QUANTA Lite TM GPA (Gastric Parietal Cell Antibody) ELISA Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata

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1 QUANTA Lite TM GPA (Gastric Parietal Cell Antibody) ELISA Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata Finalità d uso QUANTA Lite TM GPA, Gastric Parietal Cell Antibody (Anticorpo Cellula Parietale Gastrica), è un saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per la rilevazione semi-quantitativa di anticorpi della classe IgG contro la (H+/K+) ATPasi delle cellule parietali gastriche nel siero umano. La presenza di anticorpi anti- (H+/K+) ATPasi delle cellule parietali gastriche può essere utilizzata assieme a riscontri clinici e ad altri test di laboratorio come ausilio nella diagnosi di malattie che hanno come caratteristica livelli elevati di anticorpi anti-(h+/k+) ATPasi delle cellule parietali gastriche, inclusa l anemia perniciosa. Riassunto e Spiegazione del test L anemia perniciosa è una malattia cronica ed è lo stadio terminale della gastrite atrofica cronica di tipo A (autoimmune). La gastrite atrofica cronica di tipo A colpisce il fondo ed il corpo dello stomaco, mentre quella di tipo B (non immune) colpisce l antro oltre al fondo ed al corpo. La gastrite atrofica cronica di tipo A è associata all anemia perniciosa e quella di tipo B alle infezioni da H. pylori 1-3. Durante la progressione della gastrite atrofica cronica di tipo A ad atrofia gastrica le cellule parietali gastriche, che producono fattore intrinseco ed HCl, vengono distrutte, e così cessa la produzione di queste due sostanze. Il fattore intrinseco è fondamentale per l assorbimento della vitamina B 12 da parte dell intestino e la sua assenza porta alla deficienza di vitamina B 12 ed all anemia megaloblastica. L insorgenza dell anemia perniciosa è in genere lenta; la progressione da gastrite cronica atrofica ad atrofia gastrica ad anemia clinica dura anni. L età media alla diagnosi è di 60 anni. La malattia viene in genere scoperta con l insorgere della anemia e degli altri sintomi, ma è possibile evidenziare le lesioni a livello gastrico con molti anni di anticipo rispetto alla insorgenza della anemia 3,4. Nei pazienti affetti da anemia perniciosa si riscontra una elevata incidenza di malattie autoimmuni come la tiroidite di Hashimoto, il diabete di tipo 1, il morbo di Addison, il morbo di Graves, e la miastenia grave. È stato rilevato che i pazienti affetti da anemia perniciosa hanno un rischio 3 volte superiore di contrarre il carcinoma gastrico, e 13 volte superiore di contrarre il carcinoide gastrico 5. In circa il 90% dei pazienti affetti da anemia perniciosa ed in circa il 30% dei parenti di primo grado si riscontrano autoanticorpi diretti verso le cellule parietali gastriche 1-3. Gli anticorpi diretti verso le cellule parietali gastriche (GPA) vengono in genere rilevati tramite immunofluorescenza indiretta (IFA), utilizzando sezioni di mucosa gastrica di roditore 2. Gli anticorpi anti-cellule parietali gastriche sono diretti verso l antigene legato alla membrana nei canalicoli secretori ed alle tubulovescicole delle cellule parietali gastriche 6. L antigene bersaglio del GPA è stato identificato come la pompa protonica gastrica (H+/K+ ATPasi) responsabile della acidificazione del lume gastrico Il GPA si lega sia alla subunità α che alla β della H+/K+ ATPasi 9. La prevalenza di GPA aumenta con l età e si riscontra nel 2,5% della popolazione normale di anni e nel 9,6% della popolazione di circa 80 anni 3. Uno studio recente ha evidenziato una elevata prevalenza di GPA e della malattia gastrica autoimmune nei pazienti affetti da diabete di tipo 1. Si è concluso che riveste molta importanza ricercare la presenza di GPA in pazienti diabetici che presentino anemia e/o sintomi gastrointestinali 12. Si sono riscontrati elevati livelli di GPA anche in pazienti affetti da malattie tiroidee, anemia sideropenica, alopecia areata e vitiligine 13,14. La rilevazione del GPA tramite l immunofluorescenza indiretta è molto laboriosa, richiede