QUANTA Lite TM SLA Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata

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1 QUANTA Lite TM SLA Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata Finalità d uso Il QUANTA Lite TM SLA (antigene solubile epatico) è un saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per la rilevazione semi-quantitativa degli anticorpi anti SLA della classe IgG nel siero umano. La presenza di anticorpi anti SLA può essere utilizzata, assieme ai riscontri clinici e ad altri test di laboratorio, come ausilio nella diagnosi di malattie che presentano livelli elevati di anticorpi anti SLA inclusa l epatite autoimmune (EAI). Riassunto e Spiegazione del test L epatite autoimmune (EAI) è una malattia infiammatoria epatica cronica, progressiva ed eterogenea d eziologia ignota 1-6. La diagnosi è spesso difficile dato che non esiste un esame diagnostico specifico ed i sintomi possono essere molto variati 1-6. Per arrivare alla diagnosi si valutano i sintomi ed i segni clinici ed i risultati degli esami di laboratorio ed istologici e si escludono le altre cause di epatite cronica 1-6. La diagnosi risulta particolarmente difficoltosa nei pazienti affetti da epatite classificata come criptogenetica, descritti come affetti da epatite cronica indefinita con assenza di anticorpi diretti verso i virus e negatività ai marker convenzionali rilevatori di autoimmunità 1-2. La diagnosi precoce di epatite autoimmune e la terapia immunosoppressiva sono essenziali ai fini della prevenzione di gravi danni epatici. Purtroppo il fatto che non esista un test specifico può portare con notevole ritardo alla diagnosi ed alla terapia e favorire la progressione della malattia 7-8. I pazienti affetti da EAI sono in genere suddivisi in due gruppi in base alla presenza di autoanticorpi specifici 1-6,9,10. La EAI di tipo 1 (detta anche classica, cronica attiva, lupoide, plasmacellulare o epatite cronica attiva autoimmune) è il tipo di EAI più comune. L EAI-1 è caratterizzata dalla presenza di anticorpi citoplasmatici antinucleo, anti-muscolo liscio (diretti sia contro le componenti actiniche che verso le non actiniche) ed anti-neutrofili 1,4,6. La EAI di tipo 2 è caratterizzata da anticorpi anti microsomi epatici e renali (LKM-1) diretti principalmente contro il citocromo P450 2D6 e l antigene del citosol anti-epatico (LC-1) 4,6,11. I pazienti affetti da EAI-1 non presentano anticorpi anti LKM-1 ed anti LC1. Nel 1987 sono stati identificati, in 23 pazienti affetti da epatite cronica negativi all HbsAg, agli ANA ed agli LKM-1, anticorpi diretti contro un antigene solubile epatico del citosol (SLA) 12. In alcuni pazienti affetti da EAI si sono trovati degli anticorpi diretti verso un altra proteina epatica solubile del citosol denominata antigene epato-pancreatico (LP) 12. Ora si sa che gli anticorpi anti SLA ed anti LP hanno come bersaglio lo stesso antigene 13. L SLA è una proteina di circa 50 kda omologa al 99% ad una proteina associata al trna soppressore UGA che potrebbe essere coinvolta nel metabolismo della selenocisteina La citocheratina 8, la citocheratina 18, e la glutatione S-transferasi sono state considerate quali bersagli principali della reattività SLA ma ciò non è stato dimostrato da nessuno studio successivo 14, Sebbene solo il 12-30% dei pazienti affetti da EAI presentino anticorpi anti SLA, la loro presenza indica in quasi il 100% dei casi specificità per la EAI 8,10,14, È stato stimato che il 70-80% dei pazienti affetti da EAI presentano anticorpi ANA e/o anti SMA ed una percentuale ridotta di pazienti presenta anticorpi anti-lkm-1. Circa il 10-30% dei pazienti con segni clinici di EAI non presenta titoli significativi di anticorpi verso nessuno di questi marker 1,2,7,12. Al momento, l unica indicazione