QUANTA Lite TM ASCA IgG (S. cerevisiae) Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata

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1 QUANTA Lite TM ASCA IgG (S. cerevisiae) Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata Finalità d uso QUANTA Lite TM ASCA (S. cerevisiae) IgG è un test immunoenzimatico per la ricerca semi-quantitativa di anticorpi della classe IgG anti-saccharomyces cerevisiae (ASCA) nel siero umano. La presenza di IgG anti- ASCA può essere usata, insieme al quadro clinico del paziente ed al risultato degli altri test di laboratorio eseguiti, come aiuto nella diagnosi del Morbo di Crohn. Riassunto e Spiegazione del test Il termine Malattia Infiammatoria Intestinale (IBD) viene generalmente utilizzato per descrivere alcune malattie che causano infiammazione intestinale. Il Morbo di Crohn (CD) e la colite ulcerativa (UC) rappresentano due delle principali IBD. Nel Morbo di Crohn, l infiammazione di solito colpisce la parte inferiore del piccolo intestino (ilieo distale), ma può interessare qualsiasi sezione dell apparato digerente. L infiammazione causata dal Morbo di Crohn si estende in profondità nel tessuto interessato, a differenza della colite ulcerativa, che causa infiammazione ed ulcerazioni solo negli strati più superficiali della mucosa del colon e del retto. L infiammazione causata dal Morbo di Crohn è asimmetrica e segmentale, con alcune aree di tessuto sano ed altree di tessuto malato, a differenza della colite ulcerativa in cui l infiammazione è simmetrica e senza soluzioni di continuità in direzione prossimale a partire dal retto. 1-3 Sia il Morbo di Crohn che la colite ulcerativa hanno andamento cronico, possono colpire uomini e donne in percentuali praticamente uguali e presentano la massima incidenza nell Europa settentrionale ed in Nord America. Circa il 20% dei soggetti affetti dal Morbo di Crohn ha un consanguineo affetto da forme di IBD. Di solito il Morbo di Crohn si manifesta attorno ai anni di età, con un secondo picco di incidenza, peraltro inferiore, tra i 50 ed i 70 anni. Nel corso dell ultima decade, molti lavori pubblicati in letteratura hanno segnalato un aumento della prevalenza del Morbo di Crohn in varie aree geografiche. 4-7 Sebbene ci siano molte teorie sull eziologia del Morbo di Crohn e della colite ulcerativa, nessuna di esse è stata dimostrata. Poichè la sintomatologia del Morbo di Crohn e quella della colite ulcerativa sono assai simili tra loro, la diagnosi è spesso problematica, indaginosa ed invasiva. 1-3 Una certa percentuale di casi (10-12%) risulta inizialmente non classificabile e viene indicata come colite indeterminata. Con il passare del tempo, circa metà di questi pazienti vengono diagnosticati come affetti da Morbo di Crohn o da colite ulcerativa Gli anticorpi anti-saccharomyces cerevisiae (ASCA) si sono dimostrati un marker molto più significativo per i pazienti affetti da Morbo di Crohn rispetto a quelli con colite ulcerativa o nei soggetti sani Questi anticorpi, che possono essere sia della classe IgG che IgA, sembrano essere specifici per le sequenze di mannosio che compongono il mannano della parete cellulare di Saccharomyces cerevisiae La presenza di ASCA della classe IgG o IgA si è dimostrata altamente significativa nella diagnosi del Morbo di Crohn. Un lavoro recentemente pubblicato ha segnalato che la presenza contemporanea di ASCA delle classi IgG ed IgA era indicativa al 100% della presenza di Morbo di Crohn. 