l interpretazione soggettiva dei risultati da parte di personale molto preparato e dipende dalla qualità e dalla riproducibilità delle sezioni di tessuto utilizzate per produrre i vetrini. Con l identificazione delle subunità α e β della H+/K+ ATPasi quali bersaglio molecolare degli autoanticorpi anti-cellule parietali gastriche, si sono costruiti sensibili e specifici test ELISA per la rilevazione degli anticorpi anti GPA 15. L utilizzo del test ELISA per il GPA permette di ottenere risultati standardizzati, riproducibili ed obiettivi. Principio della Metodica L antigene H+/K+ ATPasi, isolato dalla mucosa gastrica suina è adsorbito sulla parete dei pozzetti di una piastra microtiter di polistirene in condizioni adatte a conservare l antigene nel suo stato nativo. I controlli pre-diluiti ed i sieri diluiti dei pazienti vengono distribuiti nei pozzetti corrispondenti, consentendo agli anticorpi anti- H+/K+ ATPase eventualmente presenti di legarsi all antigene adsorbito. L eccesso di campione non legato viene allontanato mediante il lavaggio e successivamente si aggiunge a ciascun pozzetto un anticorpo anti-igg umane marcato con un enzima. Una seconda incubazione consente agli anticorpi anti-igg umane marcati con l enzima di legarsi agli anticorpi del paziente che si sono eventualmente legati alla parete dei pozzetti. Dopo ulteriore lavaggio per allontanare l eccesso di anticorpi anti-igg umane marcati con l enzima, l attività dell enzima rimasto viene misurata aggiungendo un substrato cromogenico e misurando l intensità del colore che si sviluppa. Il test può essere letto mediante uno spettrofotometro ed interpretato confrontando l intensità del colore che si sviluppa nei pozzetti dei campioni con quella dei pozzetti dei controlli. Reagenti 1. Piastra microtiter ELISA in polistirene adsorbita con antigene H+/K+ ATPase purificato (12-1 x 8 pozzetti), con supporto, in busta chiusa contenente materiale essicante 2. Controllo ELISA Negativo, 1 flacone di tampone contenente conservante e siero umano senza anticorpi umani anti- H+/K+ ATPase, prediluito, 1,2mL 3. Controllo ELISA fortemente positivo per GPA, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani anti- H+/K+ ATPase, prediluito, 1,2mL 4. Controllo ELISA debolmente positivo per GPA, 1 flacone di tampone contenente conservante ed 1

2 anticorpi umani anti- H+/K+ ATPase, prediluito, 1,2mL 5. Diluente per campioni HRP, 1 flacone di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween 20, stabilizzatori delle proteine e conservante, 50mL 6. Soluzione di lavaggio HRP Concentrata, 1 flacone di soluzione concentrata 40x di colore rosso contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris e Tween 20, 25mL. Vedi la Sezione Metodi per le istruzioni sulla diluizione. 7. Coniugato HRP IgG, (montone), anti-igg umane, 1 flacone di colore blu contenente tampone, stabilizzatori delle proteine e conservante, 10mL 8. Cromogeno TMB, 1 flacone contenente stabilizzatori, 10mL 9. Soluzione di arresto HRP, Acido solforico 0,344M, 1 flacone incolore, 10mL Avvertenze 1. ATTENZIONE: Questo prodotto contiene un composto chimico (cloramfenicolo allo 0,02%) nel diluente per i campioni, nei controlli e nel coniugato, noto allo Stato della California come causa di tumori. 2. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-hiv, per HbsAg e per anticorpi anti- HCV mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controlli ELISA fortemente positivo GPA, ELISA debolmente positivo GPA ed ELISA Negativo devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. 4. Il Coniugato HRP contiene un composto chimico velenoso/corrosivo, che può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 5. Il Cromogeno TMB contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. 6. La Soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. Evitare l esposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L acido solforico è velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 7. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 8. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili. 3. Un lavaggio incompleto o non accurato e l insufficiente aspirazione del liquido dai pozzetti ELISA può causare una scarsa precisione e/o un elevato background. 4. L adattamento di questo test all uso con apparecchiature automatiche e altri dispositivi per trattamento dei campioni liquidi, in toto o in parte, può causare differenze nei risultati rispetto a quelli ottenuti mediante la procedura manuale. E responsabilità di ciascun Laboratorio confermare che le procedure automatizzate utilizzate diano risultati entro limiti di accettabilità. 5. Una serie di fattori influenza le prestazioni del test. Essi comprendono l iniziale temperatura dei reagenti, la temperatura dell ambiente, l accuratezza e la riproducibilità della tecnica di pipettamento, la scrupolosità delle operazioni di lavaggio e di aspirazione del liquido dai pozzetti delle piastre ELISA, il tipo di spettrofotometro usato per leggere i risultati e la lunghezza dei tempi di incubazione durante l esecuzione del test. Bisogna prestare molta attenzione alla costanza per ottenere risultati accurati e riproducibili. 6. Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite. 7. Una chiusura incompleta della busta richiudibile contenente le strisce di pozzetti ed il materiale essicante causa la degradazione dell antigene ed una scarsa precisione nei risultati. 8. Valori di assorbanza inaccettabilmente bassi possono essere osservati dopo aver usato due o più volte lo stesso flacone di coniugato HRP per un certo periodo di tempo. E importante seguire attentamente le istruzioni fornite per il trattamento del coniugato HRP per evitare tale inconveniente. 9. Un eventuale contaminazione chimica del coniugato HRP può essere conseguenza di una impropria pulizia o risciacquo di apparecchi o di strumenti. Residui di comuni reagenti chimici di laboratorio quali formalina, candeggina, etanolo o detergenti causano la degradazione nel tempo del coniugato HRP. Risciacquare molto accuratamente tutti gli apparecchi e gli strumenti dopo l uso di detergenti chimici. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. 2. Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile contenente il materiale essicante e conservate nella busta ben chiusa a 2-8 C. 3. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 1 settimana a 2-8 C. 2

3 Raccolta dei campioni Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L aggiunta al campione di sodio azide o di altri conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l uso di sieri fortemente emolizzati o lipemici. Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A2 dell NCCLS raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8 C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a -20 C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati. Procedura Materiali forniti 1 Piastra microtiter ELISA GPA (12-1 x 8 pozzetti), con supporto 1 1,2mL Controllo ELISA Negativo prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA debolmente positivo GPA prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA fortemente positivo GPA prediluito 1 50mL Diluente per campioni HRP 1 25mL Soluzione di lavaggio HRP concentrata, 40x concentrata 1 10mL Coniugato HRP IgG, (montone), anti-igg umane 1 10mL Cromogeno TMB 1 10mL Soluzione di arresto HRP, 0,344M Acido solforico Materiali richiesti ma non forniti Micropipette in grado di erogare volume di 5, 100, e 500µL Puntali monouso per micropipette Provette per la diluizione dei sieri, volume 4mL Acqua distillata o deionizzata Beuta da 1L per diluite la Soluzione di lavaggio HRP concentrata Lettore per piastre ELISA in grado di leggere a 450nm (e 620nm per le letture a doppia lunghezza d onda) Metodica Prima di incominciare 1. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26 o C) e mescolarli bene. 2. Diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone fornito con il kit a 975mL di acqua distillata o deionizzata. Se non si usa l intera piastra in una sola volta, si può preparare una minore quantità di soluzione di lavaggio aggiungendo 2,0mL di concentrato a 78mL di acqua distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 1 settimana a 2-8 o C. 3. Preparare una diluizione 1:101 di ciascun campione da testare aggiungendo 5µL di siero a 500µL di Diluente per campioni HRP. I campioni diluiti devono essere testati entro 8 ore dalla preparazione. NON DILUIRE i Controllo ELISA debolmente positivo GPA, Controllo ELISA fortemente positivo GPA ed Controllo ELISA Negativo. 4. La determinazione della presenza o dell assenza di H+/K+ ATPasi usando unità arbitrarie richiede due pozzetti per ciascuno dei tre controlli ed uno o due pozzetti per ciascun campione clinico. Si raccomanda di testare i campioni in duplicato. Esecuzione del test 1. TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26 C) PRIMA DI INIZIARE IL TEST. Posizionare i pozzetti/le strisce necessarie nel supporto. Rimettere immediatamente la strisce inutilizzate nella busta contenente il materiale essicante e sigillarla bene per minimizzare l esposizione all umidità ambientale. 2. Distribuire 100µL dei Controlli ELISA debolmente positivo GPA, ELISA fortemente positivo GPA ed ELISA Negativo prediluiti e dei sieri diluiti nei rispettivi pozzetti. Coprire i pozzetti ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione inizia dopo l aggiunta dell ultimo campione. 3. Lavaggio: Aspirare completamente il contenuto di ciascun pozzetto. Distribuire µL di soluzione di lavaggio HRP diluita in tutti i pozzetti e quindi aspirarla. Ripetere questa operazione per altre due volte, per un totale di tre lavaggi. Dopo l ultimo lavaggio capovolgere la piastra e scuoterla fermamente su tovaglioli di carta assorbente per rimuovere eventuali residui di liquido. E importante vuotare completamente ciascun pozzetto dopo ciascun lavaggio. Per l aspirazione mantenere la stessa sequenza usata per l aggiunta dei campioni. 4. Distribuire 100μL di Coniugato HRP IgG in ciascun pozzetto. Il coniugato dovrebbe essere prelevato dal flacone mediante tecniche sterili. Prelevare dal flacone solo la quantità di coniugato necessaria per l esecuzione del test. PER EVITARE POSSIBILI CONTAMINAZIONI MICROBICHE E/O CHIMICHE, NON RIMETTERE MAI IL CONIUGATO INUTILIZZATO NEL FLACONE. Incubare i pozzetti per 30 minuti come descritto al punto Lavaggio: Ripetere la procedura descritta al punto Distribuire 100µL di Cromogeno TMB in ciascun pozzetto ed incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. 3

4 7. Distribuire 100µL di Soluzione di arresto HRP in ogni pozzetto. Per l aggiunta della Soluzione di arresto HRP mantenere la stessa sequenza e gli stessi tempi utilizzati per l aggiunta del Cromogeno TMB. Agitare gentilmente la piastra con le dita per mescolare completamente i reagenti nei pozzetti. 8. Leggere l assorbanza (OD) di ciascun pozzetto a 450nm entro 1 ora dall aggiunta della soluzione di arresto. Se si preferisce una lettura a doppia lunghezza d onda, si può usare la lunghezza d onda di 620nm come riferimento. Controllo di qualità 1. I Controlli ELISA debolmente positivo GPA, ELISA fortemente positivo GPA ed ELISA Negativo devono essere inclusi ogni volta che si esegue il test per assicurare che tutti i reagenti ed il test funzionino in modo corretto. 2. Si deve notare che, poichè i Controlli ELISA debolmente positivo GPA, ELISA fortemente positivo GPA ed ELISA Negativo sono prediluiti, essi non rappresentano un controllo procedurale per le tecniche di diluizione utilizzate per i campioni. 