QUANTA Lite TM H. pylori IgA ELISA Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata

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1 QUANTA Lite TM H. pylori IgA ELISA Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata Finalità d uso Il kit QUANTA Lite TM H. pylori IgA è un saggio di immunoassorbenza enzimatica (ELISA) per la determinazione qualitativa degli anticorpi IgA verso H. pylori (Helicobacter pylori) nel siero umano. Il test è stato ideato per facilitare la diagnosi dell infezione causata da H. pylori nei pazienti sintomatici adulti di 18 anni od oltre, che presentano i sintomi clinici di una patologia gastrointestinale. QUANTA Lite TM H. pylori IgA deve essere eseguito ed interpretato contemporaneamente al QUANTA Lite TM H. pylori IgG per la determinazione degli anticorpi IgG verso H. pylori. Riassunto e Spiegazione del test La relazione causale tra infezione da H. pylori e ulcera peptica è stata accertata dopo la prima indicazione della correlazione, avvenuta nel L infezione da H. pylori è presente in oltre il 95% dei pazienti con ulcera duodenale e nell 80% di quelli con ulcera gastrica; è associata anche a carcinoma e linfoma gastrico 2-5. L eradicazione dell infezione da H. pylori riduce la recidiva dell ulcera 2-5. Il trattamento dell infezione causata da H. pylori è stato consigliato nei pazienti con ulcera duodenale o gastrica e, recentemente, in quelli con dispepsia funzionale 5-6. La diagnosi dell infezione da H. pylori include metodi sia invasivi, sia non invasivi. I test invasivi comprendono l endoscopia con la quale è possibile osservare direttamente la mucosa antrale gastrica ed eseguire prelievi bioptici da sottoporre al test dell ureasi, agli esami istologici con colorazione (Warthin- Starry) e agli esami colturali 5-7. L esame colturale è considerato il sistema migliore benché si tratti del test meno sensibile (sensibilità del 70-80%). Il test istologico e quello dell ureasi hanno sensibilità e specificità che superano il 90% 5. Gli svantaggi principali dei metodi invasivi sono i rischi associati ed il disagio per il paziente, il costo elevato e i risultati falsi negativi causati dalla distribuzione irregolare di H. pylori nello stomaco. Gli esami non invasivi comprendono il test dell alito che utilizza urea marcata con 14 C o 13 C e i test sierologici. Il test dell alito è sensibile e specifico ma molto costoso. La sierologia fornisce un alternativa economica, sensibile e specifica alle procedure invasive e/o costose come ad esempio l endoscopia e il test dell alito con urea marcata con 14 C 2,3,5,8,9. Nella maggior parte dei casi, il rilevamento degli anticorpi tipo IgG verso H. pylori fornisce una determinazione accurata dell infezione da H. pylori con sensibilità e specificità di oltre il 90%. Tuttavia, circa il 2-7% dei pazienti esaminati per rilevare la presenza di anticorpi verso H. pylori, sia del tipo IgG, sia di quello IgA, è risultato negativo per IgG verso H. pylori ma positivo per IgA verso H. pylori 12,15,16,18. La misurazione dei soli anticorpi IgG può quindi non rilevare alcuni casi reali di infezione da H. pylori impedendo a questi pazienti di ricevere il trattamento o facendo loro subire procedure più costose e spesso invasive. Oltre alla scoperta di alcuni pazienti probabilmente sfuggiti ai test IgG verso H. pylori, altri studi che sostengono l utilità clinica di misurare gli anticorpi IgA verso H. pylori indicano che: 1) livelli elevati di anticorpi IgA verso H. pylori, oltre a livelli ridotti di pepsinogeno I serico, sono fattori di rischio per la neoplasia gastrica 17, 2) dopo il trattamento, i livelli degli anticorpi IgA possono diminuire più rapidamente rispetto a quelli di IgG 15, 3) la rilevazione degli anticorpi IgA verso H. pylori può facilitare la diagnosi nei soggetti sintomatici con valori dubbi o ridotti di IgG verso H. pylori e 4) il rapporto tra i valori anticorpali IgA e IgG può essere correlato al grado di gastrite cronica causata