QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata

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1 QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata Finalità d uso QUANTA Lite TM H. pylori IgG è un test immunoenzimatico per la ricerca semi-quantitativa di anticorpi della classe IgG anti-h. pylori (Helicobacter pylori) nel siero umano. La presenza di anticorpi anti-h. pylori IgG può essere usata, insieme al quadro clinico del paziente ed al risultato degli altri test di laboratorio eseguiti, come aiuto nella diagnosi di Infezioni da H. pylori in pazienti adulti con sintomatologia clinica riferibile a malattia gastrointestinale. Riassunto e Spiegazione del test La correlazione tra infezione da H. pylori ed ulcera peptica, proposta per la prima volta nel 1983, è ormai stata riconosciuta e dimostrata. 1 L infezione da H. pylori è presente in più del 95% dei pazienti con ulcere duodenali, nell 80% dei pazienti con ulcera gastrica ed è associata al carcinoma gastrico ed al linfoma. 2-5 L eradicazione dell infezione da H. pylori riduce le ulcere recidive. 2-5 La terapia dell infezione da H. pylori è stata raccomandata per i pazienti con ulcera duodenale o gastrica e recentemente anche per quelli con dispepsia funzionale. 5,6 La diagnosi dell infezione da H. pylori è basata sia su metodi invasivi sia su metodi non invasivi. I test invasivi comprendono l endoscopia per l osservazione diretta della mucosa gastrica antrale e per il prelievo di campioni bioptici da sottoporre al test dell ureasi, alle colorazioni istologiche (Warthin-Starry) ed all esame colturale. 5,7 La coltura è considerata il gold standard ; tuttavia, essa rappresenta il test meno sensibile (70-80% di sensibilità). I test istologici e quello dell ureasi presentano sensibilità e specificità superiori al 90%. 5 Gli svantaggi principali dei metodi invasivi sono rappresentati dal rischio e dal disagio per i pazienti, dai costi elevati e dai risultati falsi negativi causati dalla distribuzione a chiazze di H. pylori sulla mucosa gastrica. I metodi non invasivi comprendono l urea breath test mediante urea marcata con 13 C o 12 C ed i test serologici. L urea breath test è sensibile e specifico, ma costoso. La sierologia garantisce un alternativa economica, sensibile e specifica alternative ai metodi invasivi e/o ai test costosi quali l endoscopia e l urea breath test mediante urea marcata con 13 C. 2,3,5,8,9 Il kit QUANTA Lite TM H. pylori IgG fa parte della famiglia di test ELISA QUANTA Lite TM. I ELISA per la ricerca di anticorpi anti-h. pylori si sono dimostrati sensibili e specifici. Principio della Metodica L antigene purificato H. pylori IgG è adsorbito sulla parete dei pozzetti di una piastra microtiter di polistirene in condizioni adatte a conservare l antigene nel suo stato nativo. I controlli pre-diluiti ed i sieri diluiti dei pazienti vengono distribuiti nei pozzetti corrispondenti, consentendo agli anticorpi anti-h. pylori IgG eventualmente presenti di legarsi all antigene adsorbito. L eccesso di campione non legato viene allontanato mediante il lavaggio e successivamente si aggiunge a ciascun pozzetto un anticorpo anti-igg umane marcato con un enzima. Una seconda incubazione consente agli anticorpi anti-igg umane marcati con l enzima di legarsi agli anticorpi del paziente che si sono eventualmente legati alla parete dei pozzetti. Dopo ulteriore lavaggio per allontanare l eccesso di anticorpi anti-igg umane marcati con l enzima, l attività dell enzima rimasto viene misurata aggiungendo un substrato cromogenico e misurando l intensità del colore che si sviluppa. Il test può essere letto mediante uno spettrofotometro ed interpretato confrontando l intensità del colore che si sviluppa nei pozzetti dei campioni con quella dei pozzetti dei controlli. Reagenti 1. Piastra microtiter ELISA in polistirene adsorbita con antigene H. pylori purificato (12-1 x 8 pozzetti), con supporto, in busta chiusa contenente materiale essicante 2. Controllo ELISA Negativo, 1 flacone di tampone contenente conservante e siero umano senza IgG anticorpi umani anti-h. pylori IgG, prediluito, 1,2mL 3. Controllo ELISA fortemente positivo per H. pylori IgG, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani IgG anti-h. pylori, prediluito, 1,2mL 4. Controllo ELISA debolmente positivo per H. pylori IgG, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani IgG anti-h. pylori, prediluito, 1,2mL 5. Diluente per campioni HRP, 1 flacone di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween 20, stabilizzatori delle proteine e conservante, 50mL 6. Soluzione di lavaggio HRP Concentrata, 1 flacone di soluzione concentrata 40x di colore rosso contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris e Tween 20, 25mL. Vedi la Sezione Metodi per le istruzioni sulla diluizione. 