3. Ulteriori controlli possono essere inclusi in base alle indicazioni o alle richieste delle vigenti regolamentazioni o delle organizzazioni di accreditamento. Ulteriori sieri di controllo possono essere preparati raccogliendo un pool dei sieri umani, aliquotandolo e conservandolo a < -20 C. 4. Perchè i risultati del test siano considerati validi, tutti i seguenti criteri devono essere soddisfatti. Se anche uno solo non rientra nei valori specificati, i risultati non dovrebbero essere considerati validi ed il test dovrebbe essere ripetuto. a. L assorbanza del Controllo ELISA fortemente positivo GPA prediluito deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA debolmente positivo GPA prediluito che a sua volta deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA Negativo prediluito. b. Il Controllo ELISA fortemente positivo GPA prediluito deve avere un assorbanza maggiore di 1,0 mentre l assorbanza del Controllo ELISA Negativo prediluito non deve essere maggiore di 0,2. c. L assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo GPA deve essere maggiore di due volte rispetto a quella del Controllo ELISA Negativo oppure >0,25. d. Il Controllo ELISA Negativo e quello ELISA fortemente positivo GPA servono per controllare un eventuale malfunzionamento dei reagenti. Il Controllo ELISA fortemente positivo GPA non assicura la precisione in corrispondenza del valore soglia del test. e. L utente del test dovrebbe fare riferimento al Documento C24-A dell NCCLS per ulteriori informazioni su appropriate tecniche di Controllo di Qualità. 17 Calcolo dei risultati Si deve determinare innanzitutto il valore medio di assorbanza per ciascun set di duplicati. La reattività di ciascun campione viene quindi calcolata dividendo il valore medio di assorbanza del campione per il valore medio di assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo GPA e moltiplicando il risultato per il numero di unità assegnate al Controllo ELISA debolmente positivo GPA, che è stampato sull etichetta del flacone. Assorbanza campione Valore del campione = x Valore Controllo ELISA debolmente positivo GPA (unità) (unità) Assorbanza Controllo ELISA debolmente positivo GPA La reattività è collegata in modo non lineare alla quantità di anticorpi presente. Mentre gli aumenti e le diminuzioni delle concentrazioni degli anticorpi vengono evidenziate da un corrispondente aumento o diminuzione della reattività, il cambiamento non è proporzionale (ad es., un raddoppio della concentrazione di anticorpi non raddoppia necessariamente la reattività). Se si desidera una più accurata quantificazione del contenuto di anticorpi, si possono allestire e testare diluizioni seriate del campione. L ultima diluizione che risulta positiva nel test dovrebbe essere refertata come il titolo anticorpale del paziente. Interpretazione dei risultati Il metodo ELISA è molto sensibile alla procedura ed è in grado di individuare anche piccole differenze nella popolazione dei pazienti. I valori riportati qui di seguito sono solo valori suggeriti. Ciascun Laboratorio dovrebbe stabilire il proprio range di normalità basato sulla procedura da esso utilizzata, sui controlli, sull apparecchiatura e sulla popolazione di pazienti secondo le proprie metodiche standard. Il campione può essere quindi classificato come negativo, (assenza di IgG anti- H+/K+ ATPase), dubbio o positivo (presenza di IgG anti- H+/K+ ATPase). Unità Negativo 0,0 20,0 Dubbio 20,1 24,9 Positivo >25 I campioni che danno risultati dubbi dovrebbero essere ritestati prima di refertare i risultati. 1. Un risultato positivo indica la presenza di anticorpi diretti contro GPA e suggerisce la possibilità di malattie che hanno come caratteristica livelli elevati di anticorpi anti-(h+/k+) ATPasi delle cellule parietali gastriche, inclusa l anemia perniciosa. 2. Un risultato negativo indica l assenza di anticorpi diretti contro GPA anticorpi oppure la loro presenza a livelli inferiori al limite di sensibilità del metodo. 3. Se un campione presenta livelli equivoci di GPA non è possibile determinare la presenza di anticorpi. Se i risultati permangono equivoci dopo un secondo test, si dovrebbe contrassegnare il risultato come equivoco e/o procedere con il prelievo di un altro campione. 4

