BIO-FLASH VEDI CAMBI RISALTATI
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- Davide Pinto
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1 BIO-FLASH CMV IgG tests BIO-FLASH CMV IgG è un immunotest a chemiluminescenza a due step totalmente automatizzato per la determinazione semi-quantitativa degli anticorpi IgG anti-citomegalovirus nel siero e nel plasma umano con lo strumento BIO-FLASH. Introduzione Il citomegalovirus umano (CMV) appartiene al gruppo degli Herpes virus, che include anche gli Herpes virus simplex tipo 1 e 2, il virus della varicella Herpes zoster e il virus di Epstein-Barr. Una caratteristica comune di questi virus è che possono causare infezioni latenti. 1 Il CMV è un agente ubiquo che comunemente infetta soggetti di zone geografiche e ambiti economici diversi. La maggior parte della popolazione viene infettata dal virus nel corso della vita; nientemeno che l 81% degli statunitensi di età superiore ai 35 anni è stato esposto al virus. 2 Una caratteristica del CMV è che, dopo l infezione primaria, può persistere a lungo in modo latente e riattivarsi in un secondo momento. L'infezione, la reinfezione o la riattivazione del CMV in soggetti normali, sia adulti che bambini, hanno carattere generalmente asintomatico. Tuttavia, le infezioni in pazienti immunodepressi od oncologici, o in conseguenza di un'infezione intrauterina o perinatale, possono derivare in casi clinicamente gravi di malattia. 1-8 Le trasfusioni di sangue e il trapianto di organi sono cause importanti di infezione da CMV in pazienti immunodepressi. 9 È possibile prevenire la trasmissione del CMV a riceventi di organi tramite la selezione dei donatori, che devono essere sieronegativi per gli anticorpi anti-cmv. La riattivazione, a causa di terapie immunosoppressive, di virus latenti endogeni è un'altra causa notevole di patologia in pazienti immunodepressi. 10 Il rilevamento di un aumento significativo di anticorpi IgG specifici per CMV in coppie di sieri e il rilevamento di anticorpi IgM specifici per CMV forniscono informazioni utili per la diagnosi sierologica di un'infezione da CMV. I test sierologici per il rilevamento di anticorpi anti-cmv sono importanti nella determinazione dell esistenza di un infezione previa, nella diagnosi di una infezione attiva o recente, e nell analisi del sangue per realizzare trasfusioni a neonati e soggetti immunocompromessi. 11 Principio Quando le microparticelle paramagnetiche del BIO-FLASH CMV IgG si mescolano e si incubano con il campione, se esso presenta anticorpi specifici anti-cmv, questi ultimi si combinano con gli antigeni del CMV che ricoprono le microparticelle. Dopo una separazione magnetica ed un lavaggio volto ad eliminare il campione residuo, si aggiunge un tracciatore consistente in un anticorpo monoclonale anti-igg umana marcato con isoluminolo, che si unisce agli anticorpi IgG anti-cmv catturati dalle microparticelle. Dopo una seconda incubazione, una separazione magnetica ed un altro lavaggio, si aggiungono i reagenti che attivano la reazione chemiluminescente. Il luminometro del BIO-FLASH misura la luce emessa in unità relative di luce (URL), che sono direttamente proporzionali alla concentrazione di IgG anti-cmv del campione. Il BIO-FLASH utilizza un metodo di riduzione dei dati con adattamento ad una curva logistica a 4 parametri (4PLC) per generare una Curva di Calibrazione Memorizzata (CCM). Questa curva è predefinita, dipende dal lotto e viene memorizzata nello strumento mediante il codice a barre della cartuccia. Con la misurazione dei calibratori (forniti in un kit a parte), la CCM predefinita si trasforma in una nuova e specifica Curva di Calibrazione di Lavorazione (CCL) per lo strumento. Le concentrazioni dei calibratori sono incluse nei codici a barre delle provette dei calibratori. Schema della reazione: VEDI CAMBI RISALTATI Attivatori agitare per (Triggers) rotazione Activadores URL (Triggers) URL Emissione di Particella magnetica Campione Tracciatore Emissione luce di luce
