BIO-FLASH VEDI CAMBI RISALTATI
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- Cipriano Giacinto Adamo
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1 test è un immunotest a chemiluminescenza a due step totalmente automatizzato per la determinazione qualitativa degli anticorpi IgG contro l Herpes Simplex virus di tipo 1 nel siero e nel plasma umano con lo strumento. Introduzione L Herpes Simplex virus (HSV) è un patogeno umano ampiamente diffuso. Generalmente, le infezioni da HSV provocano manifestazioni subcliniche. 1 Tuttavia, tale virus potrebbe portare all insorgenza di infezioni sistemiche e letali nei neonati e nei soggetti immunocompromessi. A livello sierologico, è possibile distinguere tra due tipi di HSV: HSV-1 e HSV-2. 2 I due virus presentano differenze sia sul piano biologico che epidemiologico. Sebbene entrambi i virus possano provocare infezioni nelle cellule epiteliali, l HSV-1 è normalmente associato a infezioni orali e lesioni nella parte superiore del corpo, mentre l HSV-2 è associato ad infezioni nell area genitale e nella parte inferiore. Tuttavia, esiste una proporzione variabile di infezioni genitali attribuibili all HSV-1; in questo caso, la distinzione è fondamentale, poiché le infezioni da HSV-1 sono clinicamente poco rilevanti e presentano un minor rischio di ricorrenza. Data la forte reattività sierologica crociata tra HSV-1 e 2, risulta estremamente difficile effettuare una diagnosi sierologica specifica per il tipo di virus. Ciononostante, l impiego della glicoproteina G (gg1) ricombinante dell HSV-1 consente di determinare gli anticorpi specifici anti-hsv di tipo 1. 2,3,4,5,6 La detezione precoce dell infezione da Herpes Simplex e l avvio immediato della terapia sono fondamentali nella gestione della malattia. 7 Principio Quando le microparticelle paramagnetiche del si mescolano e si incubano con il campione, gli eventuali anticorpi specifici anti-hsv di tipo 1 presenti si combinano con l antigene-gg1-ricombinante specifico per l HSV-1 che ricopre le microparticelle. Successivamente, viene effettuata una separazione magnetica ed un lavaggio volto ad eliminare il campione residuo. Subito dopo, si aggiunge un tracciatore consistente in un anticorpo monoclonale anti-igg umana marcato con isoluminolo, che si unisce agli anticorpi IgG anti-herpes di tipo 1 catturati dalle microparticelle. Dopo una seconda incubazione, una separazione magnetica ed un altro lavaggio, si aggiungono i reagenti che attivano la reazione chemiluminescente. Il luminometro del misura la luce emessa in unità relative di luce (URL) che sono direttamente proporzionali alla concentrazione di IgG anti-hsv-1 del campione. NOTA: La gg1 è una proteina ricombinante prodotta mediante la tecnologia IBES, che si serve di insetti vivi come bioreattori. Tale tecnologia, di proprietà di Algenex, è stata concessa in licenza. Il utilizza un metodo di riduzione dei dati con adattamento ad una curva logistica a 4 parametri (4PLC) per generare una Curva di Calibrazione Memorizzata (CCM). Questa curva è predefinita, dipende dal lotto e viene memorizzata nello strumento mediante il codice a barre della cartuccia. Con la misurazione dei calibratori (forniti in un kit a parte), la CCM predefinita si trasforma in una nuova Curva di Calibrazione di Lavorazione (CCL), specifica per lo strumento. Le concentrazioni dei calibratori sono incluse nei codici a barre delle provette dei calibratori. Schema della reazione: VEDI CAMBI RISALTATI Attivatori (Triggers) URL Particella magnetica Campione Tracciatore Emissione di luce
