QUANTA Flash DGP IgA Reagents Per uso diagnostico In Vitro

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1 QUANTA Flash DGP IgA Reagents Per uso diagnostico In Vitro Uso previsto Il QUANTA Flash DGP IgA è un test immunologico della chemiluminescenza (CIA) per la determinazione semiquantitativa di anticorpi IgA anti-peptidi di gliadina deamidati (DGP) nel siero umano. La presenza di anticorpi IgA anti-dgp, se valutata in associazione ad altri risultati clinici e di laboratorio, costituisce un ausilio nella diagnosi delle enteropatie sensibili al glutine: malattia celiaca e dermatite erpetiforme. Introduzione e descrizione del test La malattia celiaca è un'enteropatia sensibile al glutine i cui tratti principali includono infiammazione e caratteristico appiattimento istologico della mucosa intestinale con conseguente sindrome da malassorbimento. L eziologia esatta della malattia resta sconosciuta ma la gliadina, ovvero la frazione solubile in alcol del glutine di grano, è chiaramente l agente tossico. 1,2 Originariamente, per diagnosticare la celiachia e le patologie correlate venivano eseguite una serie di biopsie intestinali multiple. Recentemente, la European Society of Pediatric Gastroenterology and Nutrition (ESPGAN) 3 e numerose altre pubblicazioni 4-6 hanno raccomandato l uso di marcatori sierologici, come gli anticorpi anti-transglutaminasi tissutale (ttg), anti-endomisiali (EMA), antigliadina e anti-dgp per ridurre il numero di biopsie intestinali necessarie per formulare una diagnosi. Recenti studi hanno rilevato che gli anticorpi di pazienti celiaci si legano a un numero molto limitato di epitopi specifici sulla molecola di gliadina selettivamente deamidata. 7-9 Si ritiene che la deamidazione sia causata dall'enzima celiaco associato, la transglutaminasi tissutale. 10 Sulla base di queste osservazioni, sono stati sviluppati test in cui vengono utilizzati peptidi della gliadina deamidati e definiti. Essi presentano un accuratezza diagnostica superiore per la celiachia rispetto ai test antigliadina standard. 5,11-14 Una strategia di screening sensibile per l'individuazione di soggetti affetti dalla malattia celiaca in popolazioni a rischio include test per gli anticorpi IgG e IgA diretti verso peptidi della gliadina deamidati, in quanto una proporzione significativa di pazienti affetti da celiachia presenta un deficit di IgA. 12 Numerosi studi hanno dimostrato l'elevata utilità clinica di questa strategia di analisi. 15,11-14 La dermatite erpetiforme è una malattia della pelle cronica con formazione di vescicole. La maggior parte dei pazienti con dermatite erpetiforme presenta sensibilità al glutine e atrofia dei villi del digiuno identica a quella riscontrata nella celiachia e una dieta rigida priva di glutine determina un miglioramento delle lesioni sia intestinali sia cutanee. 16,17 Gli attuali metodi sierologici come i test EMA e anti-ttg evidenziano prestazioni deludenti quando usati per la dermatite erpetiforme, con sensibilità che variano dal 45 al 75%16-18 rispetto alle sensibilità pari al 95% e superiori riferite per la celiachia. Uno studio tuttavia ha rivelato che gli anticorpi anti-dgp sono più comuni rispetto agli anticorpi anti-ttg in pazienti con dermatite erpetiforme. 18 Principi della procedura Il peptide di gliadina sintetico deamidato è rivestito su sfere paramagnetiche, conservate nella cartuccia di reagente in condizioni tali da conservare l antigene nel suo stato reattivo. Quando la cartuccia per il test è pronta per essere utilizzata per la prima volta, questa viene interamente capovolta numerose volte per miscelare i reagenti in modo accurato. La cartuccia di reagente viene quindi caricata sullo strumento BIO-FLASH. Un campione di siero del paziente viene diluito 1:17 dallo strumento utilizzando il risciacquo del sistema aggiunto a una cuvetta in plastica monouso. Piccole quantità di siero del paziente diluito, le sfere di DGP e il tampone del test vengono tutti combinati in una seconda cuvetta e miscelati. Questa cuvetta viene incubata a 37 C. Le sfere vengono quindi magnetizzate e lavate più volte. Il coniugato anticorpo-isoluminolo viene aggiunto alla cuvetta e incubato a 37 C. Ancora una volta le sfere vengono magnetizzate e lavate ripetutamente. Il coniugato con isoluminolo produce una 1