2 Componenti Cartuccia reagenti Il kit BIO-FLASH CMV IgG contiene una cartuccia reagenti per 50 determinazioni (REF ). Nota: il disegno della cartuccia è protetto da brevetto (US D565,741 / Disegno CE ) Composizione della cartuccia reagenti: La cartuccia è composta da 4 contenitori, così composti: A. 1 contenitore cilindrico per la sospensione di microparticelle ricoperte con antigene di CMV in tampone glicina. Contiene < 0,1% di sodio azide. B. 1 contenitore del tampone del test. Contiene < 0,1% di sodio azide. C. 1 contenitore opaco del tracciatore, consistente in un anticorpo monoclonale di topo anti-igg umana marcato con isoluminolo. Contiene < 0,1% di sodio azide. D. 1 contenitore vuoto. Preparazione Si veda la seguente figura. Cartuccia: le microparticelle sedimentano durante il trasporto e lo stoccaggio, pertanto si devono mescolare affinché si risospendano. La prima volta che si utilizza la cartuccia la si deve capovolgere con cura per 30 volte senza che si formi schiuma (le bolle possono far sì che i sensori di liquido dello strumento diano letture errate). Verificare che le microparticelle si siano risospese completamente. In caso contrario, continuare a capovolgere la cartuccia finché le microparticelle non saranno risospese nella loro totalità. Se le microparticelle non si risospendono o se si riscontra la rottura del sigillo dei reagenti, NON UTILIZZARE LA CARTUCCIA. Dopo che le microparticelle si saranno risospese, collocare la cartuccia su una superficie solida e rimuovere con attenzione la linguetta rossa di sicurezza per il trasporto. Mantenendo la cartuccia sulla superficie solida, stringere le due linguette situate ai lati del tappo perforatore (parte grigia) e premere la parte superiore della cartuccia fino a raggiungere la posizione di bloccaggio. Una volta raggiunta la posizione di bloccaggio, le strisce dovranno rimanere nascoste. Non capovolgere la cartuccia aperta. Lasciare riposare la cartuccia per 5 minuti prima di caricarla nello strumento. Dopo aver caricato la cartuccia, lo strumento mescola il suo contenuto in modo automatico ad intervalli periodici.
3 Precauzioni I reagenti BIO-FLASH sono solo per uso diagnostico IN VITRO. Uso esclusivo per utilizzatori professionali. La sodio azide può reagire con i tubi e le tubature di scarico in piombo o rame, formando azidi metalliche altamente esplosive. Al momento dello smaltimento dei residui di reagenti, sciacquare con abbondante acqua. ATTENZIONE: MATERIALE A RISCHIO BIOLOGICO. Smaltire tutti i materiali usati in appositi recipienti per materiale biocontaminante. Si prega di non riutilizzare né reintrodurre alcun reagente nelle cartucce o nei contenitori. Classe di pericolo Non classificato. Indicazioni di pericolo Nessuna. Consigli di prudenza P280: Indossare guanti/indumenti protettivi/proteggere gli occhi/il viso. P : IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. Raccolta e conservazione dei campioni Usare siero fresco (possono essere utilizzate anche provette con gel separatore di siero) o plasma (EDTA, Li-eparina, Li-eparina in provetta con gel separatore, Na-eparina e Na-citrato). Controllare altri anticoagulanti prima del loro uso. Gli anticoagulanti liquidi come il Na-citrato esercitano un effetto diluente e possono ridurre la concentrazione dei campioni dei pazienti. I campioni non devono essere inattivati mediante calore. Le particelle in sospensione devono essere eliminate per centrifugazione. Consultare le direttive CLSI H18-A3 e H21-A5 per ulteriori informazioni relative a manipolazione, trasporto, processo e conservazione dei campioni. Siero I campioni di siero possono essere conservati tra 2 C e 8 C per 8 giorni. Per conservarli durante un periodo di tempo più lungo dovranno essere congelati ad una temperatura uguale o inferiore a -20 C. I campioni possono essere congelati/scongelati al massimo 3 volte. Mescolare accuratamente dopo lo scongelamento. Verificare che i campioni non vi siano bolle e, in caso contrario, eliminarle completamente prima dell analisi. Plasma I campioni di plasma possono essere conservati tra 2 C e 8 C per 8 giorni. Per conservarli durante un periodo di tempo più lungo dovranno essere congelati ad una temperatura uguale o