da H. pylori 19. Principio della Metodica L antigene purificato H. pylori è adsorbito sulla parete dei pozzetti di una piastra microtiter di polistirene in condizioni adatte a conservare l antigene nel suo stato nativo. I controlli pre-diluiti ed i sieri diluiti dei pazienti vengono distribuiti nei pozzetti corrispondenti, consentendo agli anticorpi anti-mitocondrio eventualmente presenti di legarsi all antigene adsorbito. L eccesso di campione non legato viene allontanato mediante il lavaggio e successivamente si aggiunge a ciascun pozzetto un anticorpo anti-iga umane marcato con un enzima. Una seconda incubazione consente agli anticorpi anti-iga umane marcati con l enzima di legarsi agli anticorpi del paziente che si sono eventualmente legati alla parete dei pozzetti. Dopo ulteriore lavaggio per allontanare l eccesso di anticorpi anti-iga umane marcati con l enzima, l attività dell enzima rimasto viene misurata aggiungendo un substrato cromogenico e misurando l intensità del colore che si sviluppa. Il test può essere letto mediante uno spettrofotometro ed interpretato confrontando l intensità del colore che si sviluppa nei pozzetti dei campioni con quella dei pozzetti dei controlli. Reagenti 1. Piastra microtiter ELISA in polistirene adsorbita con antigene H. pylori purificato, (12-1 x 8 pozzetti), con supporto, in busta chiusa contenente materiale essicante 2. Controllo ELISA Negativo, 1 flacone di tampone contenente conservante e siero umano senza IgA anticorpi umani anti-h. pylori, prediluito, 1,2mL 3. Controllo ELISA fortemente positivo per H. pylori IgA, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani IgA anti-h. pylori, prediluito, 1,2mL 4. Controllo ELISA debolmente positivo per H. pylori IgA, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani IgA anti-h. pylori, prediluito, 1,2mL 5. Diluente per campioni HRP, 1 flacone di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween 20, stabilizzatori delle proteine e conservante, 50mL 1

2 6. Soluzione di lavaggio HRP Concentrata, 1 flacone di soluzione concentrata 40x di colore rosso contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris e Tween 20, 25mL. Vedi la Sezione Metodi per le istruzioni sulla diluizione. 7. Coniugato HRP IgA, (montone), anti-iga umane, 1 flacone di colore giallo-chiaro, contenente tampone, stabilizzatori delle proteine e conservante, 10mL 8. Cromogeno TMB, 1 flacone contenente stabilizzatori, 10mL 9. Soluzione di arresto HRP, Acido solforico 0,344M, 1 flacone incolore, 10mL Avvertenze 1. ATTENZIONE: Questo prodotto contiene un composto chimico (cloramfenicolo allo 0,02%) nel diluente per i campioni, nei controlli e nel coniugato, noto allo Stato della California come causa di tumori. 2. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-hiv, per HBsAg e per anticorpi anti- HCV mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controlli ELISA fortemente positivo H. pylori IgA, ELISA debolmente positivo H. pylori IgA ed ELISA Negativo devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. 4. Il Coniugato HRP contiene un composto chimico velenoso/corrosivo, che può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 5. Il Cromogeno TMB contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. 6. La Soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. Evitare l esposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L acido solforico è velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 7. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 8. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili. 3. Un lavaggio incompleto o non accurato e l insufficiente aspirazione del liquido dai pozzetti ELISA può causare una scarsa precisione e/o un elevato background. 4. L adattamento di questo test all uso con apparecchiature automatiche e altri dispositivi per trattamento dei campioni liquidi, in toto o in parte, può causare differenze nei risultati rispetto a quelli ottenuti mediante la procedura manuale. E responsabilità di ciascun Laboratorio confermare che le procedure automatizzate utilizzate diano risultati entro limiti di accettabilità. 