7. Coniugato HRP IgG, (montone), anti-igg umane, 1 flacone di colore blu contenente tampone, stabilizzatori delle proteine e conservante, 10mL 8. Cromogeno TMB, 1 flacone contenente stabilizzatori, 10mL 9. Soluzione di arresto HRP, Acido solforico 0,344M, 1 flacone incolore, 10mL Avvertenze 1. ATTENZIONE: Questo prodotto contiene un composto chimico (cloramfenicolo allo 0,02%) nel diluente per i campioni, nei controlli e nel coniugato, noto allo Stato della California come causa di tumori. 1

2 2. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-hiv, per HBsAg e per anticorpi anti- HCV mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controlli ELISA fortemente positivo H. pylori IgG, ELISA debolmente positivo H. pylori IgG ed ELISA Negativo devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. 4. Il Coniugato HRP contiene un composto chimico velenoso/corrosivo, che può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 5. Il Cromogeno TMB contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. 6. La Soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. Evitare l esposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L acido solforico è velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 7. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 8. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili. 3. Un lavaggio incompleto o non accurato e l insufficiente aspirazione del liquido dai pozzetti ELISA può causare una scarsa precisione e/o un elevato background. 4. L adattamento di questo test all uso con apparecchiature automatiche e altri dispositivi per trattamento dei campioni liquidi, in toto o in parte, può causare differenze nei risultati rispetto a quelli ottenuti mediante la procedura manuale. E responsabilità di ciascun Laboratorio confermare che le procedure automatizzate utilizzate diano risultati entro limiti di accettabilità. 5. Una serie di fattori influenza le prestazioni del test. Essi comprendono l iniziale temperatura dei reagenti, la temperatura dell ambiente, l accuratezza e la riproducibilità della tecnica di pipettamento, la scrupolosità delle operazioni di lavaggio e di aspirazione del liquido dai pozzetti delle piastre ELISA, il tipo di spettrofotometro usato per leggere i risultati e la lunghezza dei tempi di incubazione durante l esecuzione del test. Bisogna prestare molta attenzione alla costanza per ottenere risultati accurati e riproducibili. 6. Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite. 7. Una chiusura incompleta della busta richiudibile contenente le strisce di pozzetti ed il materiale essicante causa la degradazione dell antigene ed una scarsa precisione nei risultati. 8. Valori di assorbanza inaccettabilmente bassi possono essere osservati dopo aver usato due o più volte lo stesso flacone di coniugato HRP per un certo periodo di tempo. E importante seguire attentamente le istruzioni fornite per il trattamento del coniugato HRP per evitare tale inconveniente. 9. Un eventuale contaminazione chimica del coniugato HRP può essere conseguenza di una impropria pulizia o risciacquo di apparecchi o di strumenti. Residui di comuni reagenti chimici di laboratorio quali formalina, candeggina, etanolo o detergenti causano la degradazione nel tempo del coniugato HRP. Risciacquare molto accuratamente tutti gli apparecchi e gli strumenti dopo l uso di detergenti chimici. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. 2. Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile contenente il materiale essicante e conservate nella busta ben chiusa a 2-8 C. 3. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 1 settimana a 2-8 C. Raccolta dei campioni Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L aggiunta al campione di sodio azide o di altri conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l uso di sieri fortemente emolizzati o lipemici. Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A2 dell NCCLS raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8 C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a -20 C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati. 2