8 La rilevazione degli ASCA può essere utile per la diagnosi differenziale del Morbo di Crohn rispetto alla colite ulcerativa Alcuni pazienti affetti da Morbo di Crohn sembrano non produrre anticorpi ASCA. Non è ancora chiaro se questi pazienti rappresentino o meno un sottogruppo con caratteristiche cliniche specifiche. Principio della Metodica L antigene di S. cerevisiae parzialmente purificato e sonicato è adsorbito sulla parete dei pozzetti di una piastra microtiter di polistirene in condizioni adatte a conservare l antigene nel suo stato nativo. I controlli pre-diluiti ed i sieri diluiti dei pazienti vengono distribuiti nei pozzetti corrispondenti, consentendo agli anticorpi anti-asca della classe IgG eventualmente presenti di legarsi all antigene adsorbito. L eccesso di campione non legato viene allontanato mediante il lavaggio e successivamente si aggiunge a ciascun pozzetto un anticorpo anti-igg umane marcato con un enzima. Una seconda incubazione consente agli anticorpi anti-igg umane marcati con l enzima di legarsi agli anticorpi del paziente che si sono eventualmente legati alla parete dei pozzetti. Dopo ulteriore lavaggio per allontanare l eccesso di anticorpi anti-igg umane marcati con l enzima, l attività dell enzima rimasto viene misurata aggiungendo un substrato cromogenico e misurando l intensità del colore che si sviluppa. Il test può essere letto mediante uno spettrofotometro ed interpretato confrontando l intensità del colore che si sviluppa nei pozzetti dei campioni con quella dei pozzetti dei controlli. Reagenti 1. Piastra microtiter ELISA in polistirene adsorbita con antigene di S. cerevisiae parzialmente purificato,(12-1 x 8 pozzetti), con supporto, in busta chiusa contenente materiale essicante 2. Controllo ELISA Negativo, 1 flacone di tampone contenente conservante e siero umano senza anticorpi umani anti-s. cerevisiae, prediluito, 1,2mL 3. Controllo ELISA fortemente positivo per IgG anti-s. cerevisiae, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani anti-s. cerevisiae, prediluito, 1,2mL 4. Controllo ELISA debolmente positivo per IgG anti-s. cerevisiae, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani anti-s. cerevisiae, prediluito, 1,2mL 5. Diluente per campioni HRP, 1 flacone di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween 20, stabilizzatori delle proteine e conservante, 50mL 6. Soluzione di lavaggio HRP Concentrata, 1 flacone di soluzione concentrata 40x di colore rosso contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris e Tween 20, 25mL. Vedi la Sezione Metodi per le istruzioni sulla diluizione. 7. Coniugato HRP IgG, (montone), anti-igg umane, 1 flacone di colore blu contenente tampone, 1

2 stabilizzatori delle proteine e conservante, 10mL 8. Cromogeno TMB, 1 flacone contenente stabilizzatori, 10mL 9. Soluzione di arresto HRP, Acido solforico 0,344M, 1 flacone incolore, 10mL Avvertenze 1. ATTENZIONE: Questo prodotto contiene un composto chimico (cloramfenicolo allo 0,02%) nel diluente per i campioni, nei controlli e nel coniugato, noto allo Stato della California come causa di tumori. 2. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-hiv, per HbsAg e per anticorpi anti- HCV mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controlli ELISA fortemente positivo per IgG anti-s. cerevisiae, ELISA debolmente positivo per IgG anti-s. cerevisiae ed ELISA Negativo devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. 4. Il Coniugato HRP contiene un composto chimico velenoso/corrosivo, che può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 5. Il Cromogeno TMB contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. 6. La Soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. Evitare l esposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L acido solforico è velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 7. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 8. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili. 3. Un lavaggio incompleto o non accurato e l insufficiente aspirazione del liquido dai pozzetti ELISA può causare una scarsa precisione e/o un elevato background. 4. L adattamento di questo test all uso con apparecchiature automatiche e altri dispositivi per trattamento dei campioni liquidi, in toto o in parte, può causare differenze nei risultati rispetto a quelli ottenuti mediante la procedura manuale. E responsabilità di ciascun Laboratorio confermare che le procedure automatizzate utilizzate diano risultati entro limiti di accettabilità. 