5. Una serie di fattori influenza le prestazioni del test. Essi comprendono l iniziale temperatura dei reagenti, la temperatura dell ambiente, l accuratezza e la riproducibilità della tecnica di pipettamento, la scrupolosità delle operazioni di lavaggio e di aspirazione del liquido dai pozzetti delle piastre ELISA, il tipo di spettrofotometro usato per leggere i risultati e la lunghezza dei tempi di incubazione durante l esecuzione del test. Bisogna prestare molta attenzione alla costanza per ottenere risultati accurati e riproducibili. 6. Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite. 7. Una chiusura incompleta della busta richiudibile contenente le strisce di pozzetti ed il materiale essicante causa la degradazione dell antigene ed una scarsa precisione nei risultati. 8. Valori di assorbanza inaccettabilmente bassi possono essere osservati dopo aver usato due o più volte lo stesso flacone di coniugato HRP per un certo periodo di tempo. E importante seguire attentamente le istruzioni fornite per il trattamento del coniugato HRP per evitare tale inconveniente. 9. Un eventuale contaminazione chimica del coniugato HRP può essere conseguenza di una impropria pulizia o risciacquo di apparecchi o di strumenti. Residui di comuni reagenti chimici di laboratorio quali formalina, candeggina, etanolo o detergenti causano la degradazione nel tempo del coniugato HRP. Risciacquare molto accuratamente tutti gli apparecchi e gli strumenti dopo l uso di detergenti chimici. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. 2. Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile contenente il materiale essicante e conservate nella busta ben chiusa a 2-8 C. 3. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 1 settimana a 2-8 C. 2

3 Raccolta dei campioni Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L aggiunta al campione di sodio azide o di altri conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l uso di sieri fortemente emolizzati o lipemici. Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A dell NCCLS raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8 C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a -20 C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati. I campioni congelati e scongelati più volte non sono indicati. Procedura Materiali forniti 1 Piastra microtiter ELISA H. pylori IgA, (12-1 x 8 pozzetti), con supporto 1 1,2mL Controllo ELISA Negativo prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA debolmente positivo H. pylori IgA prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA fortemente positivo H. pylori IgA prediluito 1 50mL Diluente per campioni HRP 1 25mL Soluzione di lavaggio HRP concentrata, 40x concentrata 1 10mL Coniugato HRP IgA, (montone), anti-iga umane 1 10mL Cromogeno TMB 1 10mL Soluzione di arresto HRP, 0,344M Acido solforico Materiali richiesti ma non forniti Micropipette in grado di erogare volume di 5, 100, , e 500µL Puntali monouso per micropipette Provette per la diluizione dei sieri, volume 4mL Acqua distillata o deionizzata Beuta da 1L per diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata Lettore per piastre ELISA in grado di leggere a 450nm (e 620nm per le letture a doppia lunghezza d onda) Metodica Prima di incominciare 1. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26 o C) e mescolarli bene. 2. Diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone fornito con il kit a 975mL di acqua distillata o deionizzata. Se non si usa l intera piastra in una sola volta, si può preparare una minore quantità di soluzione di lavaggio aggiungendo 2,0mL di concentrato a 78mL di acqua distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 1 settimana a 2-8 o C. 3. Preparare una diluizione 1:101 di ciascun campione da testare aggiungendo 5µL di siero a 500µL di Diluente per campioni HRP. I campioni diluiti devono essere testati entro 8 ore dalla preparazione. NON DILUIRE i Controlli ELISA debolmente positivo H. pylori IgA, ELISA fortemente positivo H. pylori IgA ed ELISA Negativo. 