3 Procedura Materiali forniti 1 Piastra microtiter ELISA H. pylori IgG (12-1 x 8 pozzetti), con supporto 1 1,2mL Controllo ELISA Negativo prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA debolmente positivo H. pylori IgG prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA fortemente positivo H. pylori IgG prediluito 1 50mL Diluente per campioni HRP 1 25mL Soluzione di lavaggio HRP concentrata, 40x concentrata 1 10mL Coniugato HRP IgG, (montone), anti-igg umane 1 10mL Cromogeno TMB 1 10mL Soluzione di arresto HRP, 0,344M Acido solforico Materiali richiesti ma non forniti Micropipette in grado di erogare volume di 5, 100, e 500µL Puntali monouso per micropipette Provette per la diluizione dei sieri, volume 4mL Acqua distillata o deionizzata Beuta da 1L per diluite la Soluzione di lavaggio HRP concentrata Lettore per piastre ELISA in grado di leggere a 450nm (e 620nm per le letture a doppia lunghezza d onda) Metodica Prima di incominciare 1. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26 o C) e mescolarli bene. 2. Diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone fornito con il kit a 975mL di acqua distillata o deionizzata. Se non si usa l intera piastra in una sola volta, si può preparare una minore quantità di soluzione di lavaggio aggiungendo 2,0mL di concentrato a 78mL di acqua distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 1 settimana a 2-8 o C. 3. Preparare una diluizione 1:101 di ciascun campione da testare aggiungendo 5µL di siero a 500µL di Diluente per campioni HRP. I campioni diluiti devono essere testati entro 8 ore dalla preparazione. NON DILUIRE i Controllo ELISA debolmente positivo H. pylori IgG, Controllo ELISA fortemente positivo H. pylori IgG ed Controllo ELISA Negativo. 4. La determinazione della presenza o dell assenza di H. pylori IgG usando unità arbitrarie richiede due pozzetti per ciascuno dei tre controlli ed uno o due pozzetti per ciascun campione clinico. Si raccomanda di testare i campioni in duplicato. Esecuzione del test 1. TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26 C) PRIMA DI INIZIARE IL TEST. Posizionare i pozzetti/le strisce necessarie nel supporto. Rimettere immediatamente la strisce inutilizzate nella busta contenente il materiale essicante e sigillarla bene per minimizzare l esposizione all umidità ambientale. 2. Distribuire 100µL dei Controlli ELISA debolmente positivo H. pylori IgG, ELISA fortemente positivo H. pylori IgG ed ELISA Negativo prediluiti e dei sieri diluiti nei rispettivi pozzetti. Coprire i pozzetti ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione inizia dopo l aggiunta dell ultimo campione. 3. Lavaggio: Aspirare completamente il contenuto di ciascun pozzetto. Distribuire µL di soluzione di lavaggio HRP diluita in tutti i pozzetti e quindi aspirarla. Ripetere questa operazione per altre due volte, per un totale di tre lavaggi. Dopo l ultimo lavaggio capovolgere la piastra e scuoterla fermamente su tovaglioli di carta assorbente per rimuovere eventuali residui di liquido. E importante vuotare completamente ciascun pozzetto dopo ciascun lavaggio. Per l aspirazione mantenere la stessa sequenza usata per l aggiunta dei campioni. 4. Distribuire 100μL di Coniugato HRP IgG in ciascun pozzetto. Il coniugato dovrebbe essere prelevato dal flacone mediante tecniche sterili. Prelevare dal flacone solo la quantità di coniugato necessaria per l esecuzione del test. PER EVITARE POSSIBILI CONTAMINAZIONI MICROBICHE E/O CHIMICHE, NON RIMETTERE MAI IL CONIUGATO INUTILIZZATO NEL FLACONE. Incubare i pozzetti per 30 minuti come descritto al punto Lavaggio: Ripetere la procedura descritta al punto Distribuire 100µL di Cromogeno TMB in ciascun pozzetto ed incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. 7. Distribuire 100µL di Soluzione di arresto HRP in ogni pozzetto. Per l aggiunta della Soluzione di arresto HRP mantenere la stessa sequenza e gli stessi tempi utilizzati per l aggiunta del Cromogeno TMB. Agitare gentilmente la piastra con le dita per mescolare completamente i reagenti nei pozzetti. 8. Leggere l assorbanza (OD) di ciascun pozzetto a 450nm entro 1 ora dall aggiunta della soluzione di arresto. Se si preferisce una lettura a doppia lunghezza d onda, si può usare la lunghezza d onda di 620nm come riferimento. 3