5. Una serie di fattori influenza le prestazioni del test. Essi comprendono l iniziale temperatura dei reagenti, la temperatura dell ambiente, l accuratezza e la riproducibilità della tecnica di pipettamento, la scrupolosità delle operazioni di lavaggio e di aspirazione del liquido dai pozzetti delle piastre ELISA, il tipo di spettrofotometro usato per leggere i risultati e la lunghezza dei tempi di incubazione durante l esecuzione del test. Bisogna prestare molta attenzione alla costanza per ottenere risultati accurati e riproducibili. 6. Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite. 7. Una chiusura incompleta della busta richiudibile contenente le strisce di pozzetti ed il materiale essicante causa la degradazione dell antigene ed una scarsa precisione nei risultati. 8. Valori di assorbanza inaccettabilmente bassi possono essere osservati dopo aver usato due o più volte lo stesso flacone di coniugato HRP per un certo periodo di tempo. E importante seguire attentamente le istruzioni fornite per il trattamento del coniugato HRP per evitare tale inconveniente. 9. Un eventuale contaminazione chimica del coniugato HRP può essere conseguenza di una impropria pulizia o risciacquo di apparecchi o di strumenti. Residui di comuni reagenti chimici di laboratorio quali formalina, candeggina, etanolo o detergenti causano la degradazione nel tempo del coniugato HRP. Risciacquare molto accuratamente tutti gli apparecchi e gli strumenti dopo l uso di detergenti chimici. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. 2. Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile contenente il materiale essicante e conservate nella busta ben chiusa a 2-8 C. 3. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 1 settimana a 2-8 C. Raccolta dei campioni Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L aggiunta al campione di sodio azide o di altri conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l uso di sieri fortemente emolizzati o lipemici. Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A2 dell NCCLS 2

3 raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8 C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a -20 C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati. Procedura Materiali forniti 1 Piastra microtiter ELISA ASCA IgG (12-1 x 8 pozzetti), con supporto 1 1,2mL Controllo ELISA Negativo prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA debolmente positivo per IgG anti-s. cerevisiae prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA fortemente positivo per IgG anti-s. cerevisiae prediluito 1 50mL Diluente per campioni HRP 1 25mL Soluzione di lavaggio HRP concentrata, 40x concentrata 1 10mL Coniugato HRP IgG, (montone), anti-igg umane 1 10mL Cromogeno TMB 1 10mL Soluzione di arresto HRP, 0,344M Acido solforico Materiali richiesti ma non forniti Micropipette in grado di erogare volume di 5, 100, e 500µL Puntali monouso per micropipette Provette per la diluizione dei sieri, volume 4mL Acqua distillata o deionizzata Beuta da 1L per diluite la Soluzione di lavaggio HRP concentrata Lettore per piastre ELISA in grado di leggere a 450nm (e 620nm per le letture a doppia lunghezza d onda) Metodica Prima di incominciare 1. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26 o C) e mescolarli bene. 2. Diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone fornito con il kit a 975mL di acqua distillata o deionizzata. Se non si usa l intera piastra in una sola volta, si può preparare una minore quantità di soluzione di lavaggio aggiungendo 2,0mL di concentrato a 78mL di acqua distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 1 settimana a 2-8 o C. 3. Preparare una diluizione 1:101 di ciascun campione da testare aggiungendo 5µL di siero a 500µL di Diluente per campioni HRP. I campioni diluiti devono essere testati entro 8 ore dalla preparazione. NON DILUIRE i Controlli ELISA debolmente positivo per IgG anti-s. cerevisiae, ELISA fortemente positivo per IgG anti-s. cerevisiae ed ELISA Negativo. 