di EAI in questi pazienti può essere la risposta terapeutica agli antiinfiammatori 1,2. Gli anticorpi anti SLA sono stati riscontrati nel 14-20% dei pazienti affetti da epatite criptogenetica 13,19,20. L analisi SLA potrebbe quindi essere di ausilio nello stabilire una diagnosi certa di EAI e contenere i danni dovuti alla progressione della malattia instaurando una terapia adeguata. È fondamentale riconoscere la EAI perché il trattamento varia considerevolmente da quello dell epatite virale. La terapia immunosoppressiva instaurata in caso di EAI può essere molto nociva in pazienti con epatite virale, e la terapia con interferon può causare un peggioramento dell EAI 21. È stata considerata la classificazione di un terzo tipo di EAI basandosi principalmente sulla presenza di anticorpi SLA ma si ritiene che ciò non sia necessario 4,6,9,19. I pazienti affetti da EAI-1 positivi per gli anticorpi SLA presentano riscontri clinici, istologici e di laboratorio molto simili ai pazienti affetti da EAI-1 non-sla positivi 9,10,19. Malgrado ciò si è notato che i pazienti SLA positivi hanno un associazione con l HLA DR3 ed hanno inclinazione ad avere ricadute dopo la sospensione della terapia con corticosteroidi 22. Esistono delle varianti di EAI nelle quali i pazienti presentano una overlap syndrome, copresenza di caratteristiche dell EAI e della cirrosi biliare primaria (PBC) o della colangite sclerosante primaria (PSC). Queste sindromi, così come la colangite autoimmune (AIC), una definizione proposta per descrivere una malattia che presenta caratteristiche istopatologiche simili alla PBC in assenza di anticorpi anti-mitocondrio (AMA) 1-3,5, può presentare un problema di diagnosi e di gestione della malattia. Principio della Metodica Dell antigene SLA umano intero, ricombinante, parzialmente purificato è adsorbito sulla parete dei pozzetti di una piastra in polistirene in una maniera che conserva l antigene nel suo stato nativo. I controlli pre-diluiti ed i sieri diluiti dei pazienti vengono distribuiti nei pozzetti corrispondenti, consentendo agli anticorpi anti-sla eventualmente presenti di legarsi all antigene adsorbito. L eccesso di campione non legato viene allontanato mediante il lavaggio e successivamente si aggiunge a ciascun pozzetto un anticorpo anti-igg umane marcato con un enzima. Una seconda incubazione consente agli anticorpi anti-igg umane marcati con l enzima di legarsi agli anticorpi del paziente che si sono eventualmente legati alla parete dei pozzetti. Dopo ulteriore lavaggio per allontanare l eccesso di anticorpi anti-igg umane marcati con l enzima, l attività dell enzima rimasto viene misurata aggiungendo un substrato cromogenico e misurando l intensità del colore che si sviluppa. Il test può essere letto mediante uno spettrofotometro ed interpretato confrontando l intensità 1

2 del colore che si sviluppa nei pozzetti dei campioni con quella dei pozzetti dei controlli. \ Reagenti 1. Piastra microtiter ELISA in polistirene adsorbita con dell antigene SLA umano intero, ricombinante, parzialmente purificato (12-1 x 8 pozzetti), con supporto, in busta chiusa contenente materiale essicante 2. Controllo ELISA Negativo, 1 flacone di tampone contenente conservante e siero umano senza anticorpi umani ricombinante SLA, prediluito, 1,2mL 3. Controllo ELISA fortemente positivo per SLA, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi a ricombinante SLA, prediluito, 1,2mL 4. Controllo ELISA debolmente positivo per SLA, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi a ricombinante SLA, prediluito, 1,2mL 5. Diluente per campioni HRP, 1 flacone di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween 20, stabilizzatori delle proteine e conservante, 50mL 6. Soluzione di lavaggio HRP Concentrata, 1 flacone di soluzione concentrata 40x di colore rosso contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris e Tween 20, 25mL. Vedi la Sezione Metodi per le istruzioni sulla diluizione. 