4 Controllo di qualità 1. I Controlli ELISA debolmente positivo H. pylori IgG, ELISA fortemente positivo H. pylori IgG ed ELISA Negativo devono essere inclusi ogni volta che si esegue il test per assicurare che tutti i reagenti ed il test funzionino in modo corretto. 2. Si deve notare che, poichè i Controlli ELISA debolmente positivo H. pylori IgG, ELISA fortemente positivo H. pylori IgG ed ELISA Negativo sono prediluiti, essi non rappresentano un controllo procedurale per le tecniche di diluizione utilizzate per i campioni. 3. Ulteriori controlli possono essere inclusi in base alle indicazioni o alle richieste delle vigenti regolamentazioni o delle organizzazioni di accreditamento. Ulteriori sieri di controllo possono essere preparati raccogliendo un pool dei sieri umani, aliquotandolo e conservandolo a < -20 C. 4. Perchè i risultati del test siano considerati validi, tutti i seguenti criteri devono essere soddisfatti. Se anche uno solo non rientra nei valori specificati, i risultati non dovrebbero essere considerati validi ed il test dovrebbe essere ripetuto. a. L assorbanza del Controllo ELISA fortemente positivo H. pylori IgG prediluito deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA debolmente positivo H. pylori IgG prediluito che a sua volta deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA Negativo prediluito. b. Il Controllo ELISA fortemente positivo H. pylori IgG prediluito deve avere un assorbanza maggiore di 1,0 mentre l assorbanza del Controllo ELISA Negativo prediluito non deve essere maggiore di 0,2. c. L assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo H. pylori IgG deve essere maggiore di due volte rispetto a quella del Controllo ELISA Negativo oppure >0,25. d. Il Controllo ELISA Negativo e quello ELISA fortemente positivo H. pylori IgG servono per controllare un eventuale malfunzionamento dei reagenti. Il Controllo ELISA fortemente positivo H. pylori IgG non assicura la precisione in corrispondenza del valore soglia del test. e. L utente del test dovrebbe fare riferimento al Documento C24-A dell NCCLS per ulteriori informazioni su appropriate tecniche di Controllo di Qualità. Calcolo dei risultati Si deve determinare innanzitutto il valore medio di assorbanza per ciascun set di duplicati. La reattività di ciascun campione viene quindi calcolata dividendo il valore medio di assorbanza del campione per il valore medio di assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo H. pylori IgG e moltiplicando il risultato per il numero di unità assegnate al Controllo ELISA debolmente positivo H. pylori IgG, che è stampato sull etichetta del flacone. Assorbanza campione Valore del campione = x Valore Controllo ELISA debolmente (unità) Assorbanza Controllo ELISA debolmente positivo H. pylori IgG (unità) positivo H. pylori IgG La reattività è collegata in modo non lineare alla quantità di anticorpi presente. Mentre gli aumenti e le diminuzioni delle concentrazioni degli anticorpi vengono evidenziate da un corrispondente aumento o diminuzione della reattività, il cambiamento non è proporzionale (ad es., un raddoppio della concentrazione di anticorpi non raddoppia necessariamente la reattività). Se si desidera una più accurata quantificazione del contenuto di anticorpi, si possono allestire e testare diluizioni seriate del campione. L ultima diluizione che risulta positiva nel test dovrebbe essere refertata come il titolo anticorpale del paziente. Interpretazione dei risultati Il metodo ELISA è molto sensibile alla procedura ed è in grado di individuare anche piccole differenze nella popolazione dei pazienti. I valori riportati qui di seguito sono solo valori suggeriti. Ciascun Laboratorio dovrebbe stabilire il proprio range di normalità basato sulla procedura da esso utilizzata, sui controlli, sull apparecchiatura e sulla popolazione di pazienti secondo le proprie metodiche standard. Il campione può essere quindi classificato come negativo, (assenza di IgG anti- H. pylori), dubbio o positivo (presenza di IgG anti- H. pylori) Unità Negativo 0,0 20,0 Dubbio 20,1 24,9 Positivo >25 I campioni che danno risultati dubbi dovrebbero essere ritestati prima di refertare i risultati. 