inferiore a -20 C. Scongelare il plasma a 37 C. Scongelare i campioni una volta sola. Mescolare accuratamente dopo lo scongelamento. Verificare che i campioni non vi siano bolle e, in caso contrario, eliminarle completamente prima dell analisi. Volume di campione Il volume di campione necessario per condurre un unica prova con BIO-FLASH CMV IgG varia in base al tipo di recipiente utilizzato. Utilizzando il recipiente per campione raccomandato (REF ), per un test saranno necessari almeno 10 µl più il volume morto, equivalente a 200 µl. Altri materiali I seguenti materiali non vengono forniti con la cartuccia reagenti e devono essere acquistati separatamente. REF REF BIO-FLASH CMV IgG Calibrators (Calibratori) BIO-FLASH CMV IgG Controls (Controlli) Se si desiderano ulteriori informazioni, leggere attentamente le relative istruzioni. Non utilizzare altri calibratori. Le informazioni necessarie allo strumento BIO-FLASH per calibrare il test BIO-FLASH CMV IgG sono incluse nei codici a barre dei contenitori. L uso di controlli di altri fabbricanti può originare risultati imprevisti. Prima di processare campioni, calibratori o controlli, assicurarsi che nello strumento BIO-FLASH vi sia una quantità sufficiente dei seguenti consumabili: REF BIO-FLASH Cuvettes (Cuvette) Nota: Il disegno delle cuvette è protetto da brevetto (US D560,816 / Disegno CE ) REF BIO-FLASH Triggers (Attivatori) REF BIO-FLASH System Rinse (Soluzione del sistema)
4 Il seguente materiale di consumo è necessario se si abilita l opzione di re-run automatico: REF BIO-FLASH Sample Diluent (Diluente dei campioni) Strumento / conduzione del test Nella Guida per l Utente del BIO-FLASH si troveranno le istruzioni complete per condurre il test. Calibrazione Il codice a barre della cartuccia contiene una Curva di Calibrazione Memorizzata (CCM), valida per il lotto di reagenti. Tuttavia, per tutti i reagenti è necessaria una Curva di Calibrazione di Lavorazione (CCL), specifica per ciascun lotto e valida fino alla data di scadenza di quest ultimo. Quando i risultati dei controlli escono dal range di accettazione o quando sono state effettuate regolazioni sullo strumento, si deve ottenere una nuova CCL. Per configurare una CCL, leggere attentamente la Guida per l Utente del BIO-FLASH. Controllo di qualità Per effettuare un programma completo del controllo di qualità si raccomandano due livelli di controllo. I controlli BIO-FLASH CMV IgG negativo e positivo sono stati progettati per il suddetto programma. Si raccomanda che ogni laboratorio stabilisca la propria media e deviazione standard nonché un programma di controllo di qualità per il monitoraggio delle prestazioni di laboratorio. I controlli devono essere analizzati almeno ogni 24 ore per giorno di uso. Se i controlli sono fuori range può rendersi necessaria la ricalibrazione dello strumento. Nella Guida per l Utente dello strumento si troveranno ulteriori informazioni. Per l individuazione e la risoluzione di situazioni anomale relative al controllo di qualità consultare Westgard et al. 12 Conservazione e stabilità I reagenti non ancora aperti si mantengono stabili fino alla data di scadenza riportata sull etichetta della cartuccia se conservati ad una temperatura di 2-8 C in posizione verticale. Una volta aperta, la stabilità della cartuccia caricata nello strumento BIO-FLASH o conservata a 2-8 C è di 5 settimane. Tracciabilità dei calibratori e dei controlli In quanto non esiste uno standard internazionale, i risultati sono espressi in UA/mL e sono stati standardizzati mediante numerosi test con lo strumento BIO-FLASH utilizzando lotti specifici di reagenti, rispetto a uno standard interno. Interpretazione dei risultati La quantità di analita in ciascun campione si determina partendo dalla luce emessa (URL), mediante interpolazione nella Curva di Calibrazione di Lavorazione memorizzata. La determinazione quantitativa delle IgG anti-cmv con il test BIO-FLASH CMV IgG aiuta a determinare lo stato immunitario del paziente: I campioni con una concentrazione < 8,0 UA/mL si considerano non reattivi (negativi). I campioni con una concentrazione 8,0 e < 10,0 UA/mL si considerano indeterminati (zona grigia). I campioni che sono stati interpretati come indeterminati devono essere nuovamente analizzati. Se anche con la seconda analisi si ottiene un risultato indeterminato, si deve riportare come tale e si deve condurre un altro test con un metodo alternativo, oppure si deve ottenere ed analizzare un secondo campione. I campioni con una concentrazione 10,0 UA/mL si considerano reattivi (positivi). Un risultato positivo indica un infezione passata o acuta da CMV. Un aumento significativo della concentrazione di anticorpi IgG anti-cmv in coppie di campioni estratti a intervalli di 2-4 settimane e testati contemporaneamente può essere indicativo di un infezione recente o di una riattivazione dell infezione. Tuttavia, a scopo di diagnosi, si consiglia di associare questa procedura con la rilevazione del DNA del virus dei globuli bianchi o nel sangue totale mediante tecniche di amplificazione e la determinazione di anticorpi IgM specifici per CMV. Il test BIO-FLASH CMV IgM REF risulta essere adeguato a tal fine. Limitazioni Il risultato di un unico campione non è sufficiente per diagnosticare un infezione primaria da CMV o una riattivazione dell infezione. Pertanto, oltre ai risultati del BIO-FLASH CMV IgG, si devono considerare altri dati, come ad esempio la sintomatologia, l anamnesi clinica, i risultati di altri test ed altre informazioni rilevanti. Il test è di tipo semi-quantitativo. Non diluire i campioni all interno dell intervallo di linearità. Nel caso in cui l opzione di re-run automatico sia attivata, alcuni campioni con valori eccedenti il limite superiore dell intervallo di linearità potranno fornire risultati inferiori a quelli attesi.
5 Risultati attesi La prevalenza dell infezione da CMV in soggetti adulti varia ampiamente in diverse zone del mondo e, persino in una stessa area geografica, tra gruppi aventi età e condizioni socioeconomiche distinte. In uno studio interno, la prevalenza di sieropositività rilevata in 642 campioni appartenenti a donanti di sangue non selezionati di Barcellona (Spagna) è stata del 70% circa. Nell Europa Centrale, il 50% circa degli adulti giovani è infettato da CMV. Nella popolazione di età più avanzata, il livello di sieropositività si situa tra il 70 e l 80%. 13 Caratteristiche funzionali NOTA: i seguenti dati sono rappresentativi; i risultati dei singoli esperimenti possono variare rispetto a tali dati. Comparazione di metodi BIO-FLASH CMV IgG è stato valutato in studi comparativi con altri test in commercio. Valutazione interna Fu valutato con BIO-FLASH CMV IgG un pannello di campioni di differente provenienza che includeva sieri positivi e negativi di anticorpi IgG anti-cmv. I risultati furono comparati con quelli ottenuti mediante un metodo EIA CMV IgG commerciale. Nei calcoli non si tenne conto dei risultati indeterminati. Metodo di riferimento BIO-FLASH CMV IgG NEG POS Totale IND NEG POS Totale Si ottennero i seguenti risultati iniziali di sensibilità e specificità relative e concordanza globale: Sensibilità relativa Specificità relativa Concordanza globale ,8% 98,7% a 100,0% 100,0% 98,2% a 100,0% 99,8% 99,1% a 100,0% Lo stesso pannello fu testato con altri metodi in commercio di CMV IgG e si risolsero i campioni discrepanti. Il riepilogo dei risultati di consenso, esclusi i 5 campioni indeterminati con BIO-FLASH CMV IgG ed i 3 campioni per i quali non si arrivò ad un consenso, viene mostrato nella seguente tabella: Consenso BIO-FLASH CMV IgG NEG POS Totale NEG POS Totale Rispetto al consenso si ottennero i seguenti risultati di sensibilità, specificità e concordanza globale: Sensibilità vs. consenso Specificità vs. consenso Concordanza vs. consenso ,8% 98,7% a 100,0% 100,0% 98,1% a 100,0% 99,8% 99,1% a 100,0% Valutazione esterna Si effettuò una valutazione esterna presso il Servei de Microbiologia del Hospital de la Santa Creu i Sant Pau di Barcellona (Spagna). I campioni furono caratterizzati mediante un altro metodo in commercio, MEIA CMV IgG, ed analizzati con BIO-FLASH CMV IgG. Nei calcoli non si tenne conto dei risultati indeterminati.
6 Metodo di riferimento BIO-FLASH CMV IgG NEG POS Totale IND NEG POS Totale Si ottennero i seguenti risultati iniziali di sensibilità e specificità relative e concordanza globale: Sensibilità relativa Specificità relativa Concordanza globale ,4% 96,0% a 99,6% 98,3% 95,0% a 99,6% 98,3% 96,6% a 99,3% I campioni discrepanti vennero analizzati con un metodo ELFA CMV IgG commerciale. Dopo il test supplementare si ottennero i seguenti risultati finali di sensibilità, specificità e concordanza globale: Sensibilità finale Specificità finale Concordanza globale finale ,4% 96,0% a 99,6% 98,8% 95,8% a 99,9% 98,6% 96,9% a 99,5% Pannello SeraCare-BBI Si analizzò il pannello commerciale BBI pannello a titolo misto anti-cmv PTC202, composto da 11 campioni caratterizzati. I risultati del test BIO-FLASH CMV IgG concordarono, in tutti i casi, con il consenso di risultati della maggior parte dei fabbricanti. Pannello CDC Il pannello di sieri CMV IgG della CDC, composto da 53 campioni di siero positivi e da 47 campioni di siero negativi, fu analizzato con il test BIO-FLASH CMV IgG con un risultato di sensibilità e specificità del 100,0%. Nei calcoli non si tenne conto dei risultati indeterminati. Precisione Si valutò, in conformità alle direttive CLSI EP05-A, la precisione intra-test e totale (test per test e giorno per giorno) in svariati test. I risultati sono riepilogati nella seguente tabella: Media (UA/mL) CV% (Intra-test) CV% (Totale) Controllo negativo 5,1 7,3 13,3 Controllo positivo 121,9 7,2 10,9 Intorno al valore di cut-off 12,2 6,8 10,0 Riproducibilità Si valutò la riproducibilità tra duplicati, tra lotti e tra strumenti. I risultati si mostrano nella seguente tabella: Pendente Intersezione R Duplicato 2 vs. Duplicato ,01 1,00 a 1,04 0,00-0,53 a 0,46 1,00 0,99 a 1,00 Lotto 2 vs. Lotto ,08 1,05 a 1,12-0,08-1,14 a 0,05 0,99 0,98 a 1,00 Strumento 2 vs. Strumento ,04 1,02 a 1,08 0,00-2,01 a 0,30 0,99 0,99 a 1,00 Interferenze Studi conformi alle direttive CLSI EP7-A hanno dimostrato che le seguenti sostanze potenzialmente interferenti non alterano i risultati del BIO-FLASH CMV IgG: Sostanza potenzialmente interferente Concentrazione % Interferenza Emoglobina 500 mg/dl 10 Bilirubina indiretta 18 mg/dl 10 Bilirubina diretta 18 mg/dl 10 Trigliceridi 1300 mg/dl 10
7 Reattività crociata Quando si analizzarono 102 campioni potenzialmente capaci di produrre reattività crociata con il test BIO-FLASH CMV IgG e si confrontarono i risultati con quelli di test commerciali per CMV IgG, si evidenziò la seguente concordanza: Reattività incrociata potenziale Concordanza IgG contro la rosolia 4/4 Anti-Toxo IgG (anticorpi contro il Toxoplasma gondii) 8/8 Anti-HIV (anticorpi contro il virus dell immunodeficienza umana) 6/6 HAMA (anticorpo umano antimurino) 5/5 SLE (lupus eritematoso sistemico) 1/1 ANA (anticorpi antinucleari) 10/10 Anti-EBV (anticorpi contro il virus di Epstein-Barr) 4/5 Anti-PV B19 (anticorpi contro il Parvovirus B19) 6/6 Anti-HSV 1 (anticorpi contro il virus Herpes simplex di tipo 1) 4/5 Anti-VZV (anticorpi di contro il virus della Varicella-Zoster) 4/5 Paraproteine IgG e IgM 6/6 IgG e IgM elevate 5/5 Anticorpi eterofili 4/4 RF (fattore reumatoide) 10/10 Donne in gravidanza (incluse multipare) 22/22 Limite di rilevamento In conformità alle direttive CLSI EP17-A, il limite di rilevamento (LR) si situa a 0,3 UI/mL. Limite di quantificazione In conformità alle direttive CLSI EP17-A, il limite di quantificazione (LQ) si situa a 0,7 UI/mL. Linearità Il test BIO-FLASH CMV IgG è di tipo semi-quantitativo ed lineare tra 0,7 e 800 UA/mL. Tuttavia, la linearità si può ampliare fino a UA/mL mediante diluizione se si abilita l opzione di re-run automatico. Consultare la Guida per l Utente del BIO-FLASH per abilitare l opzione di re-run automatico.
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