2 H Componenti Cartuccia reagenti Il kit contiene una cartucciaa reagenti per 50 determinazioni (REF ). Nota: il disegno della cartuccia è protetto da brevetto (US D565,741 / Disegno CE ) ) Composizione della cartuccia reagenti: La cartuccia è composta da 4 contenitori, così composti: A. 1 contenitore cilindrico per la sospensione di microparticelle ricoperte con antigene gg11 ricombinante specifico per l HSV-1. Contiene < 0,1% di sodio azide. B. 1 contenitore del tampone del d test. Contiene < 0,1% di sodio azide. C. 1 contenitore opaco del tracciatore, consistente in un anticorpo monoclonale di topo anti-igg umana marcato con isoluminolo. Contiene < 0,1% 0 di sodio azide. D. 1 contenitore vuoto. Preparazione Si veda la seguente figura. Cartuccia: le microparticelle sedimentano durantee il trasporto e lo stoccaggio, pertanto si devono mescolare affinché si risospendano. La prima volta che si utilizza la cartuccia la si deve capovolgere conn cura per 30 volte senza che si formi schiuma. Le bolle potrebbero interferire conn i sensori di liquido dello strumento. Verificare che le microparticelle si siano risospese completamente. In caso contrario, continuare a capovolgere la cartuccia finché le microparticelle non saranno risospese nella loroo totalità. Se le microparticelle non si risospendonoo o se si riscontra la rottura del sigillo dei reagenti, NON UTILIZZARE LA CARTUCCIA. Dopo che le microparticelle si saranno risospese, collocare la cartuccia su una superficie solida e rimuovere con attenzione la linguetta rossa di sicurezzaa per il trasporto. Mantenendo la cartuccia sulla superficie solida, stringeree le due linguette situate ai lati del tappo perforatore (parte grigia) e premere la parte superiore della cartucciaa fino a raggiungere la posizione di bloccaggio. Una volta raggiunta la posizione di bloccaggio, le strisce dovranno rimanere nascoste. Non capovolgere e la cartuccia aperta. Lasciare riposare la cartuccia per 5 minuti prima di caricarla nello strumento. Dopo aver caricato la cartuccia, lo strumento mescola il suo contenuto inn modo automatico ad intervalli periodici. N
3 Precauzioni I reagenti sono solo per uso diagnostico IN VITRO. Uso esclusivo per utilizzatori professionali. La sodio azide può reagire con i tubi e le tubature di scarico in piombo o rame, formando azidi metalliche altamente esplosive. Al momento dello smaltimento dei residui di reagenti, sciacquare con abbondante acqua. AVVERTENZA: MATERIALE A RISCHIO BIOLOGICO. Smaltire tutti i materiali usati in appositi recipienti per materiale biocontaminante. Si prega di non riutilizzare né reintrodurre alcun reagente nelle cartucce o nei contenitori. Classe di pericolo Non classificato. Indicazioni di pericolo Nessuna. Consigli di prudenza P280: Indossare guanti/indumenti protettivi/proteggere gli occhi/il viso. P : IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. Raccolta e conservazione dei campioni Usare siero fresco (possono essere utilizzate anche provette con gel separatore di siero) o plasma (EDTA, Li-eparina, Na-eparina, e Na-citrato). Controllare altri anticoagulanti prima del loro uso. Gli anticoagulanti liquidi come il Na-citrato esercitano un effetto diluente e possono ridurre la concentrazione dei campioni dei pazienti. I campioni non devono essere inattivati mediante calore. Le particelle in sospensione devono essere eliminate per centrifugazione. Consultare le direttive CLSI H18-A3 e H21-A5 per ulteriori informazioni relative a manipolazione, trasporto, processo e conservazione dei campioni. Siero I campioni di siero possono essere conservati tra 2 C e 8 C per 8 giorni. Per conservarli durante un periodo di tempo più lungo dovranno essere congelati ad una temperatura uguale o inferiore a -20 C. I campioni possono essere congelati/scongelati al massimo 3 volte. Mescolare accuratamente dopo lo scongelamento. Verificare che i campioni non vi siano bolle e, in caso contrario, eliminarle completamente prima dell'analisi. Plasma I campioni di plasma possono essere conservati tra 2 C e 8 C per 8 giorni. Per conservarli durante un periodo di tempo più lungo, i campioni di plasma dovranno essere congelati ad una temperatura uguale o inferiore a -20 C. Scongelare il plasma a 37 C. I campioni possono essere congelati/scongelati al massimo 