2 reazione luminescente quando alla cuvetta vengono aggiunti reagenti ( trigger ). La luce prodotta da questa reazione viene misurata in RLU (unità di luce relativa) dal sistema ottico BIO-FLASH. Le RLU sono proporzionali alla quantità di coniugato di isoluminolo legato che a sua volta è proporzionale alla quantità di anticorpi anti-dgp legati all antigene DGP sulle sfere. Il test QUANTA Flash DGP IgA utilizza una curva master predefinita specifica per il lotto che viene caricata sullo strumento utilizzando il codice a barre della cartuccia di reagente. In base ai risultati ottenuti con due calibratori, viene creata una Curva di lavoro specifica dello strumento, che viene usata dal software per calcolare le unità di chemiluminescenza a partire dal valore RLU ottenuto per ciascun campione. Reagenti 1. La cartuccia di reagente QUANTA Flash DGP IgA contiene i seguenti reagenti per 50 test: a. Sfere paramagnetiche rivestite con DGP in tampone, contenenti stabilizzanti proteici e conservanti. b. Tampone per il dosaggio di colore rosa, contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween 20, stabilizzanti proteici e conservanti. c. Tracciante IgA Anticorpi anti-iga umani marcato con isoluminolo in tampone, contenenti stabilizzanti proteici e conservanti. Avvertenze 1. Questo tampone per test contiene una sostanza chimica (cloramfenicolo 0,02%) ritenuta cancerogena dallo Stato della California. 2. Come conservante viene usato l azoturo di sodio. L azoturo di sodio è un veleno e può essere tossico se ingerito o assorbito attraverso la pelle o gli occhi. L azoturo di sodio può reagire con le tubature in piombo o rame e formare azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lavare i lavandini, se usati per lo smaltimento dei reagenti, con grandi volumi di acqua per evitare l accumulo di azide. 3. Utilizzare attrezzatura di protezione idonea quando si manipolano i reagenti forniti. 4. I reagenti rovesciati devono essere puliti immediatamente. Durante lo smaltimento delle scorie, rispettare tutti i regolamenti ambientali federali, statali e locali. Precauzioni 1. Questo prodotto è destinato a un uso diagnostico In Vitro. 2. Il test è concepito per essere utilizzato esclusivamente con lo strumento BIO-FLASH. 3. Una volta aperta, la cartuccia di reagente deve essere conservata nel dispositivo di caricamento girevole per i reagenti dello strumento. Occorre prestare attenzione ed evitare la fuoriuscita di reagenti quando la cartuccia viene posta per la prima volta nello strumento. 4. La contaminazione chimica dei reagenti può derivare da una pulizia o un risciacquo inadeguati dello strumento. I residui di comuni sostanze di laboratorio come la formalina, la candeggina, l etanolo o di detergente possono causare interferenze nel test. Assicurarsi di seguire la procedura di pulizia dello strumento raccomandata come specificato nel manuale operatore di BIO-FLASH. Condizioni di conservazione 1. Conservare le cartucce di reagente sigillate a una temperatura compresa tra 2 e 8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e maneggiati in accordo alle istruzioni. 2. Le cartucce di reagenti sigillate devono essere conservate nello strumento. Il software BIO- 2

3 FLASH controlla la scadenza delle cartucce montate (in uso) nonché la scadenza del lotto di reagente (durata) della cartuccia di reagente. Il sistema non consente di utilizzare una cartuccia scaduta. Raccolta, preparazione e trattamento dei campioni Questa procedura deve essere eseguita con un campione di siero. I campioni microbicamente contaminati, sottoposti a trattamento termico o i campioni contenenti particolato visibile non devono essere usati. Evitare sieri itterici o fortemente emolizzati. Dopo il prelievo, separare il siero dal coagulo. Il CLSI Document H18-A4 raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1. Conservare i campioni a temperatura ambiente per un massimo di 8 ore. 2. Se il dosaggio non verrà completato entro 8 ore, refrigerare il campione a 2-8 C. 3. Se il dosaggio non verrà completato entro 48 ore, oppure per la spedizione del campione, congelare a -20 C o a una temperatura inferiore. I campioni congelati devono essere miscelati dopo il decongelamento e prima di eseguire il test. Procedura Materiale fornito 1 Cartuccia del reagente QUANTA Flash DGP IgA Materiale aggiuntivo richiesto ma non fornito Strumento BIO-FLASH con computer operativo Soluzione di risciacquo del sistema BIO-FLASH (Codice: ) Trigger BIO-FLASH (Codice: ) Cuvette BIO-FLASH (Codice: ) Calibratori QUANTA Flash DGP IgA (Codice: ) Controlli QUANTA Flash DGP IgA (Codice: ) 3

4 Uso dell analizzatore chemiluminescente BIO-FLASH 1. Per istruzioni dettagliate sull'analizzatore chemiluminescente BIO-FLASH e il software BIO- FLASH, vedere il manuale dell'operatore fornito insieme al sistema BIO-FLASH. Per maggiori informazioni e per la risoluzione dei problemi riguardanti il test, contattare il servizio tecnico di INOVA Diagnostics, Inc. all indirizzo o al numero di telefono riportati alla fine del presente inserto. 2. Per svuotare il contenitore delle scorie solide, aprirlo. Rimuovere il contenitore di scorie solide e smaltire correttamente le cuvette usate. Sostituire il contenitore delle scorie solide, chiuderlo e fare clic su Yes nella finestra Empty Waste Drawer. 3. Per sostituire i trigger, fare clic sul pulsante Bulks Inventory F9 (in alto a destra). a. Nella schermata Inventory Bulks, fare clic sul pulsante Triggers a sinistra. Viene visualizzata una nuova finestra intitolata Add Triggers Remove old bottles. b. Aprire e rimuovere il cassetto delle scorie sullo strumento BIO-FLASH. Eliminare tutte le cuvette presenti nel cassette delle scorie. Fare clic su Yes nella finestra Empty Waste Drawer. Rimuovere i flaconi di trigger dai relativi supporti e fare clic sul pulsante Next. Svitare i flaconi di trigger vecchi dai relativi tappi e sostituirli con trigger nuovi. Procedere sostituendo un flacone per volta e abbinandoli ai colori dei tappi (bianco con bianco e rosso con rosso). c. Seguire le istruzioni presentate nella nuova finestra Add Triggers Add Trigger 2 bottle. Una volta che il codice a barre è stato accettato, inserire il Trigger 2 nel supporto bianco. Fare clic su Next. d. Seguire le istruzioni presentate nella finestra Add Triggers Add Trigger 1 bottle. Una volta che il codice a barre è stato accettato, inserire il Trigger 1 nel supporto rosso. Fare clic su Finish. Sostituire e chiudere il cassetto delle scorie. 4. Per sostituire il contenitore con la soluzione di risciacquo del sistema, fare clic sul pulsante Bulks Inventory F9 (angolo superiore destro). Nella schermata Inventory Bulks, fare clic sul pulsante Sys. Rinse. Nella nuova finestra Add System Rinse Remove bottles, fare clic su Next. Seguire le istruzioni presentate nella nuova finestra Add System Rinse Add bottle. Una volta che il codice a barre è stato accettato, se necessario, fare clic su Finish. 5. Per svuotare il contenitore delle scorie liquide, dalla schermata Inventory Bulks, fare clic sul pulsante Fluid Waste. Rimuovere e smaltire le scorie liquide. Fare clic su Next. Dopo aver riposizionato il flacone vuoto, fare clic su Finish. 4