7. Coniugato HRP IgG, (montone), anti-igg umane, 1 flacone di colore blu contenente tampone, stabilizzatori delle proteine e conservante, 10mL 8. Cromogeno TMB, 1 flacone contenente stabilizzatori, 10mL 9. Soluzione di arresto HRP, Acido solforico 0,344M, 1 flacone incolore, 10mL Avvertenze 1. ATTENZIONE: Questo prodotto contiene un composto chimico (cloramfenicolo allo 0,02%) nel diluente per i campioni, nei controlli e nel coniugato, noto allo Stato della California come causa di tumori. 2. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-hiv, per HbsAg e per anticorpi anti- HCV mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controlli ELISA fortemente positivo SLA, ELISA debolmente positivo SLA ed ELISA Negativo devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. 4. Il Coniugato HRP contiene un composto chimico velenoso/corrosivo, che può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 5. Il Cromogeno TMB contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. 6. La Soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. Evitare l esposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L acido solforico è velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 7. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 8. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili. 3. Un lavaggio incompleto o non accurato e l insufficiente aspirazione del liquido dai pozzetti ELISA può causare una scarsa precisione e/o un elevato background. 4. L adattamento di questo test all uso con apparecchiature automatiche e altri dispositivi per trattamento dei campioni liquidi, in toto o in parte, può causare differenze nei risultati rispetto a quelli ottenuti mediante la procedura manuale. E responsabilità di ciascun Laboratorio confermare che le procedure automatizzate utilizzate diano risultati entro limiti di accettabilità. 5. Una serie di fattori influenza le prestazioni del test. Essi comprendono l iniziale temperatura dei reagenti, la temperatura dell ambiente, l accuratezza e la riproducibilità della tecnica di pipettamento, la scrupolosità delle operazioni di lavaggio e di aspirazione del liquido dai pozzetti delle piastre ELISA, il tipo di spettrofotometro usato per leggere i risultati e la lunghezza dei tempi di incubazione durante l esecuzione del test. Bisogna prestare molta attenzione alla costanza per ottenere risultati accurati e riproducibili. 6. Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite. 7. Una chiusura incompleta della busta richiudibile contenente le strisce di pozzetti ed il materiale essicante causa la degradazione dell antigene ed una scarsa precisione nei risultati. 8. Valori di assorbanza inaccettabilmente bassi possono essere osservati dopo aver usato due o più volte lo stesso flacone di coniugato HRP per un certo periodo di tempo. E importante seguire attentamente le istruzioni fornite per il trattamento del coniugato HRP per evitare tale inconveniente. 9. Un eventuale contaminazione chimica del coniugato HRP può essere conseguenza di una impropria pulizia o risciacquo di apparecchi o di strumenti. Residui di comuni reagenti chimici di laboratorio 2

3 quali formalina, candeggina, etanolo o detergenti causano la degradazione nel tempo del coniugato HRP. Risciacquare molto accuratamente tutti gli apparecchi e gli strumenti dopo l uso di detergenti chimici. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. 2. Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile contenente il materiale essicante e conservate nella busta ben chiusa a 2-8 C. 3. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 1 settimana a 2-8 C. Raccolta dei campioni Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L aggiunta al campione di sodio azide o di altri conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l uso di sieri fortemente emolizzati o lipemici. Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A2 dell NCCLS raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8 C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a -20 C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati. È opportuno evitare di congelare e scongelare i campioni troppe volte. Procedura Materiali forniti 1 Piastra microtiter ELISA SLA (12-1 x 8 pozzetti), con supporto 1 1,2mL Controllo ELISA Negativo prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA debolmente positivo SLA prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA fortemente positivo SLA prediluito 1 50mL Diluente per campioni HRP 1 25mL Soluzione di lavaggio HRP concentrata, 40x concentrata 1 10mL Coniugato HRP IgG, (montone), anti-igg umane 1 10mL Cromogeno TMB 1 10mL Soluzione di arresto HRP, 0,344M Acido solforico Materiali richiesti ma non forniti Micropipette in grado di erogare volume di 5, 100, e 500µL Puntali monouso per micropipette Provette per la diluizione dei sieri, volume 4mL Acqua distillata o deionizzata Beuta da 1L per diluite la Soluzione di lavaggio HRP concentrata Lettore per piastre ELISA in grado di leggere a 450nm (e 620nm per le letture a doppia lunghezza d onda) Metodica Prima di incominciare 1. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26 o C) e mescolarli bene. 2. Diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone fornito con il kit a 975mL di acqua distillata o deionizzata. Se non si usa l intera piastra in una sola volta, si può preparare una minore quantità di soluzione di lavaggio aggiungendo 2,0mL di concentrato a 78mL di acqua distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 1 settimana a 2-8 o C. 3. Preparare una diluizione 1:101 di ciascun campione da testare aggiungendo 5µL di siero a 500µL di Diluente per campioni HRP. I campioni diluiti devono essere testati entro 8 ore dalla preparazione. NON DILUIRE i Controllo ELISA debolmente positivo SLA, Controllo ELISA fortemente positivo SLA ed Controllo ELISA Negativo. 4. La determinazione della presenza o dell assenza di SLA usando unità arbitrarie richiede due pozzetti per ciascuno dei tre controlli ed uno o due pozzetti per ciascun campione clinico. Si raccomanda di testare i campioni in duplicato. Esecuzione del test 1. TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26 C) PRIMA DI INIZIARE IL TEST. Posizionare i pozzetti/le strisce necessarie nel supporto. Rimettere immediatamente la strisce inutilizzate nella busta contenente il materiale essicante e sigillarla bene per minimizzare l esposizione all umidità ambientale. 2. Distribuire 100µL dei Controlli ELISA debolmente positivo SLA, ELISA fortemente positivo SLA ed ELISA Negativo prediluiti e dei sieri diluiti nei rispettivi pozzetti. Coprire i pozzetti ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione inizia dopo l aggiunta dell ultimo campione. 3. Lavaggio: Aspirare completamente il contenuto di ciascun pozzetto. Distribuire µL di soluzione di lavaggio HRP diluita in tutti i pozzetti e quindi aspirarla. Ripetere questa operazione per altre due volte, per un totale di tre lavaggi. Dopo l ultimo lavaggio capovolgere la piastra e scuoterla 3

4 fermamente su tovaglioli di carta assorbente per rimuovere eventuali residui di liquido. E importante vuotare completamente ciascun pozzetto dopo ciascun lavaggio. Per l aspirazione mantenere la stessa sequenza usata per l aggiunta dei campioni. 4. Distribuire 100μL di Coniugato HRP IgG in ciascun pozzetto. Il coniugato dovrebbe essere prelevato dal flacone mediante tecniche sterili. Prelevare dal flacone solo la quantità di coniugato necessaria per l esecuzione del test. PER EVITARE POSSIBILI CONTAMINAZIONI MICROBICHE E/O CHIMICHE, NON RIMETTERE MAI IL CONIUGATO INUTILIZZATO NEL FLACONE. Incubare i pozzetti per 30 minuti come descritto al punto Lavaggio: Ripetere la procedura descritta al punto Distribuire 100µL di Cromogeno TMB in ciascun pozzetto ed incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. 7. Distribuire 100µL di Soluzione di arresto HRP in ogni pozzetto. Per l aggiunta della Soluzione di arresto HRP mantenere la stessa sequenza e gli stessi tempi utilizzati per l aggiunta del Cromogeno TMB. Agitare gentilmente la piastra con le dita per mescolare completamente i reagenti nei pozzetti. 8. Leggere l assorbanza (OD) di ciascun pozzetto a 450nm entro 1 ora dall aggiunta della soluzione di arresto. Se si preferisce una lettura a doppia lunghezza d onda, si può usare la lunghezza d onda di 620nm come riferimento. Controllo di qualità 1. I Controlli ELISA debolmente positivo SLA, ELISA fortemente positivo SLA ed ELISA Negativo devono essere inclusi ogni volta che si esegue il test per assicurare che tutti i reagenti ed il test funzionino in modo corretto. 2. Si deve notare che, poichè i Controlli ELISA debolmente positivo SLA, ELISA fortemente positivo SLA ed ELISA Negativo sono prediluiti, essi non rappresentano un controllo procedurale per le tecniche di diluizione utilizzate per i campioni. 3. Ulteriori controlli possono essere inclusi in base alle indicazioni o alle richieste delle vigenti regolamentazioni o delle organizzazioni di accreditamento. Ulteriori sieri di controllo possono essere preparati raccogliendo un pool dei sieri umani, aliquotandolo e conservandolo a < -20 C. 4. Perchè i risultati del test siano considerati validi, tutti i seguenti criteri devono essere soddisfatti. Se anche uno solo non rientra nei valori specificati, i risultati non dovrebbero essere considerati validi ed il test dovrebbe essere ripetuto. a. L assorbanza del Controllo ELISA fortemente positivo SLA prediluito deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA debolmente positivo SLA prediluito che a sua volta deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA Negativo prediluito. b. Il Controllo ELISA fortemente positivo SLA prediluito deve avere un assorbanza maggiore di 1,0 mentre l assorbanza del Controllo ELISA Negativo prediluito non deve essere maggiore di 0,2. c. L assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo SLA deve essere maggiore di due volte rispetto a quella del Controllo ELISA Negativo oppure >0,25. d. Il Controllo ELISA Negativo e quello ELISA fortemente positivo SLA servono per controllare un eventuale malfunzionamento dei reagenti. Il Controllo ELISA fortemente positivo SLA non assicura la precisione in corrispondenza del valore soglia del test. e. L utente del test dovrebbe fare riferimento al Documento C24-A dell NCCLS per ulteriori informazioni su appropriate tecniche di Controllo di Qualità. 24 Calcolo dei risultati Si deve determinare innanzitutto il valore medio di assorbanza per ciascun set di duplicati. La reattività di ciascun campione viene quindi calcolata dividendo il valore medio di assorbanza del campione per il valore medio di assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo SLA e moltiplicando il risultato per il numero di unità assegnate al Controllo ELISA debolmente positivo SLA, che è stampato sull etichetta del flacone. Assorbanza campione Valore del campione = x Valore Controllo ELISA debolmente positivo SLA (unità) (unità) Assorbanza Controllo ELISA debolmente positivo SLA La reattività è collegata in modo non lineare alla quantità di anticorpi presente. Mentre gli aumenti e le diminuzioni delle concentrazioni degli anticorpi vengono evidenziate da un corrispondente aumento o diminuzione della reattività, il cambiamento non è proporzionale (ad es., un raddoppio della concentrazione di anticorpi non raddoppia necessariamente la reattività). Se si desidera una più accurata quantificazione del contenuto di anticorpi, si possono allestire e testare diluizioni seriate del campione. L ultima diluizione che risulta positiva nel test dovrebbe essere refertata come il titolo anticorpale del paziente. Interpretazione dei risultati Il metodo ELISA è molto sensibile alla procedura ed è in grado di individuare anche piccole differenze nella popolazione dei pazienti. I valori riportati qui di seguito sono solo valori suggeriti. Ciascun Laboratorio dovrebbe stabilire il proprio range di normalità basato sulla procedura da esso utilizzata, sui controlli, sull apparecchiatura e sulla popolazione di pazienti secondo le proprie metodiche standard. Il campione può essere quindi classificato come negativo, dubbio o positivo in base alla seguente tabella. Unità Negativo <20,0 Dubbio 20,1 24,9 Positivo >25 4

5 I campioni che danno risultati dubbi dovrebbero essere ritestati prima di refertare i risultati. 1. Un risultato positivo indica la presenza di anticorpi diretti contro SLA e suggerisce la possibilità della l epatite autoimmune (EAI). 2. Un campione con livelli dubbi di IgG anti-sla non dà nessuna indicazione sulla situazione immunologica del paziente. Se il campione rimane dubbio anche dopo la ripetizione del test, il risultato dovrebbe essere refertato come dubbio e/o si dovrebbe richiedere un campione successivo per un ulteriore controllo. 3. Un risultato negativo indica l assenza di anticorpi diretti contro SLA anticorpi oppure la loro presenza a livelli inferiori al limite di sensibilità del metodo. 4. Campioni che danno letture di OD al di sopra del range di lettura del lettore della placca possono essere riportati come più elevati della più grande OD misurabile diviso per la OD del debolmente positivo per 25 o possono essere diluiti e ri-analizzati per ottenere un valore calcolato. Il range lineare approssimativo dell analisi va da 9 a 125 unità. 5. Sul referto si dovrebbe riportare la seguente frase: I seguenti risultati sono stati ottenuti mediante il test QUANTA Lite TM SLA ELISA della INOVA. I valori SLA ottenuti con test prodotti da altre Ditte possono non essere utilizzabili in modo intercambiabile. Il livello di IgG determinato con questo metodo non può essere correlato ad un titolo endpoint. Limitazioni del test 1. Un risultato negativo della ricerca di anticorpi anti SLA non esclude la presenza di epatite autoimmune. 2. Un risultato negativo della ricerca di anticorpi SLA non esclude la presenza di questi anticorpi, perché la concentrazione potrebbe essere inferiore ai limiti di rilevabilità dell analisi. 3. Un risultato positivo indica solo la presenza di anticorpi diretti verso l SLA ricombinante umano e non indica necessariamente la presenza di epatite autoimmune. 4. La diagnosi di epatite autoimmune viene fatta sulla base dei riscontri clinici, della demografia e di altri esami diagnostici. 5. La letteratura suggerisce che gli anticorpi anti-sla non sono caratteristici della EAI Malgrado i tre campioni EAI-2 mostrati nella sezione Caratteristiche specifiche delle prestazioni più in basso nel testo fossero negativi, questo numero è troppo limitato per poter concludere che i campioni EAI-2 siano privi di anticorpi anti SLA solo sulla base della presente analisi. 6. I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e del risultato degli altri test sierologici. 7. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero. Valori attesi L incidenza annuale media della EAI è stata stimata essere di 1,9 casi / nella popolazione caucasica dell Europa Occidentale e del Nordamerica e dello 0,08-0,015 casi/ in Giappone 25,27. La prevalenza è stata stimata essere del 16,9/ in una popolazione norvegese 26. Questa malattia colpisce le donne più degli uomini con un rapporto di 4:1. La incidenza maggiore si ha nelle età comprese fra 15 e 30 anni, malgrado si presenti a qualunque età 1-5. Range normale Sono stati analizzati campioni provenienti da un gruppo di 131 pazienti sani asintomatici per la ricerca di anticorpi anti SLA utilizzando il QUANTA Lite TM SLA ELISA. Il gruppo era costituito da 91 uomini e 40 donne. Non si sono riscontrate differenze fra i valori medi dei risultati degli uomini e delle donne. L età variava fra 5 e 69 anni (mediana 33). Nel gruppo analizzato la specificità dell analisi è stata del 100% (131/131). Il valore medio per questa popolazione è stato di 2,0 unità con il valore massimo di 5,8 unità. Caratteristiche specifiche delle prestazioni Pazienti affetti da EAI e da altre malattie epatiche Sono stati analizzati in cieco, presso la INOVA e presso laboratori esterni, dei campioni provenienti da pazienti con EAI ed altre malattie epatiche utilizzando il QUANTA Lite TM SLA ELISA. Le età dei pazienti variavano fra 13 e 82 anni con un rapporto maschi:femmine di circa 3,5. I risultati ottenuti dai vari gruppi sono riassunti qui sotto. Gruppo clinico n= SLA+ % SLA+ EAI ,8 Coesistenza di EAI-1/PBC (cirrosi biliare primaria) EAI Epatite criptogenetica ,4 Colangite autoimmune ,5 EAI-1/PSC EAI indotta da droghe Cirrosi biliare primaria Colangite sclerosante primaria (PSC) PBC/PSC Altre malattie epatiche non virali Epatite B (B,C,or D) Epatite C Epatite C/D

6 Sensibilità, solo per l EAI-1: 34/289 = 11,8% Sensibilità, per le varianti EAI-1 ed EAI-1 (coesistenza): 51/330 = 15,4% Specificità (malattie non-eai): 73/73 = 100% Specificità (soggetti sani più malattie epatiche non-eai): 204/204 = 100% Studio delle reazioni crociate Per ricercare eventuali reazioni crociate è stato analizzato il siero di 70 pazienti contenente anticorpi da varie malattie autoimmuni o infettive con il QUANTA Lite TM SLA ELISA. I gruppi di sieri analizzati ed il loro numero erano: virus dell Herpes umano 6 (10), Rickettsia (6), Citomegalovirus (10), Membrana glomerulare basale (3), anticorpi antinucleo (3), lupus eritematoso sistemico (3), mitocondri (3), cellule parietali gastriche (3), LKM-1 (3) e citocheratina 8 o 18 (26). Nessun campione è risultato positivo agli anticorpi anti-sla. Precisione e riproducibilità Le prestazioni Intra-Test per il QUANTA Lite TM SLA ELISA sono state valutate analizzando 6 campioni ognuno per un totale di 7 volte. I risultati sono riassunti qui di seguito. Intra-assay Camp. A Camp. B Camp. C Camp.D Camp.E Camp F. Unità medie 72,6 46,2 27,6 13,5 9,7 2,0 DS 1,4 1,9 1,4 0,4 0,2 0,1 CV% 1,9 4,1 5,2 2,8 2,2 7,2 Si è valutata la variazione fra diverse analisi testando, in doppio, un gruppo di 5 campioni ed i kit di controllo due volte al giorno per 3 giorni. Un riassunto dei risultati è mostrato in basso. Inter-assay Camp. A Camp. B Camp. C Camp.D Camp.E Unità medie 78,5 48,5 29,0 13,6 9,5 DS 1,8 1,1 0,9 0,5 0,4 CV% 1,9 4,1 5,2 2,8 2,2 Bibliografia 1. Krawitt EL. Autoimmune hepatitis. N Engl J Med. 1996;334(14): Krawitt EL. Can you recognize autoimmune hepatitis? Postgrad Med. 1998;104(2): , Alvarez F, Berg PA, Bianchi FB, et al. International Autoimmune Hepatitis Group Report: review of criteria for diagnosis of autoimmune hepatitis. J Hepatol. 1999;31(5): Obermayer-Straub P, Strassburg CP, Manns MP. Autoimmune hepatitis. J Hepatol. 2000;32(1 Suppl): Manns MP, Strassburg CP. Autoimmune hepatitis: clinical challenges. Gastroenterology. 2001;120(6): Czaja AJ, Homburger HA. Autoantibodies in liver disease. Gastroenterology. 2001;120(1): Meyer zum Buschenfelde KH, Lohse AW. Autoimmune hepatitis. N Engl J Med Oct 12;333(15): Kanzler S, Weidemann C, Gerken G, Lohr HF, Galle PR, Meyer zum Buschenfelde KH, Lohse AW. Clinical significance of autoantibodies to soluble liver antigen in autoimmune hepatitis. J Hepatol. 1999;31(4): McFarlane IG. The relationship between autoimmune markers and different clinical syndromes in autoimmune hepatitis. Gut. 1998;42: Ballot E, Homberg JC, Johanet C. Antibodies to soluble liver antigen: an additional marker in type 1 auto-immune hepatitis. J Hepatol. 2000;33(2): Lapierre P, Hajoui O, Homberg JC, Alvarez F. Formiminotransferase cyclodeaminase is an organspecific autoantigen recognized by sera of patients with autoimmune hepatitis. Gastroenterology Mar;116(3): Manns M, Gerken G, Kyriatsoulis A, Staritz M, Meyer zum Buschenfelde KH. Characterization of a new subgroup of autoimmune chronic active hepatitis by autoantibodies against a soluble liver antigen. Lancet. 1987;1: Stechemesser E, Klein R, Berg PA. Characterization and clinical relevance of liver-pancreas antibodies in autoimmune hepatitis. Hepatology. 1993;18(1): Wies I, Brunner S, Henninger J, Herkel J, Kanzler S, Meyer zum Buschenfelde KH, Lohse AW. Identification of target antigen for SLA/LP autoantibodies in autoimmune hepatitis. Lancet ;355(9214): Costa M, Rodriguez-Sanchez JL, Czaja AJ, Gelpi C. Isolation and characterization of cdna encoding the antigenic protein of the human trnp(ser)sec complex recognized by autoantibodies from patients with type-1 autoimmune hepatitis. Clin Exp Immunol. 2000;121(2): Wachter B, Kyriatsoulis A, Lohse AW, Gerken G, Meyer zum Buschenfelde KH, Manns MP. Characterization of liver cytokeratin as a major target antigen of anti-sla antibodies. J Hepatol. 1990;11(2): Wesierska-Gadek J, Grimm R, Hitchman E, Penner E. Members of the glutathione S-transferase gene family are antigens in autoimmune hepatitis. Gastroenterology Feb;114(2): Klein R, Berg PA. Glutathione S-transferase as a major autoantigen in anti-sla-positive autoimmune hepatitis. Gastroenterology. 1998;116(4):

7 19. Manns MP. Antibodies to soluble liver antigen: specific marker of autoimmune hepatitis. J Hepatol. 2000;33(2): Czaja AJ, Carpenter HA, Manns MP. Antibodies to soluble liver antigen, P450IID6, and mitochondrial complexes in chronic hepatitis. Gastroenterology. 1993;105(5): Dalekos GN, Wedemeyer H, Obermayer-Straub P, Kayser A, Barut A, Frank H, Manns MP. Epitope mapping of cytochrome P4502D6 autoantigen in patients with chronic hepatitis C during alphainterferon treatment. J. Hepatol. 1999;30(3): Czaja AJ, Donaldson PT, Lohse AW. Antibodies to soluble liver antigen/liver pancreas and HLA risk factors for type 1 autoimmune hepatitis. Am J Gastroenterol. 2002;97: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 1999, Fourth Edition, (HHS Pub. # (CDC) ). 24. National Committee for Clinical Laboratory Standards Internal quality control: Principles and definitions; Approved Guideline, NCCLS Document C24-A, Vol.11(6). 25. Nishioka M, Morshed SA, Parveen S, Kono K, Matsuoka H, Manns MP. Antibodies to P450IID6, SLA, PDH-E2 and BCKD-E2 in Japanese patients with chronic hepatitis. J Gastroenterol Hepatol. 1997;12(12): Boberg KM, Aadland E, Jahnsen J, Raknerud N, Stiris M, Bell H. Incidence and prevalence of primary biliary cirrhosis, primary sclerosing cholangitis, and autoimmune hepatitis in a Norwegian population. Scand J Gastroenterol. 1998;33(1): Jacobson DL, Gange SJ, Rose NR, Graham NM. Epidemiology and estimated population burden of selected autoimmune diseases in the United States. Clin Immunol Immunopathol. 1997; 84(3): Fornitore: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Rappresentante Autorizzato: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service June 2005 Revision ITA3 7