3 volte. Mescolare accuratamente dopo lo scongelamento. Verificare che i campioni non vi siano bolle e, in caso contrario, eliminarle completamente prima dell'analisi. Volume di campione Il volume di campione necessario per condurre un'unica prova con varia in base al tipo di recipiente utilizzato. Utilizzando il recipiente per campione raccomandato (REF ), per un test saranno necessari almeno 25 µl più il volume morto, equivalente a 200 µl. Altri materiali I seguenti materiali non vengono forniti con la cartuccia reagenti e devono essere acquistati separatamente. REF REF Calibrators (Calibratori) Controls (Controlli) Se si desiderano ulteriori informazioni, leggere attentamente le relative istruzioni. Non utilizzare altri calibratori. Le informazioni necessarie allo strumento per calibrare il test sono incluse nei codici a barre dei contenitori. L'uso di controlli di altri fabbricanti può originare risultati imprevisti. Prima di processare campioni, calibratori o controlli, assicurarsi che nello strumento vi sia una quantità sufficiente dei seguenti consumabili: REF Cuvettes (Cuvette) Nota: il disegno delle cuvette è protetto da brevetto (US D560,816 / Disegno CE ) REF Triggers (Attivatori) REF System Rinse (Soluzione del sistema)
4 Strumento / conduzione del test Nella Guida per l'utente del si troveranno le istruzioni complete per condurre il test. Calibrazione Il codice a barre della cartuccia contiene una Curva di Calibrazione Memorizzata (CCM), valida per il lotto di reagenti. Tuttavia, per tutti i reagenti è necessaria una Curva di Calibrazione di Lavorazione (CCL), specifica per ciascun lotto e valida fino alla data di scadenza di quest'ultimo. Quando i risultati dei controlli escono dal range di accettazione o quando sono state effettuate regolazioni sullo strumento, si deve ottenere una nuova CCL. Per configurare una CCL, leggere attentamente la Guida per l'utente del. Controllo di qualità Per effettuare un programma completo del controllo di qualità si raccomandano due livelli di controllo. I controlli negativo e positivo sono stati progettati per il suddetto programma. Si raccomanda che ogni laboratorio stabilisca la propria media e deviazione standard nonché un programma di controllo di qualità per il monitoraggio delle prestazioni di laboratorio. I controlli devono essere analizzati almeno ogni 24 ore per giorno di uso. Se i controlli sono fuori range può rendersi necessaria la ricalibrazione dello strumento. Nella Guida per l Utente dello strumento si troveranno ulteriori informazioni. Per l individuazione e la risoluzione di situazioni anomale relative al controllo di qualità consultare Westgard et al. 8 Conservazione e stabilità I reagenti non ancora aperti si mantengono stabili fino alla data di scadenza riportata sull'etichetta della cartuccia se conservati ad una temperatura di 2-8 C e in posizione verticale. Una volta aperta, la stabilità della cartuccia caricata nello strumento o conservata a 2-8 C è di 13 settimane. Tracciabilità dei calibratori e dei controlli Data l assenza di standard internazionali disponibili, i risultati sono espressi in S/CO e sono stati determinati mediante numerosi test effettuati con lo strumento, utilizzando lotti specifici di reagenti e nel rispetto di standard interni. Interpretazione dei risultati La quantità di analita in ciascun campione si determina partendo dalla luce emessa (URL), mediante interpolazione nella Curva di Calibrazione di Lavorazione memorizzata. I risultati del sono espressi in S/CO (rapporto segnale/cut-off). Si tratta di un test qualitativo, in cui il valore numerico del risultato è solamente indicativo della quantità di anticorpi presenti. La misurazione qualitativa degli anticorpi anti-hsv-1 mediante il test contribuisce a determinare lo stato immunitario del paziente: i campioni con una concentrazione < 1,0 S/CO si considerano non reattivi (negativi). i campioni con un risultato 1,0 S/CO si considerano reattivi (positivi). Un risultato positivo indica un infezione da HSV-1 acuta o risolta. Un aumento significativo della concentrazione di anticorpi IgG anti-hsv-1 nei campioni appaiati prelevati ad intervalli di 2-4 settimane e analizzati allo stesso momento potrebbe essere indicativo di un infezione recente o di una riattivazione della stessa. Tuttavia, ai fini della diagnosi, si raccomanda di eseguire oltre a questa procedura anche un rilevamento del virus mediante tecniche di amplificazione ed una determinazione degli anticorpi IgM specifici contro l Herpes Simplex virus. Limitazioni Il risultato di un unico campione non è sufficiente per diagnosticare un'infezione da HSV-1. Pertanto, oltre ai risultati del, si devono considerare altri dati, come ad esempio la sintomatologia, l'anamnesi clinica, i risultati di altri test ed altre informazioni rilevanti. Un risultato negativo non esclude la possibilità di esposizione o infezione da HSV-1. Come in tutti i test immunologici sensibili, vi è la possibilità di ottenere risultati positivi non ripetibili. Risultati attesi La prevalenza dell infezione da HSV a livello globale è aumentata negli ultimi decenni, al punto tale da rappresentare attualmente un importante problema per la salute pubblica. Gli anticorpi contro l HSV-1 aumentano con l età a partire dall infanzia; il loro numero è inoltre correlato allo stato socio-economico, all etnia ed alla comunità culturale di appartenenza. Il 50% degli individui appartenenti ad un ceto socio-economico elevato e l 80% di quelli appartenenti ad uno inferiore risultano positivi al virus entro i 30 anni. 9
5 Caratteristiche funzionali NOTA: i seguenti dati sono rappresentativi; i risultati dei singoli esperimenti possono variare rispetto a tali dati. Comparazione di metodi è stato valutato in studi comparativi con altri test in commercio. Valutazioni interne È stato valutato con un pannello di 2158 campioni di differente provenienza che includeva sieri positivi e negativi di anticorpi IgG anti-hsv. I risultati sono stati comparati con quelli ottenuti mediante un metodo EIA per IgG anti-hsv-1 disponibile in commercio. Metodo di riferimento IND NEG POS Totale NEG POS Totale * * 1 campione è stato eliminato a causa di un risultato inconcludente dopo un secondo test con. I risultati indeterminati non sono stati inclusi nei calcoli. Sono stati ottenuti i seguenti risultati iniziali di sensibilità e specificità relative e concordanza globale: Sensibilità relativa Specificità relativa Concordanza globale N Valore CI del 95% Valore CI del 95% Valore CI del 95% ,5% dal 99,1% al 99,8% 96,4% dal 94,1% al 98,0% 98,9% dal 98,4% al 99,3% I campioni che presentavano delle discrepanze (23) sono stati analizzati con altri metodi IgG per HSV-1 disponibili sul mercato: 2 sono risultati positivi a favore del, 3 sono stati confermati come falsi negativi e 8 come falsi positivi mediante. Infine, 10 campioni sono stati classificati come dubbi data l impossibilità di raggiungere un consenso sul loro stato. Il riepilogo dei risultati rispetto al consenso, esclusi i campioni dubbi, viene mostrato nella seguente tabella: Consenso NEG POS Totale NEG POS Totale Rispetto al consenso sono stati ottenuti i seguenti risultati di sensibilità e specificità relative e concordanza globale: Sensibilità vs. consenso Specificità vs. consenso Concordanza di consenso N Valore CI del 95% Valore CI del 95% Valore CI del 95% ,8% dal 99,5% al 100,0% 98,1 % dal 96,2% al 99,2% 99,5% dal 99,1% al 99,7% Donne in stato di gravidanza 118 campioni di donne in stato di gravidanza, incluse 37 multipare, sono stati messi a confronto con un metodo EIA per IgG anti-hsv-1 disponibile sul mercato. Il riepilogo dei risultati viene mostrato nella seguente tabella: Metodo di riferimento NEG POS Totale NEG POS Totale Questo studio ha evidenziato una concordanza assoluta, con un 100% di co-positività ed un 100% di co-negatività.