4. La determinazione della presenza o dell assenza di IgG anti-s. cerevisiae usando unità arbitrarie richiede due pozzetti per ciascuno dei tre controlli ed uno o due pozzetti per ciascun campione clinico. Si raccomanda di testare i campioni in duplicato. Esecuzione del test 1. TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26 C) PRIMA DI INIZIARE IL TEST. Posizionare i pozzetti/le strisce necessarie nel supporto. Rimettere immediatamente la strisce inutilizzate nella busta contenente il materiale essicante e sigillarla bene per minimizzare l esposizione all umidità ambientale. 2. Distribuire 100µL dei Controlli ELISA debolmente positivo per IgG anti-s. cerevisiae, ELISA fortemente positivo per IgG anti-s. cerevisiae ed ELISA Negativo prediluiti e dei sieri diluiti nei rispettivi pozzetti. Coprire i pozzetti ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione inizia dopo l aggiunta dell ultimo campione. 3. Lavaggio: Aspirare completamente il contenuto di ciascun pozzetto. Distribuire µL di soluzione di lavaggio HRP diluita in tutti i pozzetti e quindi aspirarla. Ripetere questa operazione per altre due volte, per un totale di tre lavaggi. Dopo l ultimo lavaggio capovolgere la piastra e scuoterla fermamente su tovaglioli di carta assorbente per rimuovere eventuali residui di liquido. E importante vuotare completamente ciascun pozzetto dopo ciascun lavaggio. Per l aspirazione mantenere la stessa sequenza usata per l aggiunta dei campioni. 4. Distribuire 100μL di Coniugato HRP IgG in ciascun pozzetto. Il coniugato dovrebbe essere prelevato dal flacone mediante tecniche sterili. Prelevare dal flacone solo la quantità di coniugato necessaria per l esecuzione del test. PER EVITARE POSSIBILI CONTAMINAZIONI MICROBICHE E/O CHIMICHE, NON RIMETTERE MAI IL CONIUGATO INUTILIZZATO NEL FLACONE. Incubare i pozzetti per 30 minuti come descritto al punto Lavaggio: Ripetere la procedura descritta al punto Distribuire 100µL di Cromogeno TMB in ciascun pozzetto ed incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. 7. Distribuire 100µL di Soluzione di arresto HRP in ogni pozzetto. Per l aggiunta della Soluzione di arresto HRP mantenere la stessa sequenza e gli stessi tempi utilizzati per l aggiunta del Cromogeno TMB. Agitare gentilmente la piastra con le dita per mescolare completamente i reagenti nei pozzetti. 8. Leggere l assorbanza (OD) di ciascun pozzetto a 450nm entro 1 ora dall aggiunta della soluzione di arresto. Se si preferisce una lettura a doppia lunghezza d onda, si può usare la lunghezza d onda di 620nm come riferimento. 3

4 Controllo di qualità 1. I Controlli ELISA debolmente positivo per IgG anti-s. cerevisiae, ELISA fortemente positivo per IgG anti-s. cerevisiae ed ELISA Negativo devono essere inclusi ogni volta che si esegue il test per assicurare che tutti i reagenti ed il test funzionino in modo corretto. 2. Si deve notare che, poichè i Controlli ELISA debolmente positivo per IgG anti-s. cerevisiae, ELISA fortemente positivo per IgG anti-s. cerevisiae ed ELISA Negativo sono prediluiti, essi non rappresentano un controllo procedurale per le tecniche di diluizione utilizzate per i campioni. 3. Ulteriori controlli possono essere inclusi in base alle indicazioni o alle richieste delle vigenti regolamentazioni o delle organizzazioni di accreditamento. Ulteriori sieri di controllo possono essere preparati raccogliendo un pool dei sieri umani, aliquotandolo e conservandolo a < -20 C. 4. Perchè i risultati del test siano considerati validi, tutti i seguenti criteri devono essere soddisfatti. Se anche uno solo non rientra nei valori specificati, i risultati non dovrebbero essere considerati validi ed il test dovrebbe essere ripetuto. a. L assorbanza del Controllo ELISA fortemente positivo per IgG anti-s. cerevisiae