4. La determinazione della presenza o dell assenza di anticorpi anti-h. pylori usando unità arbitrarie richiede due pozzetti per ciascuno dei tre controlli ed uno o due pozzetti per ciascun campione clinico. Si raccomanda di testare i campioni in duplicato. Esecuzione del test 1. TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26 C) PRIMA DI INIZIARE IL TEST. Posizionare i pozzetti/le strisce necessarie nel supporto. Rimettere immediatamente la strisce inutilizzate nella busta contenente il materiale essicante e sigillarla bene per minimizzare l esposizione all umidità ambientale. 2. Distribuire 100µL dei Controlli ELISA debolmente positivo H. pylori IgA, ELISA fortemente positivo H. pylori IgA ed ELISA Negativo prediluiti e dei sieri diluiti nei rispettivi pozzetti. Coprire i pozzetti ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione inizia dopo l aggiunta dell ultimo campione. 3. Lavaggio: Aspirare completamente il contenuto di ciascun pozzetto. Distribuire µL di soluzione di lavaggio HRP diluita in tutti i pozzetti e quindi aspirarla. Ripetere questa operazione per altre due volte, per un totale di tre lavaggi. Dopo l ultimo lavaggio capovolgere la piastra e scuoterla fermamente su tovaglioli di carta assorbente per rimuovere eventuali residui di liquido. E importante vuotare completamente ciascun pozzetto dopo ciascun lavaggio. Per l aspirazione mantenere la stessa sequenza usata per l aggiunta dei campioni. 4. Distribuire 100μL di Coniugato HRP IgA in ciascun pozzetto. Il coniugato dovrebbe essere prelevato dal flacone mediante tecniche sterili. Prelevare dal flacone solo la quantità di coniugato necessaria per l esecuzione del test. PER EVITARE POSSIBILI CONTAMINAZIONI MICROBICHE E/O CHIMICHE, NON RIMETTERE MAI IL CONIUGATO INUTILIZZATO NEL FLACONE. Incubare i pozzetti per 30 minuti come descritto al punto 2. 3

4 5. Lavaggio: Ripetere la procedura descritta al punto Distribuire 100µL di Cromogeno TMB in ciascun pozzetto ed incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. 7. Distribuire 100µL di Soluzione di arresto HRP in ogni pozzetto. Per l aggiunta della Soluzione di arresto HRP mantenere la stessa sequenza e gli stessi tempi utilizzati per l aggiunta del Cromogeno TMB. Agitare gentilmente la piastra con le dita per mescolare completamente i reagenti nei pozzetti. 8. Leggere l assorbanza (OD) di ciascun pozzetto a 450nm entro 1 ora dall aggiunta della soluzione di arresto. Se si preferisce una lettura a doppia lunghezza d onda, si può usare la lunghezza d onda di 620nm come riferimento. Controllo di qualità 1. I Controlli ELISA debolmente positivo H. pylori IgA, ELISA fortemente positivo H. pylori IgA ed ELISA Negativo devono essere inclusi ogni volta che si esegue il test per assicurare che tutti i reagenti ed il test funzionino in modo corretto. 2. Si deve notare che, poichè i Controlli ELISA debolmente positivo H. pylori IgA, ELISA fortemente positivo H. pylori IgA ed ELISA Negativo sono prediluiti, essi non rappresentano un controllo procedurale per le tecniche di diluizione utilizzate per i campioni. 3. Ulteriori controlli possono essere inclusi in base alle indicazioni o alle richieste delle vigenti regolamentazioni o delle organizzazioni di accreditamento. Ulteriori sieri di controllo possono essere preparati raccogliendo un pool dei sieri umani, aliquotandolo e conservandolo a < -20 O C. 4. Perchè i risultati del test siano considerati validi, tutti i seguenti criteri devono essere soddisfatti. Se anche uno solo non rientra nei valori specificati, i risultati non dovrebbero essere considerati validi ed il test dovrebbe essere ripetuto. a. L assorbanza del Controllo ELISA fortemente positivo H. pylori IgA prediluito deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA debolmente positivo H. pylori IgA prediluito che a sua volta deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA Negativo prediluito. b. Il Controllo ELISA fortemente positivo H. pylori IgA prediluito deve avere un assorbanza maggiore di 1,0 mentre l assorbanza del Controllo ELISA Negativo prediluito non deve essere maggiore di 0,2. c. L assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo H. pylori IgA deve essere maggiore di due volte rispetto a quella del Controllo ELISA Negativo oppure maggiore di 0,25. d. Il Controllo ELISA Negativo e quello ELISA fortemente positivo H. pylori IgA servono per controllare un eventuale malfunzionamento dei reagenti. Il Controllo ELISA fortemente positivo H. pylori IgA non assicura la precisione in corrispondenza del valore soglia del test. e. L utente del test dovrebbe fare riferimento al Documento C24-A 11 dell NCCLS per ulteriori informazioni su appropriate tecniche di Controllo di Qualità. Calcolo dei risultati Si deve determinare innanzitutto il valore medio di assorbanza per ciascun set di duplicati. La reattività di ciascun campione viene quindi calcolata dividendo il valore medio di assorbanza del campione per il valore medio di assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo H. pylori e moltiplicando il risultato per il numero di unità assegnate al Controllo ELISA debolmente positivo H. pylori, che è stampato sull etichetta del flacone. Assorbanza campione Valore del campione = (unità) Assorbanza Controllo ELISA debolmente positivo H. pylori IgA x Valore Controllo ELISA debolmente positivo H. pylori IgA (unità) La reattività è collegata in modo non lineare alla quantità di anticorpi presente. Mentre gli aumenti e le diminuzioni delle concentrazioni degli anticorpi vengono evidenziate da un corrispondente aumento o diminuzione della reattività, il cambiamento non è proporzionale (ad es., un raddoppio della concentrazione di anticorpi non raddoppia necessariamente la reattività). Se si desidera una più accurata quantificazione del contenuto di anticorpi, si possono allestire e testare diluizioni seriate del campione. L ultima diluizione che risulta positiva nel test dovrebbe essere refertata come il titolo anticorpale del paziente. Interpretazione dei risultati Il metodo ELISA è molto sensibile alla procedura ed è in grado di individuare anche piccole differenze nella popolazione dei pazienti. I valori riportati qui di seguito sono solo valori suggeriti. Ciascun Laboratorio dovrebbe stabilire il proprio range di normalità basato sulla procedura da esso utilizzata, sui controlli, sull apparecchiatura e sulla popolazione di pazienti secondo le proprie metodiche standard. Il campione può essere quindi classificato come negativo, (assenza di IgA anti- H. pylori), dubbio o positivo (presenza di IgA anti- H. pylori) Unità Negativo 0,0 20,0 Dubbio 20,1 24,9 Positivo >25 I campioni che danno risultati dubbi dovrebbero essere ritestati prima di refertare i risultati. 4

5 1. QUANTA Lite TM H. pylori IgA ELISA deve essere eseguito ed interpretato assieme al saggio QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA per la determinazione degli anticorpi IgG verso H. pylori. Alcuni campioni possono essere negativi per anticorpi IgA verso H. pylori e positivi per anticorpi IgG verso H. pylori, mentre altri possono essere positivi per anticorpi IgA verso H. pylori e negativi per anticorpi IgG verso H. pylori. Non sono stati raccolti dati sufficienti sull efficienza e sull interpretazione dei campioni positivi per anticorpi IgA verso H. pylori e negativi per anticorpi IgG verso H. pylori ed è perciò giustificato un ulteriore periodo di follow-up. 2. Un risultato positivo indica soltanto una precedente esposizione immunologica verso H. pylori. Non è possibile distinguere la forma attiva dell infezione causata da H. pylori da quella inattiva. L infezione attiva è accertabile tramite coltura o biopsia, con il test dell alito con urea marcata con 14 C, o mediante altri metodi di rilevamento che utilizzano l ureasi. 