6 Valutazione esterna È stata condotta una valutazione esterna presso il Laboratorio de Serología del Centro Nacional de Microbiología dell Instituto de Salud Carlos III di Madrid (Spagna). I campioni sono stati caratterizzati mediante il metodo HerpeSelect ELISA IgG anti-hsv-1 e analizzati con. Metodo di riferimento IND NEG POS Totale NEG POS Totale * * 1 campione è stato eliminato a causa di un risultato inconcludente dopo un secondo test con. I risultati indeterminati non sono stati inclusi nei calcoli. Sono stati ottenuti i seguenti risultati di sensibilità e specificità relative e concordanza globale: Sensibilità relativa Specificità relativa Concordanza globale N Valore CI del 95% Valore CI del 95% Valore CI del 95% ,4% dal 97,7% al 99,9% 98,2 % dal 93,8% al 99,8% 99,1% dal 97,6% al 99,7% Pannello CDC (Centro di controllo delle malattie statunitense) Il pannello di sieri umani da CDC Herpes 2012 contenente 100 campioni di siero in cieco prelevati da 50 pazienti stato testato con. 46 campioni sono risultati positivi all analisi e 54 negativi per gli anticorpi IgG anti-hsv-1. ha fatto registrare una sensibilità del 100,0% ed una specificità del 96,3% (in realtà, in seguito è emerso come i 2 falsi positivi provenissero dallo stesso paziente). Precisione Si valutò, in conformità alle direttive CLSI EP05-A, la precisione intra-test e totale (test per test e giorno per giorno) in svariati test. I risultati sono riepilogati nella seguente tabella: Media(S/CO) Intra-test Totale Controllo negativo 0,29 0,011 SD 0,018 SD Controllo positivo 3,22 3,1% CV 4,4% CV Controllo negativo 0,41 0,019 SD 0,024 SD Intorno al valore di cut-off 0,92 3,6% CV 4,7% CV Campione positivo 7,36 2,6% CV 3,7% CV Riproducibilità Si valutò la riproducibilità tra duplicati, tra lotti e tra strumenti è stata valutata utilizzando 60 campioni. I risultati si mostrano nella seguente tabella: Co-positività Co-negatività N % % Duplicato 2 vs. Duplicato Lotto 2 vs. Lotto Strumento 2 vs. Strumento Interferenze Studi conformi alle direttive CLSI EP7-A hanno dimostrato che le seguenti sostanze potenzialmente interferenti non alterano i risultati del : Sostanza potenzialmente interferente Concentrazione % Interferenza Emoglobina 500 mg/dl 10 Bilirubina indiretta 18 mg/dl 10 Bilirubina diretta 18 mg/dl 10 Trigliceridi 1300 mg/dl 10 Fattore reumatoide 800 UI/mL 10
7 Reattività crociata 250 campioni con reattività crociata potenziale relativamente a sono stati messi a confronto con test IgG anti-hsv-1 disponibili sul mercato con la seguente concordanza: Reattività crociata potenziale Concordanza anti-hsv-2 7/7 anti-toxo IgG (Toxoplasma gondii) 10/10 anti-cmv (anticorpi contro il citomegalovirus umano) 9/9 anti-ebv (anticorpi contro il virus di Epstein-Barr) 10/10 anti-hhsv6 IgG (Herpesvirus umano 6) 10/10 anti-hhsv8 IgG (Herpesvirus umano 8) 9/9* anti-vzv IgG (anticorpi di contro il virus della Varicella-Zoster) 10/10 IgG anti-rosolia 10/10 ANA (anticorpi antinucleari) 10/10 SLE (lupus eritematoso sistemico) 4/4 RF (fattore reumatoide) 10/10 anti-gliadina/ccp3 (anticorpi anti-peptide citrullinato) 10/10 Sifilide 10/10 anti-hbs (anticorpi contro l'antigene di superficie dell Epatite B) 10/10 HBsAg (antigene di superficie dell Epatite B) 10/10 anti-hcv (anticorpi contro il virus dell'epatite C) 9/10 anti-hiv (anticorpi contro il virus dell'immunodeficienza umana) 10/10 anti-pv B19 (Parvovirus B19) 10/10 Candida albicans 10/10 Chlamydia trachomatis 10/10 Neisseria gonorrhoeae 10/10 Pre-vaccinazione influenza 10/10 Post-vaccinazione influenza 9/9* IgG elevate 9/9* IgM elevate 10/10 Anticorpi eterofili 10/10 * 1 risultato dubbio per consenso non inclusi nei calcoli.
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