prediluito deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA debolmente positivo per IgG anti-s. cerevisiae prediluito che a sua volta deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA Negativo prediluito. b. Il Controllo ELISA fortemente positivo per IgG anti-s. cerevisiae prediluito deve avere un assorbanza maggiore di 1,0 mentre l assorbanza del Controllo ELISA Negativo prediluito non deve essere maggiore di 0,2. c. L assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo per IgG anti-s. cerevisiae deve essere maggiore di due volte rispetto a quella del Controllo ELISA Negativo oppure >0,25. d. Il Controllo ELISA Negativo e quello ELISA fortemente positivo per IgG anti-s. cerevisiae servono per controllare un eventuale malfunzionamento dei reagenti. Il Controllo ELISA fortemente positivo per IgG anti-s. cerevisiae non assicura la precisione in corrispondenza del valore soglia del test. e. L utente del test dovrebbe fare riferimento al Documento C24-A dell NCCLS per ulteriori informazioni su appropriate tecniche di Controllo di Qualità. 18 Calcolo dei risultati Si deve determinare innanzitutto il valore medio di assorbanza per ciascun set di duplicati. La reattività di ciascun campione viene quindi calcolata dividendo il valore medio di assorbanza del campione per il valore medio di assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo per IgG anti-s. cerevisiae e moltiplicando il risultato per il numero di unità assegnate al Controllo ELISA debolmente positivo per IgG anti-s. cerevisiae, che è stampato sull etichetta del flacone. Assorbanza campione Valore del campione = x Valore Controllo ELISA debolmente positivo per IgG anti-s. cerevisiae (unità) (unità) Assorbanza Controllo ELISA debolmente positivo per IgG anti-s. cerevisiae La reattività è collegata in modo non lineare alla quantità di anticorpi presente. Mentre gli aumenti e le diminuzioni delle concentrazioni degli anticorpi vengono evidenziate da un corrispondente aumento o diminuzione della reattività, il cambiamento non è proporzionale (ad es., un raddoppio della concentrazione di anticorpi non raddoppia necessariamente la reattività). Se si desidera una più accurata quantificazione del contenuto di anticorpi, si possono allestire e testare diluizioni seriate del campione. L ultima diluizione che risulta positiva nel test dovrebbe essere refertata come il titolo anticorpale del paziente. Interpretazione dei risultati Il metodo ELISA è molto sensibile alla procedura ed è in grado di individuare anche piccole differenze nella popolazione dei pazienti. I valori riportati qui di seguito sono solo valori suggeriti. Ciascun Laboratorio dovrebbe stabilire il proprio range di normalità basato sulla procedura da esso utilizzata, sui controlli, sull apparecchiatura e sulla popolazione di pazienti secondo le proprie metodiche standard. Il campione può essere quindi classificato come negativo, (assenza di IgG anti-s. cerevisiae), dubbio o positivo (presenza di IgG anti-s. cerevisiae). Unità Negativo 0,0-20 Dubbio 20,1 24,9 Positivo >25 I campioni che danno risultati dubbi dovrebbero essere ritestati prima di refertare i risultati. 1. Un risultato positivo indica la presenza di IgG anti-s. cerevisiae e suggerisce la possibile presenza del Morbo di Crohn. 2. Un campione con livelli dubbi di IgG anti-s. cerevisiae non dà nessuna indicazione sulla situazione immunologica del paziente. Se il campione rimane dubbio anche dopo la ripetizione del test, il risultato dovrebbe essere refertato come dubbio e/o si dovrebbe richiedere un campione successivo per un ulteriore controllo. 3. Un risultato negativo indica l assenza di IgG anti-s. cerevisiae oppure la loro presenza a livelli inferiori al limite di sensibilità del metodo. 4. Sul referto si dovrebbe riportare la seguente frase: I seguenti risultati sono stati ottenuti mediante il test QUANTA Lite TM ASCA IgG ELISA della INOVA. I valori di IgG anti-s. cerevisiae ottenuti con test prodotti da altre Ditte possono non essere utilizzabili in modo intercambiabile. Il livello di IgG determinato con questo metodo non può essere correlato ad un titolo endpoint. 4