1. Un risultato positivo indica solo una precedente esposizione immunologica ad H. pylori. Esso non è in grado di distinguere un infezione da H. pylori attiva da una inattiva. La presenza di infezione attiva viene stabilita mediante esame colturale del materiale bioptico, mediante urea breath test mediante urea marcata con 13 C or mendiante altri metodi di rilevazione dell ureasi. 2. Un campione con livelli dubbi di IgG anti-h. pylori non consente di determinare lo stato immunologico. Se il risultato rimane dubbio dopo la ripetizione del test, il risultato dovrebbe essere refertato come dubbio e/o si dovrebbe testare un campione successivo. 3. Un risultato negativo indica l assenza di anticorpi anti-h. pylori oppure la loro presenza a livelli inferiori rispetto al limite di sensibilità del test. Campioni prelevati troppo presto durante l infezione primaria possono presentare livelli di IgG non rilevabili. Se si sospetta un infezione primaria, si dovrebbe prelevare un altro campione a distanza di 4-6 settimane ed i due sieri dovrebbero essere testati contemporaneamente. 4

5 4. Sul referto del Laboratorio dovrebbe comparire la seguente indicazione: I seguenti risultati sono stati ottenuti mediante il kit QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA della INOVA. I valori di IgG ottenuti mediante test prodotti da altre Ditte non possono essere utilizzati in modo intercambiabile. Il valore del livello di IgG non può essere correlato ad un titolo endpoint. Limitazioni del test 1. Questo test rappresenta un aiuto per la diagnosi dell infezione da H. pylori. 2. Il test dovrebbe essere usato solo su campioni di pazienti con sintomi riferibili a malattia gastrointestinale e non su campioni di soggetti asintomatici. 3. Un risultato negativo nella ricerca di anticorpi non esclude la presenza di H. pylori perchè la concentrazione di anticorpi potrebbe essere inferiore al limite di sensibilità del metodo. 4. Se i campioni vengono prelevati troppo presto durante l infezione primaria, prima cioè della comparsa di anticorpi a livello rilevabile, si possono ottenere risultati negativi. Se c è il sospetto di un infezione da H. pylori, si dovrebbero prelevare dei campioni successivi 4-6 settimane più tardi e testarli in parallelo con il primo campione. 5. Un risultato positivo non consente di differenziare tra infezione attiva e colonizzazione da H. pylori. 6. Un risultato positivo indica solo la presenza di anticorpi anti-h. pylori e non necessariamente la presenza di malattia gastrointestinale. 7. I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e del risultato degli altri test sierologici. 8. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero. Valori attesi E stato stimato che circa il 50% della popolazione mondiale ha contratto l infezione da H. pylori. Nei Paesi in via di sviluppo il 50% o più della popolazione contre l infezione prima dei 10 anni di età, mentre nei Paesi industrializzati l infezione pediatrica non è frequente. La prevalenza di sieropositività aumenta di circa lo 0,5 1,0% per anno con l aumentare degli anni (cioè, si ha circa il 60% di sieropositività in corrispondenza del gruppo di 60 anni di età). 3,7,12,13. Range normale Due gruppi di soggetti sani, asintomatici (range di età: 18-75), uno di San Diego, CA e l altro di Buffalo, NY sono stati testati con il kit QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA. L 1,8% (1/53) dei sieri del gruppo di San Diego e l 11,3% (11/97) di quelli del gruppo di Buffalo risultavano positivi per la rpesenza di IgG anti-h. pylori. I dati dimostravano un aumento della sieropositività con l aumentare dell età, come segnalato in letteratura. Sensibilità e specificità relative Campioni studiati Le prestazioni del kit QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA sono state valutate testando un pannello di 295 campioni retrospettivi, confermati clinicamente, appartenenti a pazienti sottoposti ad endoscopia. La presenza di infezione da H. pylori è stata dimostrata mediante esame colturale, istologico, e mediante test CLO. I campioni sono stati considerati positivi per H. pylori se la coltura era positiva oppure se 2 dei 3 metodi davano risultati positivi. Tabella 1: Sensibilità e Specificità sul Pannello Clinico n= 295 INOVA H.pylori IgG POS DUBBI NEG Clinical POS* n= NEG n= *I campioni sono stati considerati positivi se la coltura era positiva oppure se risultavano positivi al test CLO o all esame istologico Sensibilità: 94,0% (141/150) Specificità: 92,0% (126/137) Concordanza: 93,0% (267/287) nota: i risultati dubbi sono stati esclusi dai calcoli Sebbene al momento della raccolta del campione i pazienti siano stati classificati come negativi mediante esame colturale, istologico, e mediante test CLO, esiste il sospetto che alcuni pazienti fossero stati esposti in precedenza a H. pylori a causa della forte positività per IgG osservata in alcuni campioni negativi. Pertanto 7 degli 11 campioni clinicamente negativi risultati positivi con il test QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA della INOVA sono stati ritestati mediante un altro kit per la ricerca di IgG anti-h. pylori approvato dall FDA per l uso diagnostico in vitro. Sei di questi campioni sono risultati positivi ed 1 dubbio con l altro kit commerciale. Risultati di uno studio cieco su un pannello di campioni clinici presso tre Laboratori I risultati ottenuti su un pannello di 40 campioni clinici ciechi durante uno studio condotto presso 3 Laboratori sono riassunti nella Tabella 2. La specificità è risultata pari al 100% (10/10) presso i 3 Centri. La sensibilità è risultata pari al 96,3% presso il Centro 1, al 96,6% presso il Centro 2, ed al 93,1% presso il Centro 3 5

6 Tabella 2: Sensibilità e Specificità del test QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA ottenute presso 3 Centri su un pannello di campioni clinici ciechi. Centro 1 Centro 2 Centro 3 Sensibilità N=30 96,3% (26/27) 96,6% (28/29) 93,1% (27/29) Specificità N=10 100% (10/10) 100% (10/10) 100% (10/10) Concordanza totale 97,3% (36/37) 97,4% (38/39) 94,9% (37/39) Nota: I risultati dubbi non sono inclusi. Validazioen del valore soglia Il valore soglia per questo test è stato validato testando il pannello di campioni clinici ed usando l analisi ROC (Receiver Operating Characteristics) del valore soglia 11. Analisi ROC L analisi ROC fornisce una stima dell accuratezza diagnostica del test INOVA H. pylori IgG paragonata al quadro clinico descritto di ciascun paziente. Inoltre essa consente la validazione del valore soglia del metodo 11. L analisi conferma l uso dei range interpretativi stabiliti per questo kit. Studio delle reazioni crociate Uno studio di adsorbimento è stato condotto per valurare eventuali reazioni crociate tra antigeni batterici ed il test INOVA QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA. Brevemente, sieri con diversi livelli di anticorpi anti-h. pylori sono stati adsorbiti con antigeni di H. pylori, C. jejuni, C. coli, C. fetus, o di E. coli e successivamente i campioni trattati e non trattati di siero sono stati testati con il test per le IgG anti-h. pylori. Tutti i campioni sieropositivi per H. pylori sono rimasti sieropositivi dopo l adsorbinmento con gli antigeni diversi da H. pylori. La percentuale media di inibizione era pari all 82,1% con l antigene di H. pylori ed al 2,9% con antigeni di altri microorganismi. E stata valutata anche l eventuale interferenza dovuta alla presenza di anticorpi antinucleo (5 sieri), fattore reumatoide (5 sieri), e di anticorpi anti-dna (5 sieri) ed è stato dimostrato che la specificità del test INOVA QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA non è influenzata da questi autoanticorpi. Interferenze Sono stati condotti due studi per determinare se la presenza di alti livelli di bilirubina, colesterolo o trigliceridi nei campioni di siero possono interferire con il test QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA. Nel primo, 20 campioni di siero (6 positivi e 14 negativi per H. pylori) sono stati testati con e senza l aggiunta di bilirubina (40x i livelli normali) o emoglobina (66x i livelli normali). Nel corso del secondo studio ai sieri positivi per H. pylori sono aggiunti sieri contenenti elevati livelli di colesterolo, trigliceridi o bilirubina. I risultati hanno dimostrato che nessuna di queste sostanze interferiva con il test QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA. Precisione e riproducibilità La variazione inter-test è stata stabilita testando in duplicato un pannello cieco di 14 campioni comprendente 2 sieri negativi, 3 bassi positivi, 2 moderatamente positivi e 1 fortemente positivo ed i controlli negativo, basso ed alto positivo del kit per due volte al giorno (una volta al mattino ed una al pomeriggio) per 3 giorni presso ciascuno dei tre Centri. Tabella 4: Prestazioni Inter-Test Combinate Per I Tre Centri Siero R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 R13 R14 NC LPC HPC SRU 46,7 23,8 30,2 46,5 45,6 25 4,2 24, ,6 3,5 4,0 25,8 3,4 4, ,6 SD 2,4 2,3 4,9 2,3 2,5 3,4 2,6 2,9 3,0 8,8 2,7 3,0 2,5 2,8 3,2 0 5 CV% Le prestazioni intra-test sono state determinate testando 15 volte 6 campioni, comprendenti un siero negativo, uno dubbio, un positivo borderline, uno basso positivo, uno moderatamente positivo ed uno altamente positivo. I risultati sono riassunti nella Tabella 5. Tabella 5: Prestazioni intra-test del kit QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA Siero 1 Siero 2 Siero 3 Siero 4 Siero 5 Siero 6 Mean 84,03 99,28 31,98 25,96 21,12 2,98 S.D. 3,09 4,21 1,44 1,52 0,91 0,30 C.V.% 3,6 4,2 4,5 5,9 4,3 10,1 6

7 Linearità Per determinare la linearità del test QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA 4 campioni sono stati diluiti in modo seriato da 1:50 a 1:51,200 e tesatti con il kit QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA. L analisi ha dimostrato che il test era lineare da circa unità all estremità inferiore ad almeno 121 unità all estremità superiore. I valori R 2 per i 4 sieri diluiti erano pari a 0,99 o migliori. SRU QUANTA Lite H. pylori IgG ELISA Linearità 1:50 1:200 1:800 1:3200 Diluzione SRU BL - 63 SRU BL - 77 SRU BL - 95 SRU BL - 96 Lineare (SRU BL - 95) Lineare (SRU BL - 96) Lineare (SRU BL - 63) Lineare (SRU BL - 77) y = -18,159x + 138,35 R 2 = 0,9934 y = -10,639x + 86,575 R 2 = 0,9937 y = -13,894x + 119,42 R 2 = 0,9903 y = -15,844x + 120,41 R 2 = 0,9885 7

8 Bibliografia 1. Marshall BJ Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis. Lancet, ii: Walsh JH and Peterson WL The treatment of Helicobacter pylori infection in the management of peptic ulcer disease. N.Engl. J. Med. 333(15): Blaser MJ Helicobacter pylori: its role in disease. Clin. Infect. Dis. 15: The Eurogast Study Group An international association between H. pylori infection and gastric cancer. Lancet 341(8857): NIH Concensus Development Panel on Helicobacter pylori in Peptic Ulcer Disease JAMA 272: Malfertheiner P, et al Current European concept in the mangement of Helicobacter pylori infection- the Maastricht concensus report. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 9: Hirschl AM, et al Kinetics of specific IgG antibodies for monitoring the effect of anti- Helicobacter pylori chemotherapy. J. Infect. Dis. 168: Bourke B, Jones N, and Sherman P Helicobacter pylori infection and peptic ulcer disease in children. Ped. Infect. Dis. J. 15: Patel P, et al Prospective screening of dyspeptic patients by Helicobacter pylori serology. Lancet 346: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. 11. National Committee for Clinical Laboratory Standards Assessment of the Clinical Accuracy of Laboratory Tests using receiver operating characteristic (ROC) Plots; approved guideline (NCCLS document GP10-A), Wayne, PA. 12. Megraud F, et al Seroepidemiology of Campylobacter pylori infection in various populations. J. Clin. Microbiol. 27: Veldhuyzen SJO, et al Increasing prevalence of H. pylori infection with Age: Continuous risk of infection in adults rather than cohort effect. J. Infect. Dis. 169: Fornitore: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Rappresentante Autorizzato: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service ITA November 2009 Revision 4 8