5 Metodo Preparazione della cartuccia del reagente Quando la cartuccia di reagente è usata per la prima volta, è necessario seguire attentamente la procedura riportata di seguito, per un'installazione accurata della stessa sullo strumento BIO- FLASH. Nota: non utilizzare la cartuccia di reagente se si notano segni di danni. Cartuccia del reagente QUANTA Flash DGP IgA: Durante la spedizione e la conservazione, le microparticelle si depositano e richiedono una miscelazione per risospendersi. 1. Al primo utilizzo della cartuccia, capovolgerla delicatamente 30 volte, evitando la formazione di schiuma. Verificare che la risospensione delle microparticelle sia completa. Se la risospensione delle microparticelle non è completa, continuare a capovolgere la cartuccia finché necessario. In caso di mancata risospensione delle microparticelle, NON UTILIZZARE LA CARTUCCIA. 2. Una volta avvenuta la risospensione delle particelle, posizionare la cartuccia del reagente su una superficie solida per rimuovere la linguetta a strappo rossa. Tenere ferma la cartuccia del reagente con una mano. Con l'altra mano afferrare saldamente la linguetta a strappo rossa sul retro della cartuccia ed estrarla completamente. 3. Premendo le due linguette sui lati del tappo da forare (parte grigia), esercitare pressione sulla porzione superiore della cartuccia del reagente fino allo scatto in posizione bloccata. Le linguette non devono più essere visibili. NON CAPOVOLGERE LA CARTUCCIA APERTA. 4. Posizionare accuratamente la cartuccia del reagente in qualsiasi slot disponibile sul dispositivo di caricamento girevole dei reagenti dello strumento BIO-FLASH. Calibrazione del test 1. Ogni nuovo lotto di cartucce di reagente deve essere calibrato prima del primo impiego. Il software non consente l uso di un nuovo lotto se non viene eseguita la calibrazione. 2. Per istruzioni dettagliate su come calibrare la cartuccia del reagente, vedere la sezione intitolata QUANTA Flash DGP IgA Calibrators del presente inserto. 3. Una volta che la cartuccia del reagente sarà stata calibrata, il lotto di cartucce su cui è stata eseguita la calibrazione è pronto per l uso. Programmazione ed esecuzione dei campioni 1. Premere il pulsante Worklist sulla parte superiore dello schermo e selezionare la scheda Racks sulla parte inferiore. 2. Selezionare il rack del campione da utilizzare evidenziandolo sullo schermo oppure eseguendo la scansione del codice a barre con l apposito lettore portatile. Eseguire la scansione oppure digitare il nome del campione, selezionare il tipo di campione, il tipo di 5

6 contenitore (provetta/coppa) e selezionare DGP IgA dal pannello di test. Ripetere la procedura per tutti i campioni. 3. Caricare i campioni nelle posizioni selezionate nel rack dei campioni e caricare il rack nel dispositivo di caricamento girevole dello strumento. 4. Se tutti i materiali necessari sono caricati sullo strumento, l icona Start F4 è disponibile e accesa in verde sullo schermo. Premere l'icona Start F4 per avviare l'analisi. Controllo della qualità Il kit QUANTA Flash DGP IgA Controls (venduto separatamente Numero articolo INOVA ) contiene controlli DGP IgA positivi e negativi. Per istruzioni dettagliate su come inserire tutte le informazioni richieste per ogni controllo nel software nonché su come eseguire i controlli, vedere la sezione intitolata QUANTA Flash DGP IgA Controls del presente inserto. Si raccomanda di eseguire i controlli almeno una volta ogni giorno d uso del test; tuttavia, gli utenti devono tenere in considerazione anche la normativa nazionale/locale. Calcolo dei risultati Presso INOVA, viene prodotta una Curva master a cinque punti per ogni nuovo lotto di QUANTA Flash DGP IgA. I parametri della curva sono codificati nel codice a barre di ogni cartuccia di reagente. Durante la calibrazione, per la conversione del valore RLU in CU viene usata una curva di lavoro specifica dello strumento. La reattività degli anticorpi anti-iga a DGP è classificata in base alla tabella seguente. Reattività CU Negativa <20 Debolmente positivo Positiva >30 La reattività in CU è direttamente collegata al titolo di anticorpi nel campione del paziente. Gli aumenti e le diminuzioni delle concentrazioni di anticorpi del paziente saranno rispecchiate in una corrispondente ascesa o diminuzione delle CU, proporzionale alla quantità di anticorpi. L'intervallo di misurazione analitica (AMR) del dosaggio (determinato dai punti di minimo e massimo della Curva master) è compreso tra 5,2 CU e 2367,3 CU, che corrisponde all'intervallo lineare del dosaggio. Se il risultato di un paziente è inferiore a 5,2 CU, il sistema BIO-FLASH lo indicherà come <5,2 CU. Dato che è inferiore a 20 CU, verrà considerato come un risultato negativo. Se il risultato di un paziente è superiore a 2367,3 CU, il sistema BIO-FLASH lo indicherà come >2367,3 CU. Il risultato verrà considerato positivo. Il software BIO-FLASH dispone di un opzione di ripetizione automatica. Se viene selezionata questa opzione, lo strumento analizzerà automaticamente di nuovo qualsiasi campione abbia un risultato >2367,3 CU dopo un'ulteriore diluizione di 10 volte, riportando così il valore misurato all'interno dell'intervallo AMR. Il risultato finale verrà calcolato dal software tenendo conto del fattore di diluizione ulteriore. Dato che il valore massimo misurabile è 2367,3 CU, il valore massimo riferibile è CU. Interpretazione dei risultati Ogni laboratorio deve verificare l'intervallo di riferimento fornito dal produttore e può stabilire il proprio intervallo di normalità in base ai propri controlli e alle popolazioni di pazienti secondo le procedure consolidate. Si suggerisce che i risultati riportati dal laboratorio includano la dichiarazione: I seguenti risultati sono stati ottenuti con il test immunologico di chemiluminescenza INOVA QUANTA Flash DGP IgA. I valori ottenuti con metodi di dosaggio di produttori diversi non possono essere utilizzati in modo intercambiabile. 6