5 4. Sul referto si dovrebbe riportare la seguente frase: I seguenti risultati sono stati ottenuti mediante il test QUANTA Lite TM GPA ELISA della INOVA. I valori GPA ottenuti con test prodotti da altre Ditte possono non essere utilizzabili in modo intercambiabile. Il livello di IgG determinato con questo metodo non può essere correlato ad un titolo endpoint. Limitazioni del test 1. La presenza nel campione di complessi immuni o di altri aggregati di immunoglobuline può causare un aumento del livello di reazioni a specifiche con conseguenti risultati falsi positivi con questo test. 2. Un risultato negativo non esclude la presenza di anemia perniciosa. 3. Ciò avviene perché la concentrazione dell anticorpo potrebbe essere inferiore ai limiti di rilevazione del test. 4. Un risultato positivo indica solamente la presenza di anticorpi diretti verso la H+/K+ ATPasi e non indica necessariamente la presenza di malattie autoimmuni o di altre malattie. 5. La performance del test non è stata determinata per pazienti pediatrici. 6. I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e del risultato degli altri test sierologici. 7. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero. Valori attesi La capacità del QUANTA Lite TM GPA ELISA di rilevamento degli anticorpi H+/K+ ATPasi è stata valutata comparandola a quella di un altro kit ELISA per la H+/K+ ATPasi esistente in commercio. Sono stati anche confrontati i risultati ottenuti utilizzando il QUANTA Lite TM GPA ELISA con quelli ottenuti tramite una prova alla immunofluorescenza indiretta eseguita utilizzando sezioni tissutali provenienti da rene e stomaco di topo. La prevalenza di GPA nella popolazione sana aumenta con l età da circa 2,5% nella popolazione di anni a 9,6% nella popolazione di circa 80 anni. L incidenza di GPA è generalmente più alta nelle donne rispetto agli uomini. Sono risultati positivi il 5,5% degli uomini sotto i 55 anni contro il 14,7% delle donne. Per gli individui d età superiore ai 55 anni queste percentuali sono salite rispettivamente a 9,2% e 22,3% 4. Range normale Sono stati analizzati 210 campioni provenienti da individui sani ed asintomatici con il kit QUANTA Lite TM GPA ELISA. L età variava dai 17 ai 77 anni (età media 32). Di questi 210 campioni 154 (73,3%) provenivano da individui di sesso maschile e 56 (26,7%) da individui di sesso femminile. Il valore medio era 7,3 unità con variazioni da 1,3 a 84,1 unità. Due dei 7 campioni risultati positivi con il GPA sono risultati positivi anche alla immunofluorescenza. Escludendo 4 risultati equivoci è risultata una specificità del 96,6% (199/206). Sensibilità e specificità relative La Tabella 1 mostra i risultati ottenuti analizzando 20 campioni provenienti da pazienti affetti da anemia perniciosa con il QUANTA Lite TM GPA ELISA e con un altro kit GPA ELISA. La Tabella 2 mostra il confronto con i risultati ottenuti su questo gruppo con la immunofluorescenza indiretta utilizzando tessuti provenienti da rene e stomaco di topo. La Tabella 3 mostra il confronto fra i risultati ottenuti utilizzando il kit QUANTA Lite TM GPA ELISA e l altro kit GPA ELISA kit in un gruppo di 41 campioni. Tabella 1: risultati del gruppo di pazienti affetti da anemia perniciosa con il QUANTA Lite TM GPA (Gastric Parietal Antibody) e con un altro kit GPA ELISA Predicate GPA QUANTA Lite TM GPA ELISA RESULTS ELISA N=20 Pos (15) Dub (0) Neg (5) Positivo Pos (14) Dubbio Dub (5) Negativo Neg (1) Concordanza (esclusi i risultati equivoci): 100% (15/15) Tabella 2: risultati del gruppo di pazienti affetti da anemia perniciosa con il QUANTA Lite TM GPA ELISA e con la immunofluorescenza, ANA (topo rene/stomaco) QUANTA Lite TM GPA ELISA RESULTS GPA IFA N= 20 Pos (15) Dub (0) Neg (5) Positivo Pos (15) Dubbio Dub (0) Negativo Neg (5) Concordanza: 100% (20/20) Tabella 3: Risultati ottenuti da campioni sottoposti a test per il GPA con il QUANTA Lite TM GPA (Gastric Parietal Antibody) e con un altro kit GPA ELISA Predicate GPA QUANTA Lite TM GPA ELISA RESULTS ELISA N=41 Pos (19) Dub (2) Neg (20) Positivo Pos (22) Dubbiol Dub (0) Negativo Neg (19) Concordanza (esclusi i risultati equivoci): 89,7% (35/39) Studio delle reazioni crociate I sieri contenenti autoanticorpi o anticorpi derivati da malattie infettive o provenienti da pazienti affetti da varie patologie fra cui: H. pylori (7), perossidasi tiroidea (5), thyroid-m (5), thyroid-t (4), beta-2 glicoproteina (5), LKM-1 (5), epatite autoimmune tipo 1 (14), mitocondri M2 (4) sono stati analizzati per valutare reazioni 5

6 crociate utilizzando il QUANTA Lite TM GPA ELISA. Un campione con H. pylori e 2 con TPO sono risultati positivi con il QUANTA Lite TM GPA ELISA. Questi 3 campioni sono risultati positivi anche al GPA con il metodo IFA. Precisione e riproducibilità La performance Intra-Test per il QUANTA Lite TM GPA ELISA è stata valutata analizzando 6 campioni ognuno per un totale di 9 volte. I risultati, riassunti nella Tabella 4, mostrano la precisione Intra-Test. Tabella 4: Performance Intra-Test del QUANTA Lite TM GPA ELISA Camp. A Camp. B Camp. C Camp. D Camp. E Camp. F Unità medie 40,7 93,4 35,4 58,3 47,0 10,5 DS 2,3 5,7 3,2 5,4 5,1 0,7 CV % 5,6 6,1 9,0 9,2 10,8 6,9 La performance Inter-Test è stata valutata testando un gruppo di 5 campioni due volte al giorno per 3 giorni in doppio. Tabella 5: Performance Inter-Test del QUANTA Lite TM GPA ELISA Camp. 1 Camp. 2 Camp. 3 Camp. 4 Camp. 5 Unità medie 32,7 95,2 11,4 32,9 5,9 DS 1,61 2,25 0,37 1,77 0,42 CV % 4,9 2,4 3,2 5,4 7,1 6

7 Bibliografia 1. Gleeson PA and B-H Toh. Molecular Targets in Pernicious Anemia. Immunology Today 12(7): , Gleeson PA, Van Driel IR and B-H Toh. Parietal Cell Antibodies. In: Autoantibodies. Peter JB and Y Shoenfeld, eds., Elsevier Science B.V. pp , Toh B-H, Van Driel IR and PA Gleeson. Pernicious Anemia. N. Eng. J. Med. 37(20): , Lee GR. Pernicious Anemia and other causes of vitamin B12 (cobalamin) deficiency. In: Wintrobe s Clinical Hematology, 10 th ed, Williams & Wilkins, pp , Hsing AW, Hansson L-E, McLaughlin JK, et al. Pernicious anemia and subsequent cancer: a population-based cohort study. Cancer 71: , Hoedemaeker PJ and S Ito. Ultrastructural localization of gastric parietal cell antigen with peroxidasecoupled antibody. Lab. Invest. 22: , Burman P, Mardh S, Norberg L and FA Karlsson. Parietal cell antibodies in pernicious anemia inhibit H+/K+ -adenosine triphosphatase, the proton pump of the stomach. Gastroenterol. 96: , Toh B-H, Gleeson PA, Simpson RJ, et al. The 60- to 90 kda parietal cell autoantigen associated with autoimmune gastritis is a β subunit of the gastric H+/K+ ATPase (proton pump). PNAS 87: , Callagham JM, Khan MA, Alderuccio F, Van Driel IR, Gleeson PA and B-H Toh. α and β subunits of the gastric H+/K+ ATPase are concordantly targeted by parietal cell autoantibodies associated with autoimmune gastritis. Autoimmun. 16: , Ma JY, Borch K and S Mardh. Human gastric H,K-adenosine triphosphatase β-subunit is a major autoantigen in atrophic corpus gastritis. Expression of the recombinant human glycoprotein in insect cells. Scand. J. Gastroenterol. 29: , Claeys D, Galler G, Appelmelk BJ, Negrini R and T Kirchner. The gastric H+/K+-ATPase is a major autoantigen in chronic Helicobacter pylori gastritis with body mucosa atrophy. Gastroenterol. 115: , DeBlock CRM, DeLeeuw IH, Van Gaal LF and the Belgian Diabetes Registry. High prevalence of manifestations of gastric autoimmunity in parietal cell antibody-positive type 1 (insulin-dependent) diabetic patients. J. Clin. Endocrin. Metab. 84(1): , Mandry, RC, Ortiz LJ, Lugo-Somolinos A and JL Sanchez. Organ-specific autoantibodies in Vitiligo patients and their relatives. Int. J. Dermatol. 35(1): , Kumar B, Sharma VK and S Sehgal. Anti-smooth muscle and anti-parietal cell antibodies in Indians with alopecia areata. Int. J. Dermatol. 34(8): , Chuang JS, Callagham JM, Gleeson PA and B-H Toh. Diagnostic ELISA for parietal cell autoantibody using tomato lectin-purified gastric H+/K+-ATPase (proton pump). Autoimmun. 12:1-7, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 1999, Fourth Edition, (HHS Pub. # (CDC) ). 17. National Committee for Clinical Laboratory Standards,1991. Internal Quality Control: Principles and Definitions; Approved Guideline, NCCLS Document C24-A, Vol 11(6). Fornitore: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Rappresentante Autorizzato: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service June 2005 Revision ITA3 7