3. Non è possibile eseguire l accertamento dello stato anticorpale in un campione con livelli dubbi di IgA verso H. pylori. Se i risultati restano dubbi dopo test ripetuti, dichiararli come tali e/o eseguire un altro prelievo. 4. Un risultato negativo indica l assenza di anticorpi IgA verso H. pylori o livelli inferiori al limite di rilevamento del saggio. I campioni prelevati troppo precocemente durante l infezione primaria possono contenere livelli non rilevabili di anticorpi IgA. In caso di sospetta infezione primaria, è necessario prelevare un altro campione entro 4-6 settimane ed esaminarlo nella stessa sessione di analisi assieme al campione originale. 5. Sul referto si dovrebbe riportare la seguente frase: I seguenti risultati sono stati ottenuti mediante il test QUANTA Lite TM H. pylori IgA ELISA della INOVA. I valori H. pylori ottenuti con test prodotti da altre Ditte possono non essere utilizzabili in modo intercambiabile. Il livello di IgG determinato con questo metodo non può essere correlato ad un titolo endpoint. Limitazioni del test 1. La presenza nel campione di complessi immuni o di altri aggregati di immunoglobuline può causare un aumento del livello di reazioni aspecifiche con conseguenti risultati falsi positivi con questo test. 2. Questo test ha lo scopo di facilitare la diagnosi dell infezione da H. pylori nei soggetti con sintomi che suggeriscono una patologia gastrointestinale, mentre non è indicato nei pazienti asintomatici. 3. Il test può essere utilizzato come complemento, ma non può sostituire i test per indagini di massa che hanno lo scopo di rilevare la presenza degli anticorpi IgG verso H. pylori. Non bisogna riportare i risultati delle IgA verso H. pylori senza i corrispondenti risultati delle IgG. 4. Un risultato negativo per IgA verso H. pylori non esclude la presenza di questo microrganismo dato che molti soggetti con infezione precedente o in corso causata da H. pylori possono comunque mostrare negatività per questo parametro. 5. Un risultato negativo per anticorpi IgA verso H. pylori non esclude la presenza di questo microrganismo perché la concentrazione anticorpale può essere inferiore al limite di rilevamento del saggio. 6. È possibile avere risultati negativi se i campioni sono prelevati troppo precocemente nel corso dell infezione, prima della comparsa di livelli anticorpali rilevabili. In caso di sospetta infezione da H. pylori, è necessario prelevare nuovi campioni 4-6 settimane più tardi ed esaminarli in parallelo con il primo campione. 7. La positività del campione non permette di distinguere tra infezione attiva ed insediamento di H. pylori. 8. La positività del campione indica soltanto la presenza di anticorpi verso H. pylori e non implica necessariamente la presenza di una patologia gastrointestinale. 9. I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e del risultato degli altri test sierologici. 10. Questo saggio non è stato validato in pazienti d età inferiore a 18 anni. 11. I riferimenti bibliografici hanno suggerito che gli anticorpi verso Pseudomonas spp. possono creare una reazione crociata con H. pylori. L efficienza di questo saggio per siero contenente anticorpi antipseudomonas non è stata valutata. 12. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero. Valori attesi Si ritiene che circa il 50% della popolazione mondiale sia infettata da H. pylori. Nei paesi in via di sviluppo il 50% o più della popolazione è infettata da H. pylori fin dall età di 10 anni, mentre nelle nazioni sviluppate l infezione in età infantile è rara. La sieroprevalenza degli anticorpi IgG verso H. pylori aumenta di circa 0,5-1% per anno con l avanzare dell età (ovvero nei soggetti anziani con 60 anni d età la sieroprevalenza è di circa il 60%) 3,7,13,14. I soggetti infetti hanno anche mostrato di produrre anticorpi IgA verso H. pylori. Un numero ridotto (2-7%) di soggetti è risultato positivo per anticorpi IgA verso H. pylori e negativo per anticorpi IgG 12,15,16,18. La capacità di QUANTA Lite TM H. pylori IgA ELISA di rilevare gli anticorpi IgA verso H. pylori è stata valutata per confronto con un test H. pylori IgA ELISA già in commercio e valutando campioni di pazienti con diagnosi clinica certa. I risultati del test H. pylori IgA ELISA in commercio sono stati determinati seguendo le indicazioni fornite dal produttore. 5

6 Range normale Un pannello di 120 campioni prelevati da soggetti sani ed asintomatici (intervallo d età 17-75, valore medio 35) è stato esaminato utilizzando QUANTA Lite TM H. pylori IgA ELISA. Tra questi 120 campioni, il 9% (11/120) ha mostrato positività per IgA verso H. pylori. Una volta esclusi i campioni positivi per IgG verso H. pylori o con risultati dubbi, il 2,8% (3/105) è risultato positivo per gli anticorpi IgA verso H. pylori (e negativo per i corrispondenti anticorpi IgG). Questo porta ad una specificità calcolata del 97,1% (102/105) [CI 95% = 91,9-99,4]. Osservazioni Sull efficienza Specifica del Test L efficienza del saggio QUANTA Lite H. pylori IgA ELISA è stata confrontata con un comune H. pylori IgA ELISA validato. Con entrambi i saggi sono stati esaminati 145 campioni inviati per la determinazione degli anticorpi verso H. pylori, 8 EQAS (programma di valutazione esterna di qualità), più 100 campioni provenienti da soggetti sani ed asintomatici. Tra i 235 campioni, 130 sono risultati positivi e 91 negativi con entrambi i metodi. Tabella 1: H.pylori IgA ELISA validato + +/- - QUANTA Lite % concordanza positiva: 91,5% (130/142) H. pylori IgA ELISA +/ % concordanza negativa: 90,1% (91/101) Campioni in esame Un totale di 111 campioni di siero conservato, prelevati da pazienti con infezione da H. pylori, confermata con l uso contemporaneo di UBT (test dell alito), CLO (test per microrganismi tipo Campylobacter), esami istologici e/o colturali, è stato sottoposto ad analisi con il kit Quanta lite H. pylori IgA ELISA. Tabella 2: Metodo di riferimento + QUANTA Lite H. pylori IgA ELISA /- 8-3 Sensibilità (senza escludere l equivalenza) = 90,1% (100/111), [95% CI =83,0%-94,9%] Analisi della reattività crociata È stato eseguito uno studio di adsorbimento per valutare la reattività crociata degli antigeni batterici con INOVA QUANTA Lite TM H. pylori IgA ELISA. In breve, sieri con livelli variabili di anticorpi verso H. pylori sono stati adsorbiti con antigeni di H. pylori, C. jejuni, C. coli, C. fetus, o E. coli ed i campioni di siero, sia quelli non trattati, sia quelli adsorbiti, sono stati analizzati con il saggio H. pylori IgA. Tutti i campioni sieropositivi per H. pylori sono rimasti tali anche dopo assorbimento con antigeni diversi da H. pylori. L inibizione percentuale media era dell 82% con l antigene H. pylori e del 10% con antigeni derivati da altri microrganismi. È stata anche valutata la reattività crociata causata dalla presenza del fattore reumatoide (3 campioni di siero) anti-nucleare (3 campioni di siero), delle beta-2 microglobuline (3 campioni di siero), o degli anticorpi per B. burgdorferi (11 campioni di siero) ed essa non ha mostrato di influire sulla specificità di INOVA QUANTA Lite TM H. pylori IgA ELISA. Interferenza Per stabilire se la presenza di livelli elevati di bilirubina, emoglobina, colesterolo o trigliceridi nei campioni di siero potesse interferire con QUANTA Lite TM H. pylori IgA ELISA, sono stati eseguiti due studi. Nel primo, 6 campioni di siero (4 positivi e 2 negativi per H. pylori) sono stati analizzati con e senza l aggiunta di bilirubina (40 volte il livello normale) o di emoglobina (66 volte il valore normale). Un secondo studio è consistito nel correggere un siero positivo per H. pylori con uno contenente livelli elevati di colesterolo (3), trigliceridi (1), o bilirubina (2). Sebbene non sembri che livelli elevati di bilirubina, emoglobina, o colesterolo possano interferire con il saggio, livelli elevati di trigliceridi (un campione) hanno mostrato un certo livello di interferenza. Riproducibilità/accuratezza L efficienza intra-analisi è stata valutata esaminando per 12 volte 6 campioni, comprendenti i risultati negativo, dubbio, ai limiti della positività, debolmente positivo, moderatamente positivo e fortemente positivo. I risultati sono riassunti nella Tabella 3. Tabella 3: efficienza intra-analisi di QUANTA Lite TM H. pylori IgA ELISA Siero 1 Siero 2 Siero 3 Siero 4 Siero 5 Siero 6 Media 52, ,84 15,9 7,00 29,6 S.D. 2,15 2,18 0,72 1,2 0,68 1,19 C.V. % 4,74 3,8 1,77 7,56 9,72 4,03 L efficienza inter-analisi è stata valutata esaminando per un totale di sei volte nel giro di tre giorni 13 campioni comprendenti i risultati negativo, debolmente positivo, moderatamente e fortemente positivo. Sono state eseguite due sessioni al giorno, una il mattino e l altra nel pomeriggio. I risultati sono riassunti nella Tabella 4. 6

7 Tabella 4: efficienza inter-analisi di QUANTA Lite TM H. pylori IgA ELISA Siero 1 Siero 2 Siero 3 Siero 4 Siero 5Siero 6Siero 7Siero 8Siero 9Siero 10Siero 11Siero 12Siero 13 Media 53,7 6,1 54, ,5 19,1 43,4 49,4 31,1 5,8 26,7 28,9 36,7 S.D. 1,25 0,25 3,8 3,94 1,65 0,87 1,46 1,97 1,53 0,35 1,38 2,48 2,51 C.V.% 2,3 4,1 6,9 7,4 9,5 4,6 3,4 4,0 4,9 6,0 5,2 8,6 6,9 Bibliografia 1. Marshall BJ: Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis. Lancet, ii , Walsh JH and Peterson WL: The treatment of Helicobacter pylori infection in the management of peptic ulcer disease. N.Engl. J. Med. 333(15): , Blaser MJ: Helicobacter pylori: its role in disease. Clin. Infect. Dis. 15: , The Eurogast Study Group. An international association between H. pylori infection and gastric cancer. Lancet 341(8857): NIH Concensus Development Panel on Helicobacter pylori in Peptic Ulcer Disease. JAMA , Malfertheiner P, et.al.: Current European concept in the management of Helicobacter pylori infection- the Maastricht concensus report. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 9:1-2, Hirschl AM, et. al.: Kinetics of specific IgG antibodies for monitoring the effect of anti- Helicobacter pylori chemotherapy. J. Infect. Dis. 168: Bourke B, Jones N, and Sherman P: Helicobacter pylori infection and peptic ulcer disease in children. Ped. Infect. Dis. J. 15:1-13, Patel P, et. al.: Prospective screening of dyspeptic patients by Helicobacter pylori serology. Lancet. 346: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition 11. National Committee for Clinical Laboratory Standards: Internal quality Control: Principles and definitions; Approved Guideline, NCCLS Document C24-A, Vol 11(6), Kosunen T, et. al.: Diagnostic value of decreasing IgG, IgA and IgM antibody titers after eradication of Helicobacter pylori. Lancet 339: , Megraud F, et. Al.: Seroepidemiology of Campylobacter pylori infection in various populations. J. Clin. Microbiol. 27: , Veldhuyzen SJO, et. al.: Increasing prevalence of H. pylori infection with Age: Continuous risk of infection in adults rather than cohort effect. J. Infect. Dis. 169:4347, Veenendaal RA: Long term serological surveillance after treatment of Helicobacter pylori infection. Gut 32: , Jaskowski TD, et. al.: Immunoglobulin A antibodies to Helicobacter pylori. J. Clin. Microbiol. 35(11): , Aromaa A, et. al.: Circulating Anti-Helicobacter pylori Immunoglobulin A antibodies and low serum pepsinogen 1 level are associated with increased risk of gastric cancer. Am. J. Epidem. 144(2): , Granberg C, et. al.: Diagnosis of Helicobacter pylori Infection by Using Pyloriset EIA-G and EIA-A for Detection of Serum Immunoglobulin G (IgG) and IgA Antibodies. J. Clin. Microbiol. 31(6): , Futagami S: Systemic and local immune responses against Helicobacter pylori urease in patient with chronic gastritis: distinct IgA and IgG productive sites. Gut 43: ,

8 Fornitore: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Rappresentante Autorizzato: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service ITA November 2009 Revision 5 8