7 Limiti della procedura 1. Non tutti i pazienti con CD o DH sono positivi agli anticorpi IgA DGP. Inoltre, un risultato DGP IgA negativo in un paziente non trattato può spesso essere spiegato da un deficit di IgA selettivo, vale a dire un reperto relativamente frequente nella malattia celiaca. Per questa malattia INOVA offre i kit QUANTA Flash h-ttg IgG e QUANTA Flash DGP IgG. 2. I risultati del test devono essere usati in combinazione ai reperti clinici e ad altri test sierologici. 3. La non correttamiscelazione dei reagenti prima del primo utilizzo potrebbe dare luogo a risultati errati. 4. Non sono stabilite prestazioni per matrici diverse dal siero. Valori attesi Il risultato atteso nella popolazione normale è negativo. La prevalenza della CD nella popolazione di riferimento non a rischio è vicina all'1% 19, pertanto è possibile prevedere risultati occasionali positivi quando si testano soggetti sani. Quando sono stati testati campioni di siero tratti da 232 individui apparentemente santi con il test di chemiluminescenza QUANTA Flash DGP IgA presso INOVA Diagnostics, sono stati ottenuti un risultato positivo e un risultato lievemente positivo. Confronto metodologico con un predicate device I campioni per l analisi di confronto metodologico comprendevano i campioni tratti dagli studi di validazione clinica (pazienti con CD, senza CD e con dermatite erpetiforme) che rientravano nell'intervallo di misurazione analitico del test. Questi campioni sono stati testati con QUANTA Flash DGP IgA e predicato ELISA. Confronto metodologico (N=102) QUANTA Flash DGP IgA CIA DGP IgA ELISA Percentuale di accordo (Confidenza 95%) Positivo Negativo Totale Positivo 65 3* 68 Accordo pos. = 91,5% (82,5-96,8%) Negativo 6** Accordo negativo = 90,3% (74,2-98,0%) Totale Accordo totale = 91,2% (83,9-95,9%) * Due pazienti sono CD sospetta senza diagnosi, mentre il terzo è un paziente DH. ** Due pazienti hanno DH. Tre pazienti hanno CD, due senza presentazione clinica, uno con biopsia Marsh III. Un paziente presenta colite ulcerosa. Sensibilità e specificità clinica Lo studio di convalida clinica includeva 54 campioni con CD tratti dalla libreria di sieri INOVA, 103 controlli senza malattia celiaca e 21 campioni di pazienti con DH. Uno studio esterno separato includeva 93 campioni di CD, 151 campioni tratti da individui sintomatici che si erano rivolti a un medico e in cui la CD era stata esclusa in base all'esame fisico e a test diagnostici e 98 controlli. Tutti i campioni sono stati sottoposti a test con QUANTA Flash DGP IgA. I risultati sono stati analizzati al fine di calcolare la sensibilità e la specificità della CD (n=147) e della DH (n=21) separatamente. 7

8 Sensibilità e specificità clinica del test QUANTA Flash DGP IgA nella CD: N=499 QUANTA Flash DGP IgA CD Diagnosi Esenti da CD Totale Analisi (Confidenza 95%) Positivo Sensibilità = 71,4% (63,4-78,6%) Negativo 42* Specificità = 100,0% (99,0-100%) Totale * Dei 21 pazienti con dati ELISA, 18 erano DGP IgA EIA negativi. Dei 21 pazienti senza dati ELISA, 6 avevano risultati di biopsia Marsh III, 4 Marsh II e 11 non avevano un risultato della biopsia. Sensibilità e specificità clinica del test QUANTA Flash DGP IgA nella DH: Diagnosi Analisi N=373 Esente DH Totale (Confidenza 95%) da DH Positivo Sensibilità = 61,9% (38,4-81,9%) QUANTA Flash Negativo 8* Specificità = 100,0% (99,0-100%) DGP IgA Totale *Sei campioni erano anche negativi al DGP IgA EIA. Distribuzione della popolazione di controllo dalla patologia usata nello studio di convalida: Gruppo di pazienti N Negativo Positivo Percentuale di positivi Patologia epatica autoimmune % Epatite virale % Malattia intestinale infiammatoria (Crohn + colite ulcerosa) % Infezione da H. pylori % Allergie alimentari % Malattia reumatica sistemica % Patologia tiroidea autoimmune % Pazienti con sintomi gastrointestinali % Diabete mellito di tipo I % Artrite reumatoide % Altra malattia infettiva (HIV, sifilide) % Totale % Riepilogo dei valori di sensibilità e specificità clinica nella CD in base ai gruppi di età: Fascia di età DGP IgA Sensibilità, % Specificità, % 1 mesi 2 anni 50,0 100,0 2 anni 12 anni 66,7 100, anni 58,3 100,0 >21 anni 77,4 100,0 < 21 anni (totale) 63,5 100,0 Totale 71,4 100,0 8

9 Campione Precisione e riproducibilità La ripetibilità del test QUANTA Flash DGP IgA è stata valutata su 7 campioni contenenti varie concentrazioni di anticorpi DGP IgA in accordo con CLSI EP5-A2 e i dati sono riassunti di seguito: Campio ne Numero di replicati Media Intra-test CV (%) Intertest CV (%) Tra un giorno e l'altro CV (%) Totale CV (%) ,6 5,4 5,1% 0,0 0,0% 6,8 6,4% 8,6 8,2% ,1 2,1 5,9% 0,0 0,0% 3,8 10,7% 4,3 12,2% ,4 0,9 5,8% 0,0 0,0% 1,0 6,2% 1,3 8,5% ,4 1,0 3,1% 0,3 0,8% 2,2 6,8% 2,4 7,5% ,8 5,9 4,6% 4,1 3,2% 8,6 6,7% 11,2 8,7% ,5 0,4 4,0% 0,2 1,9% 0,6 5,8% 0,8 7,3% ,8 94,9 4,9% 63,8 3,3% 149,7 7,8% 188,4 9,8% Inoltre, sono stati condotti studi di precisione presso tre diversi siti di test (INOVA Diagnostics, Inc. e due siti di test esterni) al fine di valutare la riproducibilità. Presso il sito INOVA sono stati inclusi come variabili due lotti di reagenti, due lotti di calibratori e due operatori. La Riproducibilità totale è stata calcolata sulla base della precisione intratest, intertest, inter-lotto, inter-lotto di calibratori, tra operatori e tra siti: Media Numero di replicati Intratest CV (%) Intertest CV (%) Tra lotti di reagenti CV (%) Tra lotti di calibratori CV (%) Tra operatori CV (%) Tra siti Campione n.1 12,9 80 0,8 6,4 0,7 5,2 0,4 3,1 0,7 5,6 0,8 5,8 1,1 9,1 1,9 14,8 Campione n.2 25,5 80 1,0 3,8 1,4 5,5 1,1 4,1 1,6 6,3 0,6 2,3 1,8 7,0 3,2 12,6 Campione n.3 136,8 80 4,0 2,9 8,9 6,5 7,5 5,5 10,4 7,6 4,4 3,2 11,2 8,3 20,1 14,7 Intervallo di misurazione analitica Il limite inferiore di rilevamento di questo test determinato in base a CLSI EP17-A è 730,3 RLU, che è inferiore all'intervallo di misurazione analitica (5,2 CU). L'intero AMR da 5,2 CU a 2367,3 CU è lineare. È stato condotto uno studio di linearità in base a CLSI EP6-A usando sei campioni sierici con varie concentrazioni di DGP IgA. Tutti i sei campioni hanno mostrato singolarmente una linearità di diluizione e i dati combinati hanno portato i seguenti risultati con regressione lineare: Campione Intervallo di test Pendenza (IC 95%) Intercettazione Y (95% IC) R² Tutti i campioni da 5,2 a 2596,8 1,05 (da 1,03 a 1,07) 6,19 (da -8,49 a 20,86) 0,99 I campioni positivi con risultati al di sopra dell'intervallo di misurazione analitico non mostrano effetto gancio fino a 5167,2 CU nel test DGP IgA. Interferenza, reattività crociata Non è stata rilevata alcuna interferenza con l'emoglobina fino a 200 mg/dl, trigliceridi fino a 1000 mg/dl, colesterolo fino a 224,3 mg/dl, bilirubina fino a 10 mg/dl e IgM RF fino a 500 IU/ ml. Duecentouno campioni tratti da pazienti con varie malattie autoimmuni e infettive sono stati testati per valutare la reattività incrociata. Nessuno è risultato positivo al test DGP IgA e questo indica mancanza di reattività incrociata. CV (%) Totale CV (%) 9

10 QUANTA Flash DGP IgA Calibrators Per uso diagnostico In Vitro Uso previsto I calibratori QUANTA Flash DGP IgA sono concepiti per essere utilizzati con il test di chemiluminescenza (CIA) QUANTA Flash DGP IgA. Ogni calibratore definisce un punto di riferimento per la curva di lavoro usata per determinare i valori pressi in Unità di chemiluminescenza nella misurazione degli anticorpi anti-iga anti-dgp nel siero. Riepilogo e principi della procedura Il test di chemiluminescenza QUANTA Flash DGP IgA utilizza una Curva master predefinita specifica per il lotto memorizzata nel codice a barre della cartuccia di reagente. I calibratori QUANTA Flash DGP IgA sono concepiti per produrre una Curva di lavoro specifica per lo strumento a partire dai parametri della Curva master, con un punto di decisione basato sulle caratteristiche di prestazioni e sulla valutazione clinica del QUANTA Flash DGP IgA CIA. I calibratori sono testati su più strumenti con lotti multipli di reagenti prima dell attribuzione di un valore. Reagenti 1. Calibratore 1 QUANTA Flash DGP IgA: Due (2) provette con etichetta con codice a barre che contengono 0,3 ml di reagente prediluito, pronto all'uso. I calibratori contengono anticorpi umani IgA anti-dgp in tampone, stabilizzanti proteici e conservanti. 2. Calibratore 2 QUANTA Flash DGP IgA: Due (2) provette con etichetta con codice a barre che contengono 0,3 ml di reagente prediluito, pronto all'uso. I calibratori contengono anticorpi umani IgA anti-dgp in tampone, stabilizzanti proteici e conservanti. Avvertenze 1. I calibratori contengono una sostanza chimica (cloramfenicolo 0,02%) ritenuta cancerogena dallo Stato della California. 2. L azoturo di sodio viene usato come conservante. L azoturo di sodio è un veleno e può essere tossico se ingerito o assorbito attraverso la pelle o gli occhi. L azoturo di sodio può reagire con le tubature in piombo o rame e formare azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lavare i lavandini, se usati per lo smaltimento dei reagenti, con grandi volumi di acqua per evitare l accumulo di azide. 3. Tutto il materiale di natura umana utilizzato nella preparazione dei calibratori per questo prodotto è stato testato ed è risultato negativo alla presenza di anticorpi al virus dell'immunodeficienza umana (HIV), dell'antigene superficiale dell'epatite B (HBsAg) e dell'epatite C (HCV) in base a metodi approvati dalla FDA. Nessun metodo di prova tuttavia può offrire l'assicurazione completa dell assenza del virus dell HIV, HCV o altri agenti infettivi. Pertanto, i calibratori QUANTA Flash DGP IgA devono essere maneggiati come materiale potenzialmente infettivo Utilizzare attrezzatura di protezione idonea quando si manipolano i reagenti forniti. 5. I reagenti rovesciati devono essere puliti immediatamente. Durante lo smaltimento delle scorie, rispettare tutti i regolamenti ambientali federali, statali e locali. 10

11 Precauzioni 1. Questo prodotto è destinato a un uso diagnostico In Vitro. 2. I calibratori QUANTA Flash DGP IgA sono concepiti per essere utilizzati con il test QUANTA Flash DGP IgA. 3. Non trasferire i reagenti dei calibratori in provette secondarie. I codici a barre sulle provette vengono usati dallo strumento per abbinare i calibratori con il tipo di test corretto. 4. Una volta che una provetta di un calibratore è stata aperta, può essere utilizzata per massimo 8 ore se il calibratore viene conservato aperto, montato sullo strumento, dopodiché il reagente deve essere eliminato. 5. La contaminazione chimica dei reagenti può derivare da una pulizia o un risciacquo inadeguati dello strumento. I residui di comuni sostanze di laboratorio come la formalina, la candeggina, l etanolo o di detergente possono causare interferenze nel test. Assicurarsi di seguire la procedura di pulizia dello strumento raccomandata come specificato nel manuale operatore di BIO-FLASH. Condizioni di conservazione 1. Conservare i calibratori sigillati a una temperatura compresa tra 2 e 8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e maneggiati in accordo alle istruzioni. 2. I calibratori aperti devono essere eliminati dopo 8 ore. Procedura 1. Ogni nuovo lotto di cartucce di reagente deve essere calibrato prima del primo impiego. Il software non consente l uso di un nuovo lotto se non viene eseguita la calibrazione. 2. Ogni calibratore deve essere delicatamente miscelato prima dell uso per garantire l omogeneità. Evitare la formazione di schiume, in quanto le bolle possono interferire con la rilevazione del livello di liquidi degli strumenti. Stappare le provette del calibratore e collocarle entrambe su un rack per campioni, con i codici a barre rivolti verso gli spazi nel rack. Posizionare il rack dei campioni nel dispositivo di caricamento girevole dello strumento BIO-FLASH e chiudere la porta. Lo strumento leggerà i codici a barre sulle provette del calibratore e identificherà la cartuccia di reagente necessaria. Per istruzioni dettagliate sull'analizzatore chemiluminescente BIO-FLASH e il software BIO-FLASH vedere il manuale operatore fornito insieme al sistema BIO-FLASH. 3. Lo strumento eseguirà ogni calibratore tre volte. Dopo che tutti i calibratori saranno stati eseguiti, il software richiederà la convalida della calibrazione. Dalla schermata Instrument Summary, fare clic sul pulsante freccia Choose more options Ctrl-M ( ). Selezionare Calibration Ctrl-F3. Nella finestra Calibrazione, evidenziare il test desiderato e fare clic su Details. 4. Nella nuova finestra Calibration Details, selezionare la calibrazione appena eseguita. Viene visualizzata la Curva master sotto forma di linea tratteggia e la Curva di lavoro sotto forma di linea continua. Se i risultati di calibrazione sono validi, nella regione in basso a destra della schermata verrà visualizzato un pulsante di convalida. Fare clic sul pulsante Validate Calibration. 5. Una volta che la cartuccia del reagente sarà stata calibrata, il lotto di cartucce su cui è stata eseguita la calibrazione è pronto per l uso. Si raccomanda di eseguire i controlli QUANTA Flash DGP IgA (venduti separatamente codice ) dopo la calibrazione di un lotto di cartucce di reagente. 11

12 Tracciabilità Al momento non esiste alcuno standard internazionale riconosciuto per la misurazione degli anticorpi IgA anti-peptidi di gliadina deamidati. Limiti Questi calibratori sono concepiti per 4 calibrazioni. Il tempo totale di permanenza delle provette di calibratore aperte sullo strumento è di 8 ore. Se i calibratori vengono lasciati aperti, caricati, per un periodo maggiore, devono essere eliminati. L'uso per oltre 8 ore delle stesse provette di calibratore può causare una calibrazione errata del test e questo potrebbe dare luogo a risultati errati. 12

13 QUANTA Flash DGP IgA Controls Per uso diagnostico In Vitro Uso previsto I controlli QUANTA Flash DGP IgA sono concepiti per essere utilizzati per scopi di controllo della qualità del test di chemiluminescenza (CIA) QUANTA Flash DGP IgA. Riepilogo e principi della procedura I controlli QUANTA Flash DGP IgA comprendono un Controllo negativo e un Controllo positivo. Ciascuno contiene una diversa quantità di anticorpi IgA anti-dgp. Il controllo negativo e il controllo positivo vengono usati per monitorare le prestazioni analitiche dell'immunodosaggio chemiluminescente QUANTA Flash DGP Screen. Reagenti 1. Controllo negativo QUANTA Flash DGP IgA: Due (2) provette con etichetta con codice a barre che contengono 0,5 ml di reagente pronto all'uso. I controlli contengono anticorpi umani IgA anti-dgp in tampone, stabilizzanti proteici e conservanti. 2. Controllo positivo QUANTA Flash DGP IgA: Due (2) provette con etichetta con codice a barre che contengono 0,5 ml di reagente pronto all'uso. I controlli contengono anticorpi umani IgA anti-dgp in tampone, stabilizzanti proteici e conservanti. Avvertenze 1. I controlli contengono una sostanza chimica (cloramfenicolo 0,02%) ritenuta cancerogena dallo Stato della California. 2. L azoturo di sodio viene usato come conservante. L azoturo di sodio è un veleno e può essere tossico se ingerito o assorbito attraverso la pelle o gli occhi. L azoturo di sodio può reagire con le tubature in piombo o rame e formare azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lavare i lavandini, se usati per lo smaltimento dei reagenti, con grandi volumi di acqua per evitare l accumulo di azide. 3. Tutto il materiale di origine umana utilizzato nella preparazione dei controlli per questo prodotto è stato testato ed è risultato negativo alla presenza di anticorpi al virus dell'immunodeficienza umana (HIV), dell antigene superficiale dell epatite B (HBsAg) e dell epatite C (HCV) in base a metodi approvati dall FDA. Nessun metodo di prova tuttavia può offrire l'assicurazione completa dell assenza del virus dell HIV, HCV o altri agenti infettivi. Pertanto, i controlli QUANTA Flash DGP IgA devono essere maneggiati come materiale potenzialmente infettivo Utilizzare attrezzatura di protezione idonea quando si manipolano i reagenti forniti. 5. I reagenti rovesciati devono essere puliti immediatamente. Durante lo smaltimento delle scorie, rispettare tutti i regolamenti ambientali federali, statali e locali. Precauzioni 1. Questo prodotto è destinato a un uso diagnostico In Vitro. 2. I controlli QUANTA Flash DGP IgA sono concepiti per essere utilizzati con il test QUANTA Flash DGP IgA. 3. Non trasferire i reagenti dei controlli in provette secondarie. I codici a barre sulle provette vengono utilizzati dallo strumento per identificare il controllo. 13

14 4. Una volta aperta, ogni provetta di controllo può essere utilizzata per massimo 15 volte con un tempo medio di 10 minuti sullo strumento per ciascun impiego, per un totale di 2 ½ ore. 5. La contaminazione chimica dei reagenti può derivare da una pulizia o un risciacquo inadeguati dello strumento. I residui di comuni sostanze di laboratorio come la formalina, la candeggina, l etanolo o di detergente possono causare interferenze nel test. Assicurarsi di seguire la procedura di pulizia dello strumento raccomandata come specificato nel manuale operatore di BIO-FLASH. Condizioni di conservazione 1. Conservare i controlli sigillati a una temperatura compresa tra 2 e 8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e maneggiati in accordo alle istruzioni. 2. I controlli sono concepiti per 15 impieghi, con un tempo medio di 10 minuti sullo strumento per ciascun impiego. Il tempo totale di permanenza delle provette di controllo aperte sullo strumento è di 2 ½ ore. Se i controlli vengono lasciati aperti, caricati, per più di 2 ore e mezzo in totale, devono essere eliminati. 3. Per una stabilità ottimale, rimuovere i controlli dal sistema subito dopo il campionamento degli stessi e conservarli a una temperatura di 2-8 C nella fiala originale chiusa. Procedura Creare nuovi materiali QC per il test DGP IgA: 1. Prima di utilizzare i controlli QUANTA Flash DGP IgA per la prima volta sullo strumento, inserire nel software il nome, il lotto, la data di scadenza, il valore (o la dose) e la deviazione standard di destinazione. 2. Dalla schermata Instrument Summary, fare clic sul pulsante freccia Choose more options Ctrl-M ( ). Selezionare QC Ctrl-F2. Fare clic sul pulsante New QC Material. 3. Ogni set di Controlli comprende una scheda dati specifica per il lotto. Innanzitutto, inserire nel software il nome, il numero del lotto e la data di scadenza contenuti in questa scheda dati. Successivamente, fare clic sul pulsante Add Assay. Nella nuova finestra, assicurarsi di avere selezionato la casella Show All Assays. Selezionare il dosaggio DGP_IgA dall'elenco e fare clic su Add. Infine, inserire la dose di destinazione e la deviazione standard di destinazione. Fare clic su Save. Eseguire questa procedura per entrambi i controlli. Creare un nuovo lotto per i materiali QC esistenti: 1. Prima di utilizzare un nuovo lotto di controlli QUANTA Flash DGP IgA per la prima volta, inserire nel software il lotto, la data di scadenza, il valore (o la dose) e la deviazione standard di destinazione. 2. Dalla schermata Instrument Summary, fare clic sul pulsante freccia Choose more options Ctrl-M ( ). Selezionare QC Ctrl-F2. Evidenziare il test DGP_IgA nella colonna sulla sinistra. Evidenziare il materiale di controllo appropriato sulla destra ( DGPAN per il Controllo negativo o DGPAP per il Controllo positivo). Fare clic sul pulsante New QC Lot. 3. Ogni set di Controlli comprende una scheda dati specifica per il lotto. Inserire nel software le informazioni contenute in questa scheda dati. Includere il numero di lotto, la data di scadenza, la dose di destinazione e la deviazione standard di destinazione. Se necessario, fare clic sul pulsante Add Assay. Nella nuova finestra, assicurarsi di avere selezionato la casella Show All Assays. Selezionare il dosaggio DGP_IgA dall'elenco e fare clic su Add. Fare clic su Save. Eseguire questa procedura per entrambi i controlli. Si raccomanda di utilizzare i controlli QUANTA Flash DGP IgA una volta ogni giorno d'uso del test; tuttavia, gli utenti devono considerare anche i requisiti nazionali/locali. Ogni controllo deve essere delicatamente miscelato prima dell uso per garantire l omogeneità. Evitare la formazione di schiume, in quanto le bolle possono interferire con la rilevazione del livello di liquidi degli strumenti. Stappare le provette del controllo e collocarle entrambe su un rack per campioni, con codici a barre rivolti verso gli spazi nel gap. Posizionare il rack dei campioni nel 14

15 dispositivo di caricamento girevole dello strumento BIO-FLASH e chiudere la porta. Lo strumento leggerà i codici a barre sulle provette del controllo e identificherà la cartuccia di reagente necessaria. Per istruzioni dettagliate sull'analizzatore chemiluminescente BIO-FLASH e il software BIO-FLASH vedere il manuale operatore fornito insieme al sistema BIO-FLASH. Tracciabilità Al momento non esiste alcuno standard internazionale riconosciuto per la misurazione degli anticorpi IgA anti-peptidi di gliadina deamidati. Limiti Questi controlli sono concepiti per 15 impieghi. L etichetta di ogni provetta di controllo comprende una fila di 15 caselle che possono essere selezionate per tracciare il numero di utilizzi. Il tempo totale di permanenza delle provette di controllo aperte sullo strumento è di 2 ½ ore. Se i controlli vengono lasciati aperti, caricati, per un periodo maggiore, devono essere eliminati. 15

16 Bibliografia 1. Trier JS: Celiac Sprue. New England Journal of Medicine 1991, 325: Troncone R and Ferguson A: Antigliadin antibodies. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1991, 12: Husby S, Koletzko S, Korponay-Szabó IR, Mearin ML, Phillips A, Shamir R, Troncone R, Giersiepen K, Branski D, Catassi C, Lelgeman M, Mäki M, Ribes-Koninckx C, Ventura A, Zimmer KP; ESPGHAN Working Group on Coeliac Disease Diagnosis; ESPGHAN Gastroenterology Committee; European Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition. European Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition guidelines for the diagnosis of coeliac disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2012, 54: McMillan SA, Haughton DJ, et al.: Predictive value for coeliac disease of antibodies to gliadin, endomysium and jejunum in patients attending for jejunal biopsy. BMJ 1991, 303: Sugai E, Moreno ML et al: Celiac disease serology in patients with different pre-test probabilities: Is biopsy avoidable? World J Gastroenterol 2010, 16: Burgin-Wolff A, Gaze H, et al.: Antigliadin and antiendomysium antibody determination for coeliac disease. Arch Dis Child 1991, 66: Osman AA, et al.: B-Cell epitopes of gliadin. Clin Exp Immunol 2000, 121: Aleanzi M, et al.: Celiac disease: Antibody recognition against native and selectively deamidaion gliadin peptides. Clinical Chemistry 2001, 47: Schwertz E, et al.: Serologic assay based on gliadin-related nonapeptides as a highly sensitive and specific diagnostic aid in celiac disease. Clinical Chemistry 2004, 50: Fleckenstein B, Qiao S-W, et al: Molecular characterization of covalent complexes between tissue transglutaminase and gliadin peptides. J Biol Chem 2004, 279: Prince HE: Evaluations of the INOVA Diagnostics Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kits for Measuring Serum Immunoglobulins G (IgG) and IgA to Deamidated Gliadin Peptides. Clinical and Vaccine Immunology 2006, 13: Sugai E, et al.: Accuracy of Testing Antibodies to Synthetic Gliadin-Related Peptides in Celiac Disease. Clinical Gastroenterology and Hepatology 2006, 4: Kurppa K, Lindfors K, et al: Antibodies against deamidated gliadin peptides in early stage celiac disease. J Clin Gastroenterol 2010 (epub ahead of print). 14. Volta U, Granito A, et al: Deamidated gliadin peptide antibodies as a routine test for celiac disease. J Clin Gastroenterol 2010, 44: Collin P, et al.: Selective IgA deficiency and coeliac disease. Scand Journal Gastroenterology 1992, 27: Smecuol E, et al.: Permeability, Zonulin Production, and Enteropathy in Dermatitis Herpetiformis. Clinical Gastroenterlogy and Hepatology 2005, 3: Beutner EH, et al.: Sensitivity and Specificity of IgA-class anti-endomysial antibodies for dermatitis herpetiformis and findings relevant to their pathogenic significance. Journal of the American Academy of Dermatology 1986, 15: Jaskowski TD, Donaldson MR et al: Novel screening assay performance in pediatric celiac disease and adult dermatitis herpetiformis. JPGN 2010, 51: Fasano A, Berti I, et al: Prevalence of celiac disease in at-risk and not-at-risk groups in the United States: a large multicenter study. Arch Intern Med 2003, 163: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, 2009, Fifth Edition. 16

17 Simboli utilizzati Dispositivo medico diagnostico In Vitro Consultare le istruzioni per l'uso Limiti di temperatura Non riutilizzare Rischi biologici Codice del lotto Numero di catalogo Data di scadenza Fabbricante Rappresentante autorizzato Contiene materiale sufficiente per < n > test. Controllo positivo Controllo negativo Calibratore 1 Calibratore 2 Contenitore della carta riciclata Questa estremità verso l alto QUANTA Flash è un marchio depositato di INOVA Diagnostics Inc. BIO-FLASH è un marchio depositato di Biokit S.A

18 Prodotto da: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA Stati Uniti d'america Assistenza tecnica (solo USA e Canada): Assistenza tecnica (resto del mondo): support@inovadx.com Rappresentante autorizzato per l'unione europea: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germania Tel.: Fax: ITA Dicembre 2013 Revisione 2 18