5 Limitazioni del test 1. La presenza nel campione di complessi immuni o di altri aggregati di immunoglobuline può causare un aumento del livello di reazioni a specifiche con conseguenti risultati falsi positivi con questo test. 2. Un risultato negativo per IgG anti-s. cerevisiae non esclude la presenza del Morbo di Crohn. 3. Un risultato negativo per IgG anti-s. cerevisiae non esclude la loro presenza, perchè la concentrazione di anticorpi potrebbe essere inferiore al livello di sensibilità del metodo. 4. Un risultato positivo indica solo la presenza di IgG anti-s. cerevisiae e non indica necessariamente la presenza di Morbo di Crohn. 5. I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e del risultato degli altri test sierologici. 6. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state determinate nei pazienti pediatrici affetti da Morbo di Crohn o da colite ulcerativa. 7. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero. Valori attesi La prevalenza del Morbo di Crohn presenta un range variabile da 10 a 198 casi/ e sembra essere in aumento 4-7. Il Morbo di Crohn è assai più frequente nelle popolazioni dell Europa settentrionale e del Nord America. Esso colpisce uomini e donne in percentuali praticamente uguali. Range normale Un pannello composto da 501 campioni prelevati da soggetti sani asintomatici in California, New York, Austria, Lussemburgo ed in Belgio è stato testato mediante il kit QUANTA Lite TM ASCA IgG ELISA. L età di questa popolazione variava da 1 a 75 anni. Per i 5 gruppi regionali, la specificità apparente variava da 92 a 100% (media 95,2%). Nessuno (0/501) dei campioni è risultato positivo per la presenza contemporanea di anticorpi ASCA IgG ed ASCA IgA La specificità del test ASCA IgG, comprendendo tutti i campioni di pazienti affetti da malattie diverse dal Morbo di Crohn (i sieri dei controlli sani più dei quelli dei pazienti affetti dalle malattie elencate) è risultata pari al 93,2% (663/711). Sensibilità e specificità relative Il kit QUANTA Lite TM ASCA IgG è stato utilizzato per testare sieri appartenenti a pazienti affetti da Morbo di Crohn e da colite ulcerativa nonchè a soggetti sani. Dei 102 pazienti positivi per la presenza contemporanea di anticorpi ASCA IgG ed IgA, tutti tranne 2 erano noti come pazienti affetti da Morbo di Crohn. Nessuno dei controlli sani e solo 2 dei campioni di pazienti affetti da colite ulcerativa erano positivi per la presenza contemporanea di anticorpi IgG ed IgA anti-s. cerevisiae. I range di età per i gruppi di pazienti affetti dal Morbo di Crohn e da colite ulcerativa variavano rispettivamente da 17 a 64 e da 19 a 71 anni. RISULTATI DEL TEST QUANTA Lite TM ASCA ELISA Gruppo Clinico N= IgG Pos IgA Pos IgG o IgA Pos IgG ed IgA Pos Morbo di Crohn ,4% (157/211) 49,0 (103/210) 76,2% (160/210) 47,6% (100/210) Colite ulcerativa ,2% (22/156) 1,9% (3/158) 14,6% (23/156) 1,3% (2/156) Controlli sani 148 4,1% (6/145) 1,4% (2/147) 5,6% (8/144) 0% (0/144) Nota: i risultati dubbi sono stati escusi dai calcoli. Studio delle reazioni crociate Per determinare eventuali reazioni crociate sono stati testati i sieri di 75 pazienti affetti da malattie autoimmuni o infettive nonchè da altre patologie utilizzando il kit QUANTA Lite TM ASCA (S. cerevisiae) IgG ELISA. I risultati sono riassunti nella seguente tabella. Tipo di campione N= ASCA IgG Positivo (%) Pos. per IgA anti-gliadina 12 0 Pos. per IgG anti-gliadina 8 2 (25%) IgA anti-transglutaminasi 7 0 Pos. per anticorpi antinucleo (ANA) 8 0 Epatite autoimmune (AIH), di tipo (6,6%) Positivi per H. pylori 10 0 Ascite da cirrosi alcoolica 1 0 Epatite alcoolica 2 2 (100%) Epatite C cronica 6 1 (16,7%) Epatopatia cronica 2 0 Epatite granulomatosa.s/pbcg immuno rx cancro vescica 1 1 (100%) Epatite NOS 1 0 Gastroenterite non infettiva 1 0 Varici esofagee emorragiche 1 0 Precisione e riproducibilità Le prestazioni intra-test del kit QUANTA Lite TM ASCA (S. cerevisiae) IgG ELISA sono state valutate testando 6 campioni per un totale di 15 volte ciascuno. I risultati, riassunti nella Tabella 3, mostrano la precisione intra-test. 5

