classe IgG e/o IgA usando unità arbitrarie richiede due pozzetti per ciascuno dei tre controlli ed uno o due pozzetti per ciascun campione clinico. Si raccomanda di testare i campioni in duplicato. Esecuzione del test 1. TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26 C) PRIMA DI INIZIARE IL TEST. Posizionare i pozzetti/le strisce necessarie nel supporto. Rimettere immediatamente le strisce inutilizzate nella busta contenente il materiale essicante e sigillarla bene per minimizzare l esposizione all umidità ambientale. 2. Distribuire 100µL dei Controllo ELISA debolmente positivo h-ttg Screen, ELISA fortemente positivo h-ttg Screen ed ELISA Negativo prediluiti e dei sieri diluiti nei rispettivi pozzetti. Coprire i pozzetti ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione inizia dopo l aggiunta dell ultimo campione. 3. Lavaggio: Aspirare completamente il contenuto di ciascun pozzetto. Distribuire µL di soluzione di lavaggio HRP diluita in tutti i pozzetti e quindi aspirarla. Ripetere questa operazione per altre due volte, per un totale di tre lavaggi. Dopo l ultimo lavaggio capovolgere la piastra e scuoterla fermamente su tovaglioli di carta assorbente per rimuovere eventuali residui di liquido. E importante vuotare completamente ciascun pozzetto dopo ciascun lavaggio. Per l aspirazione mantenere la stessa sequenza usata per l aggiunta dei campioni. 4. Distribuire 100μL di Coniugato HRP h-ttg IgG/IgA in ciascun pozzetto. Il coniugato dovrebbe essere prelevato dal flacone mediante tecniche sterili. Prelevare dal flacone solo la quantità di coniugato necessaria per l esecuzione del test. PER EVITARE POSSIBILI CONTAMINAZIONI MICROBICHE E/O CHIMICHE, NON RIMETTERE MAI IL CONIUGATO INUTILIZZATO NEL FLACONE. Incubare i pozzetti per 30 minuti come descritto al punto Lavaggio: Ripetere la procedura descritta la punto Distribuire 100µL di Cromogeno TMB in ciascun pozzetto ed incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. 7. Distribuire 100µL di Soluzione di arresto HRP in ogni pozzetto. Per l aggiunta della Soluzione di arresto HRP mantenere la stessa sequenza e gli stessi tempi utilizzati per l aggiunta del Cromogeno TMB. Agitare gentilmente la piastra con le dita per mescolare completamente i reagenti nei pozzetti. 8. Leggere l assorbanza (OD) di ciascun pozzetto a 450nm entro 1 ora dall aggiunta della soluzione di arresto. Se si preferisce una lettura a doppia lunghezza d onda, si può usare la lunghezza d onda di 620nm come riferimento. Controllo di qualità 1. I Controlli ELISA debolmente positivo h-ttg Screen, ELISA fortemente positivo h h-ttg Screen ed ELISA Negativo devono essere inclusi ogni volta che si esegue il test per assicurare che tutti i reagenti ed il test funzionino in modo corretto. 2. Si deve notare che poichè i Controlli ELISA debolmente positivo h-ttg Screen, ELISA fortemente positivo h-ttg Screen II ed ELISA Negativo sono prediluiti, essi non rappresentano un controllo procedurale per le tecniche di diluizione utilizzate per i campioni. 3. Ulteriori controlli possono essere inclusi in base alle indicazioni o alle richieste delle vigenti regolamentazioni o delle organizzazioni di accreditamento. Ulteriori sieri di controllo possono essere preparati raccogliendo in un pool dei sieri umani, aliquotandolo e conservandolo a < -20 C. 4. Perchè i risultati del test siano considerati validi, tutti i seguenti criteri devono essere soddisfatti. Se anche uno solo non rientra nei valori specificati, i risultati non dovrebbero essere considerati validi ed il test dovrebbe essere ripetuto. a. L assorbanza del Controllo ELISA fortemente positivo h-ttg Screen prediluito deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA debolmente positivo h-ttg Screen prediluito che a sua volta deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA Negativo prediluito. b. Il Controllo ELISA fortemente positivo h-ttg Screen prediluito deve avere un assorbanza maggiore di 1,0 mentre l assorbanza del Controllo ELISA Negativo prediluito non deve essere maggiore di 0,2. c. L assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo h-ttg Screen deve essere maggiore di due volte rispetto a quella del Controllo ELISA Negativo oppure > 0,25. d. Il Controllo ELISA Negativo ed il Controllo ELISA fortemente positivo h-ttg Screen servono per controllare un eventuale malfunzionamento dei reagenti. Il Controllo ELISA fortemente positivo h-ttg Screen non assicura la precisione in corrispondenza del valore soglia del test. e. L utente del test dovrebbe fare riferimento al Documento C24-A3 dell CSLI (NCCLS) per ulteriori informazioni su appropriate tecniche di Controllo di Qualità. 24 3

4 Calcolo dei risultati Si deve determinare innanzitutto il valore medio di assorbanza per ciascun set di duplicati. La reattività di ciascun campione viene quindi calcolata dividendo il valore medio di assorbanza del campione per il valore medio di assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo h-ttg Screen e moltiplicando il risultato per il numero di unità assegnate al Controllo ELISA debolmente positivo h-ttg Screen, che è stampato sull etichetta del flacone. Assorbanza campione Valore del campione = x Valore Controllo ELISA debolmente positivo (unità) Assorbanza Controllo ELISA h-ttg Screen (unità) debolmente positivo h-ttg Screen La reattività è collegata in modo non lineare alla quantità di anticorpi presente. Mentre gli aumenti e le diminuzioni delle concentrazioni degli anticorpi vengono evidenziate da un corrispondente aumento o diminuzione della reattività, il cambiamento non è proporzionale (ad es., un raddoppio della concentrazione di anticorpi non raddoppia necessariamente la reattività). Se si desidera una più accurata quantificazione del contenuto di anticorpi, si possono allestire e testare diluizioni seriate del campione. Interpretazione dei risultati Ciascun Laboratorio dovrebbe stabilire il proprio range di normalità basato sulla procedura da esso utilizzata, sui controlli, sull apparecchiatura e sulla popolazione di pazienti secondo le proprie metodiche standard. Il campione può essere quindi classificato come negativo o positivo in base alla seguente tabella. Unità Negativo <20 Positivo >20 1. Un risultato positivo indica la presenza di anticorpi anti-h-ttg IgG e/o IgA e suggerisce la possibilità della presenza di determinate enteropatie sensibili al glutine come la malattia celiaca e dermatite herpetiforme. Se occorre la conferma del deficit IgA, il campione deve essere testato utilizzando un test IgA quantitativo. 2. Un risultato negativo indica l assenza di h-ttg IgG o IgA anticorpi oppure la loro presenza a livelli inferiori al limite di sensibilità del metodo. 3. Sul referto si dovrebbe riportare la seguente frase: I seguenti risultati sono stati ottenuti mediante il test QUANTA Lite TM h-ttg Screen ELISA della INOVA. I valori h- ttg Ig G/A ottenuti con test prodotti da altre Ditte possono non essere utilizzabili in modo intercambiabile. Il livello di anticorpi determinato con questo metodo non può essere correlato ad un titolo end-point. Limitazioni del test 1. Un risultato negativo in un paziente non trattato non esclude totalmente l enteropatia glutine-sensibile. 2. Sono possibili falsi positivi (livelli di anticorpi elevati senza riscontri istologici caratteristici). Raramente altri disturbi gastrointestinali e campioni normali possono avere anticorpi che reagiscono all antigene DGP. Altri test sierologici celiaci specifici come il test endomisiale (EMA) e peptidi di gliadina deamidati (DGP) possono essere eseguiti per confermare i risultati positivi. Inoltre, è possibile misurare i livelli sierici di IgA per verificare il deficit di IgA. 3. Questo test determina simultaneamente gli anticorpi IgA e IgG. Se si preferisce la determinazione singola di anticorpi IgA o IgG specifici, INOVA offre a questo scopo kit ELISA separati per IgA e IgG (QUANTA Lite TM h-ttg IgA e QUANTA Lite TM h-ttg IgG). 4. I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e del risultato degli altri test sierologici. 5. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero. 6. Le prestazioni di questo test non sono state definite per la popolazione pediatrica. Range normale 381 soggetti sani e asintomatici casuali e residenti negli USA sono stati sottoposti a test per determinare la presenza di anticorpi anti-h-ttg. Di questi, 269-nove donatori avevano un età compresa fra i 14 ed i 78 anni e comprendevano 141 uomini e 128 donne. 8 campioni (2,1%) erano al di sopra del valore soglia di 20 unità. 7 campioni sono risultati positivi con valori di 20,3, 20,4, 22,1, 22,6, 23,3, 28,4 e 32,4 unità. Gli ultimo positivi avevano 54,9 unità e sono stati ritenuti celiaci veri per il fatto che i risultati delle IgA h-ttg sono stati rispettivamente 72,4 unità. Il valore medio dei 381 campioni era di 8,6 unità. La deviazione standard dei campioni era di 4,4 unità. Il valore medio è di 2,5 deviazioni standard al di sotto del valore soglia di 20 unità. Caratteristiche specifiche delle prestazioni Confronto con i predicate device 125 campioni provenienti da 4 laboratori di riferimento per la celiachia sono stati testati internamente sui test ELISA QUANTA Lite TM h-ttg IgA e QUANTA Lite TM h-ttg IgG ELISAs e h-ttg Screen ELISA. I risultati, assieme ai 381 campioni normali, sono illustrati di seguito. Un campione è stato considerato positivo dai dispositivi di riferimento se c era un risultato positivo in uno dei 2 dispositivi di riferimento (non occorreva che il risultato fosse positivo in entrambi dispositivi di riferimento). Un campione è stato considerato negativo dai dispositivi di riferimento in presenza di un risultato negativo in tutti e tre le dei dispositivi di riferimento. QUANTA Lite TM h-ttg IgA o IgG Totale QUANTA Lite TM Positivi Negativi h-ttg Screen Positivi 52 13* 65 Negativi Totale Percentuale di accordo positivi: 52/52 (100%) 95% Intervallo di confidenza (CI): 93,2% a 100% Percentuale di accordo negativi: 441/454 (97,1%) 95% Intervallo di confidenza (CI): 95,2% a 98,5% Accordo generale: 493/506 (97,4%) 95% Intervallo di confidenza (CI): 96,7% a 99,1% 4

5 *Dei 13 campioni risultati positivi al test h-ttg Screen ma negativi a entrambi i kit h-ttg, 7 proven dallo studio normale. Degli altri 6 pazienti, tre sono pazienti celiaci che seguono una dieta senza glutine, due sono parenti di 1 grado e l'ultimo è sano. Tutti i 13 campioni hanno valori sotto le 30 unità. Studi Clinica I campioni clinicamente definiti come pazienti celiaci, pazienti celiaci con deficit di IgA, pazienti con celiachia latente, pazienti celiaci che seguivano una dieta priva di glutine, parenti di primo grado di un paziente celiaco, controlli con deficit di IgA, pazienti con dermatite herpetiforme oppure pazienti non celiaci sono stati sottoposti a test QUANTA Lite TM h-ttg Screen. Di seguito sono riepilogati i campioni definiti clinicamente e dei suddetti campioni compresi nell intervallo di normalità. Gruppo pazienti # Positivi h-ttg % Celiaco non trattati % Con mancanza della IgA celiaca % Celiaco su dieta priva di glutine % Parenti di 1 grado % Dermatite Herpetiforme % Malattia Controllo % Normali * 2,4% *1 dei 020 positivi sono risultati positivi ai dosaggi individuali h-ttg ELISA e positivi alla ttg mediante RIA in fase liquida. Prestazioni del test ELISA h-ttg Screen con diagnosi di celiachia: QUANTA LITE h- ttg Screen Diagnosi* Positivi (Celiaco non trattati e Con mancanza della IgA Negativi (Parenti di 1 grado, Malattia Controllo e Sano controllo) Totale Positivi Negativi Totale * Non include i 33 pazienti celiaci che seguivano una dieta priva di glutine. Sensibilità: 87,8% (36/41), 95% Intervallo di confidenza (CI): 73,8% a 95,9% Specificità: 97,1% (462/476), 95% Intervallo di confidenza (CI): 95,1% a 98,4% Sensibilità - Nel complesso, la sensibilità alla celiachia è calcolata raggruppando i risultati per tutti i pazienti celiaci tranne coloro che stanno già seguendo una dieta senza glutine. Il numero totale di celiaci o dermatite herpetiforme è 41 di cui 36 o il 87,8% sono positivi. Specificità - La specificità può essere calcolata raggruppando i 414 normali, i 44 controlli e i 18 parenti di primo grado. Questo gruppo comprende 476 campioni. Di questi, 14 campioni erano positivi con una specificità pari al 97,1%. Reazioni-crociate Per valutare i problemi potenziali di reattività-crociata con altri autoanticorpi, sono stati analizzati diversi campioni positivi di autoanticorpi di titolo elevato con il kit QUANTA Lite TM h-ttg Screen. In totale sono stati analizzati 44 campioni. Molti dei campioni erano controlli altamente positivi di altri kit di test sugli autoanticorpi INOVA QUANTA Lite TM. Le specificità Chromatin (4), Centromere (4), GBM (4), SS-B (4), RNP (5), Scl-70 (6), Jo-1 (5), Sm (4), SS-A (4) e TPO (4). Il valore medio di questi 44 campioni era di 5,27 unità. Tutti i campioni erano negativi al test QUANTA Lite TM h-ttg Screen. Il valore medio è di 4,6 deviazioni standard al di sotto del valore soglia di 20 unità. Precisione all interno del laboratorio Le prestazioni del kit QUANTA Lite TM h-ttg Screen sono state valutate fra i test analizzando ciascuno dei 9 campioni per 5 volte. Questo test è stato eseguito da un singolo operatore presso INOVA Diagnostics utilizzando un lotto di kit. I risultati sono indicato nella riportata di seguito. Prestazioni intra-test del test ELISA QUANTA Lite TM h-ttg Screen Unità medie 44,3 32,6 46,8 22,3 36,1 13,5 18,3 19,1 7,7 Deviazione standard 1,6 1,5 0,5 1,3 0,4 0,8 0,5 0,4 0,6 Coefficiente di variazione% 3,5 4,7 1,2 5,8 1,5 5,6 2,6 2,1 7,2 Le prestazioni inter-dosaggio sono state valutate testando, in doppio, sono stati eseguiti un pannello di 12 campioni 6 volte nell arco di 5 giorni. Questo test è stato eseguito da un singolo operatore presso INOVA Diagnostics utilizzando un lotto di kit. Di seguito viene presentato un riepilogo dei risultati dello studio. Prestazioni inter-test del test ELISA QUANTA Lite TM h-ttg Screen Unità medie 46,4 31,3 48,7 23,0 35,0 14,5 16,0 6,0 10,3 49,3 17,8 5,2 Deviazione standard 1,4 1,6 1,1 1,1 3,3 0,9 1,8 1,1 1,9 1,3 1,8 0,8 Coefficiente di variazione% 3,0 5,2 2,2 4,8 9,3 6,1 11,3 18,0 18,4 2,6 10,3 15,4 5

6 Variazione fra i lotti La variazione fra i lotti è stata eseguita presso INOVA Diagnostics da 2 operatori diversi utilizzando tre lotti di kit diversi in tre giorni diversi. Di seguito viene presentato un riepilogo dei risultati dello studio. Campione Lotto 1 Lotto 2 Lotto 3 Unità medie Std Dev %CV Alto Positivi Controllo 78,48 97,51 98,61 91,5 11,3 12,4 Positivi 1 55,29 48,11 48,56 50,7 4,0 7,9 Positivi 2 35,71 38,77 33,93 36,1 2,4 6,8 Positivi 3 131,67 142,89 148,41 141,0 8,5 6,1 Positivi 4 53,33 62,97 64,84 60,4 6,2 10,2 Positivi 5 56,38 54,42 45,23 52,0 6,0 11,5 Positivi 6 39,71 47,76 44,67 44,0 4,1 9,2 Positivi 7 20,29 23,81 21,51 21,9 1,8 8,2 Positivi 8 12,67 13,32 15,61 13,9 1,5 11,1 Reagente Spazio in bianco 1,67 1,19 2,77 1,9 0,8 43,2 Negativi Controllo 1,48 1,14 2,57 1,7 0,7 43,1 Negativi 1 10,52 12,92 15,76 13,1 2,6 20,1 Negativi 2 11,24 18,54 18,79 16,2 4,3 26,5 Negativi 3 7,71 12,33 15,30 11,8 3,8 32,4 Negativi 4 7,62 8,35 11,96 9,3 2,3 25,0 6

7 Bibliografia 1. Trier JS: Celiac Sprue. New England Journal of Medicine 325: , Troncone R and Ferguson A: Antigliadin antibodies. J Pediatr Gastroenterol Nutr 12: , McMillan SA, Haughton DJ, et al.: Predictive value for celiac disease of antibodies to gliadin, endomysium and jejunum in patients attending for jejunal biopsy. BMJ 303: , Lindh E, Ljunghall S, et al.: Screening for antibodies against gliadin in patients with osteoporosis. Journal of Internal Medicine 241: , Burgin-Wolff A, Gaze H, et al.: Antigliadin and antiendomysium antibody determination for celiac disease. Arch Dis Child 66: , Working Group of European Society of Paediatric Gastroenterology and Nutrition. Revised criteria for diagnosis of celiac disease. Arch Dis Child 65: , Dieterich W, Ehnis T, Bauer M, et al.: Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of celiac disease. Nature Medicine 3: , Sollid LM, Molberg O, McAdam S, Lundin K, et al.: Autoantibodies in celiac disease: tissue transglutaminase guilt by association? Gut 41: , Beutner EH, et al. A case of dermatitis herpetiformis with IgA endomysial antibodies but negative direct immunofluorescent findings. J Am Acad Dermatol 43: 329, Sardy M, et al.: Recombinant human tissue transglutaminase ELISA for the diagnosis of gluten-sensitive enteropathy. Clin Chem 45: 2142, Sblattero D, et al.: Human recombinant tissue transglutaminase ELISA : an innovative diagnostic assay for celiac disease. Am J Gastroenterology 95: 1253, Sugai E, et al.: Tissue transglutaminase antibodies in celiac disease: assessment of a commercial kit. Am J Gastro 95: , Lampasona V, et al.: Tissue transglutaminase and combined screening for celiac disease and type 1 diabetesassociated autoantibodies. Lancet 352: , Hansson T, et al.: Antibody reactivity against human and guinea pig tissue transglutaminase in children with celiac disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 30: 379, Andersson AS, et al.: Inhibition of endomysial staining with human tissue transglutaminase. Ninth International Symposium on Celiac Disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 31: S16, Axiö-Frekricksson UB, et al.: Differences in human and guinea pig tissue transglutaminase. Ninth International Symposium on Celiac Disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 31: S16, Signorini M, et al.: Human erythrocyte transglutaminase: Purification and preliminary characterization. Biological Chemistry 369: 275, Stober W: Gluten-sensitive enterophy: A nonallergic immune hypersensitivity of the gastrointestional tract. J. Allergy Clin. Immunol. July , Smecuol E, et al.: Permeability, Zonulin Production, and Enteropathy in Dermatitis Herpetiformis. Clinical Gastroenterology and Hepatology 3: , Beutner EH, et al.: Sensitivity and Specificity of IgA-class antiendomysial antibodies for dermatitis herpetiformis and findings relevant to their pathogenic significance. Journal of the American Academy of Dermatology 15: , Porter WM, et al.: Tissue Transglutaminase Antibodies in Dermatitis Herpetiformis Correspondence. Gastroenterology 117: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, Fifth Edition, CLSI (NCCLS). Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guidline-Third Edition. CLSI Document H18-A3, Vol 24(38), CLSI (NCCLS). Statistical Quality Control for Quantitative Measurement Procedures: Principles and Definitions; Approved Guideline- 3rd edition NCCLS Document C24-A3, Vol. 26(25), Fornitore: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Rappresentante Autorizzato: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service April 2008 Revision ITA0 7