6 Camp.A Camp.B Camp.C Camp.D Camp.E Camp.F Unità medie 75,6 13,1 116,6 29,9 10,4 44,8 DS 2,8 0,7 3,0 1,2 0,5 1,7 CV% 3,7 5,2 2,6 4,1 4,5 3,8 La variazione inter-test è stata calcolata testando, in duplicato, un pannello di 8 campioni due volte al giorno per 3 giorni. Camp.1 Camp.2 Camp.3 Camp.4 Camp.5 Camp.6 Camp.7 Camp.8 Unità medie 47,7 11,7 123,5 38,8 49,3 117,7 14,9 6,6 DS 1,4 0,4 6,7 1,4 1,2 5,8 0,4 0,3 CV% 3,0 3,5 5,4 3,6 2,4 4,9 2,6 5,0 Bibliografia 1. Merck Manual of Diagnosis and Therapy Whitehouse Station, NJ. ( 2. Coche J-C and J-F Colombel. Heterogeneity of Inflammatory Bowel Disease: Clinical Subgroups of Patients. Res. Clin. Forums 20(1): , National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK). Crohn s Disease. NIH Publication No , ( 5. Bernstein CN, Blanchard JF, Rawsthorne P and A Wajda. Epidemiology of Crohn s disease in a central Canadian province: a population-based study. Am. J. Epidemiol. 149(10): , Loftus EV Jr, Silverstein MD, Sandborn WJ, Tremaine WJ, Harmsen WS and AR Zinsmeister. Crohn s disease in Olmsted County, Minnesota, : incidence, prevalence, and survival. Gastroenterol. 114(6): , Niv Y, Abuksis G and GM Fraser. Epidemiology of Crohn s disease in Israel: a survey of Israeli kibbutz settlements. Am J. Gastroenterol. 94 (10): , Shivananda S, Lennard-Jones J, Logan R, Fear N, Price A, Carpenter L and M van Blankenstein. Incidence of inflammatory bowel disease across Europe: is there a difference between north and south? Results of the European Collaborative Study on Inflammatory Bowel Disease (EC-IBD). Gut 39: , Ruemmele FM, Targan SR, Levy G, Dubinsky M, Braun J and ER Seidman. Diagnostic accuracy of serological assays in pediatric inflammatory bowel disease. Gastroenterol. 115: , Rutgeerts P and S Vermeire. Clinical value of the detection of antibodies in the serum for diagnosis and treatment of inflammatory bowel disease. Gastroenterol. 115: , Panaccione R and WJ Sanborn. Is antibody testing for inflammatory bowel disease clinically useful? Gastroenterol. 116: , Main J, McKenzie H, Yeaman GR, Kjerr MA, Robson D and Pennington CR, et al. Antibody to Saccharomyces cerevisiae (baker s yeast) in Crohn s disease. Brit. J. Med. 297: , McKenzie H, Main J, Pennington CR and D Parrat. Antibody to selected strains of Saccharomyces cerevisiae (baker s and brewer s yeast) and Candida ablicans in Crohn s Disease. Gut 31: , Lindberg E, Magnusson K-E, Tysk C and G Jarnerot. Antibody (IgG, IgA, and IgM) to baker s yeast (Saccharomyces cerevisiae), yeast mannan, gliadin, ovalbumin and betalactoglobulin in monozygotic twins with inflammatory bowel disease. Gut 33: , Sendid B, Colombel JF, Jacquinot PM, Faille C, Fruit J, Cortot A, Lucidarme D, Camus D and D Poulain. Specific antibody response to oligomannosidic epitopes in Crohn s Disease. Clin. Diag. Lab. Immunol. 3(2): , Quinton J-F, Sendid B, Reumaux D, Duthilleul P, Cortot A, Grandbastien B, Charrier G, Targan SR, Colombel J-F and D Poulain. Anti-Saccharomyces cerevisiae mannan antibodies combined with antineutrophil cytoplasmic autoantibodies in inflammatory bowel disease: prevalence and diagnostic role. Gut 42: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 1999, Fourth Edition, (HHS Pub. # (CDC) ). 18. National Committee for Clinical Laboratory Standards Internal quality control: Principles and definitions; Approved Guideline, NCCLS Document C24-A, Vol 11(6). Fornitore: INOVA Diagnostics, Inc. Technical Service Old Grove Road May 2005 San Diego, CA Revision ITA7 United States of America Rappresentante Autorizzato: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: