BIO-FLASH. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n Lliçà d Amunt - Barcelona - SPAIN
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1 VEDI CAMBI RISALTATI BIO-FLASH anti-hbc test BIO-FLASH anti-hbc è un immunotest a chemiluminescenza a due step totalmente automatizzato per la determinazione qualititativa degli anticorpi totali contro l'antigene core dell'epatite B (anti-hbc) nel siero e nel plasma umano con lo strumento BIO-FLASH. Introduzione L'epatite B è un'infezione del fegato prodotta dal virus dell'epatite B (HBV), che rappresenta un grave problema di salute globale. Il virus provoca una serie di malattie del fegato, che vanno dall epatite acuta e cronica alla cirrosi e al cancro epatico primario. Le malattie causate dal virus dell'epatite B hanno una distribuzione globale. Si stima che circa un terzo della popolazione mondiale sia stato infettato con l HBV. Di questa quantità, circa 350 milioni di persone sono cronicamente infette e a rischio di grave malattia e di morte, soprattutto da cirrosi epatica e carcinoma epatocellulare. L infezione da HBV varia notevolmente nelle diverse aree geografiche, e la prevalenza di HBV cronica può variare dallo 0,2 al 15%. Le principali modalità di trasmissione dell'hbv sono l'esposizione perinatale alla madre infetta, orizzontale, parenterale e sessuale, i cui tassi relativi variano nelle diverse aree del mondo. La trasmissione parenterale e la sessuale predominano nei paesi industrializzati, mentre la trasmissione orizzontale e la perinatale predominano nei paesi in via di sviluppo. 1, 2 Durante l'infezione virale appaiono diversi marcatori sierologici, tra i quali l'anti-hbc. L'antigene core dell'epatite B (HBcAg) è un componente interno del virus dell'epatite B che è antigenicamente differente dall'antigene di superficie dell'epatite B (HBsAg). Il sistema d'antigene-anticorpo HBcAg/anti-HBc è stato descritto nel 1971 da Almeida et al. 3 L'anti-HBc è generalmente rilevabile nel sangue subito dopo il rilevamento di HBsAg e prima della manifestazione clinica dell epatite. Nell epatite B acuta con recupero, l'anti-hbc è l'unico marcatore sierologico di infezione nel periodo compreso tra la scomparsa dell HBsAg e la comparsa dell anti-hbs. Gli anticorpi anti-hbc possono persistere per tutta la vita, mentre gli anticorpi anti-hbs possono diventare negativi in alcuni pazienti. Nell'epatite B cronica, l'anti-hbc è rilevato con l'hbsag, ma in alcuni individui questo antigene può diventare non rilevabile. Le donazioni di sangue prelevato quando l'anticorpo anti-hbc è l'unico marcatore sierologico di epatite B possono essere infettive ed è stato suggerito che lo screening per l'anti-hbc, oltre allo screening per l HBsAg, potrebbe ridurre ulteriormente l'incidenza di epatite B in seguito a trasfusione. 5 Infatti, lo screening per l'anti-hbc nelle donazioni di sangue è obbligatorio in diversi paesi. La determinazione degli anticorpi anti-hbc, HBsAg e anti-hbs è raccomandata in caso di pazienti immunodepressi come i pazienti con HIV e nel caso di soggetti immunodepressi, a causa di un aumento del rischio di riattivazione dell'epatite B. D'altra parte, la ricerca di anti-hbc dovrebbe essere eseguita su tutti i soggetti prima della somministrazione del vaccino contro l'epatite B, per determinare lo status immunitario allo scopo di vaccinare solo gli individui negativi all anti-hbc. Principio Quando le microparticelle paramagnetiche e il tampone del test del BIO-FLASH anti-hbc si mescolano e si incubano con il campione, se esso presenta anticorpi specifici anti-hbc, questi ultimi si combinano con l'antigene HBc che ricopre le microparticelle. Dopo una separazione magnetica ed un lavaggio volto ad eliminare il campione residuo, si aggiunge un tracciatore consistente in un anticorpo IgG di coniglio anti-hbc marcato con isoluminolo, che può legarsi all'antigene HBc che riveste le microparticelle. Dopo una seconda incubazione, una separazione magnetica ed un altro lavaggio, si aggiungono i reagenti che attivano la reazione chemiluminescente. Il luminometro del BIO-FLASH misura la luce emessa in unità relative di luce (URL), che sono inversamente proporzionali alla concentrazione di anti-hbc del campione. Il BIO-FLASH utilizza un metodo di riduzione dei dati con adattamento ad una curva logistica a 4 parametri (4PLC) per generare una Curva di Calibrazione Memorizzata (CCM). Questa curva è predefinita, dipende dal lotto e viene memorizzata nello strumento mediante il codice a barre della cartuccia. Con la misurazione dei calibratori (forniti in un kit a parte), la CCM predefinita si trasforma in una nuova Curva di Calibrazione di Lavorazione (CCL), specifica per lo strumento. Le concentrazioni dei calibratori sono incluse nei codici a barre delle provette dei calibratori.
2 Schema della reazione: Attivatori (Triggers) URL Particella magnetica Campione Tracciatore Emissione di luce Componenti Cartuccia reagenti Il kit BIO-FLASH anti-hbc contiene una cartuccia reagenti per 100 determinazioni (REF ). Nota: il disegno della cartuccia è protetto da brevetto (US D565,741 / Disegno CE ) Composizione della cartuccia reagenti: La cartuccia è composta da 4 contenitori, così composti: A. 1 contenitore cilindrico per la sospensione di microparticelle ricoperte con antigene HBc ricombinante. Contiene < 0,1% di sodio azide. B. 1 contenitore del tampone del test. C. 1 contenitore opaco del tracciatore, consistente in un anticorpo di coniglio IgG anti-hbc marcato con isoluminolo. Contiene < 0,1% di sodio azide. D. 1 contenitore vuoto. Preparazione Si veda la seguente figura. Cartuccia: le microparticelle sedimentano durante il trasporto e lo stoccaggio, pertanto si devono mescolare affinché si risospendano. La prima volta che si utilizza la cartuccia la si deve capovolgere con cura per 30 volte senza che si formi schiuma (le bolle possono far sì che i sensori di liquido dello strumento diano letture errate). Verificare che le microparticelle si siano risospese completamente. In caso contrario, continuare a capovolgere la cartuccia finché le microparticelle non saranno risospese nella loro totalità. Se le microparticelle non si risospendono o se si riscontra la rottura del sigillo dei reagenti, NON UTILIZZARE LA CARTUCCIA. Dopo che le microparticelle si saranno risospese, collocare la cartuccia su una superficie solida e rimuovere con attenzione la linguetta rossa di sicurezza per il trasporto. Mantenendo la cartuccia sulla superficie solida, stringere le due linguette situate ai lati del tappo perforatore (parte grigia) e premere la parte superiore della cartuccia fino a raggiungere la posizione di bloccaggio. Una volta raggiunta la posizione di bloccaggio, le strisce dovranno rimanere nascoste. Non capovolgere la cartuccia aperta. Lasciare riposare la cartuccia per 5 minuti prima di caricarla nello strumento. Dopo aver caricato la cartuccia, lo strumento mescola il suo contenuto in modo automatico ad intervalli periodici.
3 Precauzioni I reagenti BIO-FLASH sono solo per uso diagnostico IN VITRO. Uso esclusivo per utilizzatori professionali. La sodio azide può reagire con i tubi e le tubature di scarico in piombo o rame, formando azidi metalliche altamente esplosive. Al momento dello smaltimento dei residui di reagenti, sciacquare con abbondante acqua. ATTENZIONE: MATERIALE A RISCHIO BIOLOGICO. Smaltire tutti i materiali usati in appositi recipienti per materiale biocontaminante. Si prega di non riutilizzare né reintrodurre alcun reagente nelle cartucce o nei contenitori. Raccolta e conservazione dei campioni Usare siero fresco (possono essere utilizzate anche provette con gel separatore di siero) o plasma (EDTA, Li-eparina, Na-eparina, Na-Citrato e ACD). Controllare altri anticoagulanti prima del loro uso. I campioni non devono essere inattivati mediante calore. Le particelle in sospensione devono essere eliminate per centrifugazione. Consultare le direttive CLSI H18-A3 e H21-A5 per ulteriori informazioni relative a manipolazione, trasporto, processo e conservazione dei campioni. Siero I campioni di siero possono essere conservati tra 2 C e 8 C per 8 giorni. Per conservarli durante un periodo di tempo più lungo dovranno essere congelati ad una temperatura uguale o inferiore a -20 C. I campioni possono essere congelati/scongelati al massimo 3 volte. Mescolare accuratamente dopo lo scongelamento. Verificare che i campioni non vi siano bolle e, in caso contrario, eliminarle completamente prima dell analisi. Plasma I campioni di plasma possono essere conservati tra 2 C e 8 C per 8 giorni. Per conservarli durante un periodo di tempo più lungo dovranno essere congelati ad una temperatura uguale o inferiore a -20 C. Scongelare il plasma a 37 C. Scongelare i campioni una volta sola. Mescolare accuratamente dopo lo scongelamento. Verificare che i campioni non vi siano bolle e, in caso contrario, eliminarle completamente prima dell analisi. Volume di campione Il volume di campione necessario per condurre un unica prova con BIO-FLASH anti-hbc varia in base al tipo di recipiente utilizzato. Utilizzando il recipiente per campione raccomandato (REF ), per un test saranno necessari almeno 100 µl più il volume morto, equivalente a 200 µl. Altri materiali I seguenti materiali non vengono forniti con la cartuccia reagenti e devono essere acquistati separatamente. REF REF BIO-FLASH anti-hbc Calibrators (Calibratori) BIO-FLASH anti-hbc Controls (Controlli) Se si desiderano ulteriori informazioni, leggere attentamente le relative istruzioni.
4 Non utilizzare altri calibratori. Le informazioni necessarie allo strumento BIO-FLASH per calibrare il test BIO-FLASH anti-hbc sono incluse nei codici a barre dei contenitori. L uso di controlli di altri fabbricanti può originare risultati imprevisti. Prima di processare campioni, calibratori o controlli, assicurarsi che nello strumento BIO-FLASH vi sia una quantità sufficiente dei seguenti consumabili: REF BIO-FLASH Cuvettes (Cuvette) Nota: Il disegno delle cuvette è protetto da brevetto (US D560,816 / Disegno CE ) REF BIO-FLASH Triggers (Attivatori) REF BIO-FLASH System Rinse (Soluzione del sistema) Strumento / conduzione del test Nella Guida per l Utente del BIO-FLASH si troveranno le istruzioni complete per condurre il test. Calibrazione Il codice a barre della cartuccia contiene una Curva di Calibrazione Memorizzata (CCM), valida per il lotto di reagenti. Tuttavia, per tutti i reagenti è necessaria una Curva di Calibrazione di Lavorazione (CCL), specifica per ciascun lotto e valida fino alla data di scadenza di quest ultimo. Quando i risultati dei controlli escono dal range di accettazione o quando sono state effettuate regolazioni sullo strumento, si deve ottenere una nuova CCL. Per configurare una CCL, leggere attentamente la Guida per l Utente del BIO-FLASH. Controllo di qualità Per effettuare un programma completo del controllo di qualità si raccomandano due livelli di controllo. I controlli BIO-FLASH anti-hbc negativo e positivo sono stati progettati per il suddetto programma. I controlli devono essere analizzati almeno ogni 24 ore per giorno di uso. Assicurarsi che i risultati dei controlli si trovino all interno del range di accettazione, perché in caso contrario si potranno avere risultati non validi e l utente dovrà adottare misure correttive. In questo caso esaminare tutti i risultati ottenuti dall ultima verifica positiva del controllo di qualità dell analita in questione. Può rendersi necessaria la ricalibrazione dello strumento. Nella Guida per l Utente dello strumento si troveranno ulteriori informazioni. Per l individuazione e la risoluzione di situazioni anomale relative al controllo di qualità consultare Westgard et al. 7 Conservazione e stabilità I reagenti non ancora aperti si mantengono stabili fino alla data di scadenza riportata sull etichetta della cartuccia se conservati ad una temperatura di 2-8 C in posizione verticale. Una volta aperta, la stabilità della cartuccia caricata nello strumento BIO-FLASH o conservata a 2-8 C è di 8 settimane. Tracciabilità dei calibratori e dei controlli I valori sono espressi in UA/mL e sono stati assegnati mediante svariati test con lo strumento BIO-FLASH, utilizzando lotti specifici di reagenti, e nel rispetto di standard interni riferibili allo standard anti-hbc IgG dell'istituto Paul Ehrlich (HBc Reference Material 82, IgG-anti-HBc). Interpretazione dei risultati La quantità di analita in ciascun campione si determina partendo dalla luce emessa (URL), mediante interpolazione nella Curva di Calibrazione di Lavorazione memorizzata. I risultati del BIO-FLASH anti-hbc sono espressi in UA/mL. Si tratta di un test qualitativo, in cui il valore numerico del risultato è solamente indicativo del numero di anticorpi presenti. La determinazione delle anti-hbc con il test BIO-FLASH anti-hbc è interpretato come segue: I campioni con un risultato < 0,90 UA/mL si considerano non reattivi (negativi). I campioni con un risultato 0,90 e < 1,00 UA/mL si considerano indeterminati (zona grigia). I campioni con un risultato 1,00 UA/mL si considerano reattivi (positivi). I campioni con risultato inizialmente reattivo o indeterminato devono essere rianalizzati in duplicato. Se entrambi i valori della ripetizione sono inferiori a 0,9 l interpretazione finale del test è negativa per gli anticorpi HBc. Se uno dei risultati della ripetizione del duplicato è positivo o indeterminato il campione deve essere ulteriormente analizzato con test supplementari e si devono considerare altri dati, come ad esempio la sintomatologia e l anamnesi clinica. Un risultato ripetutamente positivo indica un infezione da HBV. I campioni con una concentrazione superiore a 12,00 UA/mL sono riportati come > 12,00.
5 Limitazioni Il risultato di un unico campione non è sufficiente per diagnosticare un infezione primaria da HBV. Pertanto, oltre ai risultati del BIO-FLASH anti-hbc, si devono considerare altri dati, come ad esempio la sintomatologia, l anamnesi clinica, i risultati di altri test ed altre informazioni rilevanti. Un risultato negativo non esclude la possibilità di esposizione o infezione da HBV. Come in tutti i test immunologici sensibili, vi è la possibilità di ottenere risultati positivi non ripetibili. Risultati attesi L'anticorpo anti-hbc è il marcatore più comune di infezione da epatite B, perché si trova in infezione acuta, cronica o passata. La prevalenza di anti-hbc e di altri marcatori dell'epatite B varia notevolmente nel mondo, da alta (70-95%, Africa, Asia e Pacifico occidentale) a intermedia (20-55%, Sud ed Est Europa) e bassa (4-6%, Europa Occidentale, Nord America e parti del Sud America). 2 L'attuazione dei programmi di immunizzazione dovrebbe ridurre l'incidenza di infezione da HBV. Caratteristiche funzionali NOTA: i seguenti dati sono rappresentativi; i risultati dei singoli esperimenti possono variare rispetto a tali dati. Specificità La valutazione della specificità si basa sul test di campioni di siero da donatori di sangue non selezionati, inclusi coloro che donano per la prima volta, e da pazienti ospedalizzati. Stato sottoposto a test un totale di 5097 campioni non selezionati provenienti da due banche del sangue, 3536 dal EFS Centre Atlantique site de Tours (Francia) e 1561 dal EFS Centre Nord de France de Lille (Francia). I campioni Ripetutamente Reattivi sono stati ritestati ricorrendo ad un altro metodo commerciale. Quindi è stata calcolata la specificità, con i risultati illustrati nella seguente tabella. Campioni testati Inizialmente reattivi (IR) Ripetutamente reattivi (RR) RR risultanti indeterminati RR risultanti positivi Specificità n n n n n % Donatori di sangue ,9 Pazienti ospedalizzati Sensibilità Un pannello di campioni con positività verificata per gli anticorpi anti-hbc di varia origine è stato testato con il BIO-FLASH anti-hbc rispetto ai metodi commerciali EIA e CLIA disponibili per l'anti-hbc. Questo pannello incluso 28 campioni freschi del stesso giorno ( 1 giorno dopo la raccolta). I risultati di sensibilità sono riportati nella seguente tabella: Campioni Metodo di riferimento testati Reattivi Sensibilità n n % Metodo EIA Metodo CLIA Nel caso dei 403 campioni testati contro il metodo di EIA, due campioni sono stati nella zona grigia con BIO-FLASH e l'altra con il metodo di riferimento. Per questo motivo, questi campioni non sono stati considerati per il calcolo della sensibilità. Sensibilità alla sieroconversione Sono stati eseguiti ulteriori studi di sensibilità testando i campioni di tre pannelli commerciali di sieroconversione per l'epatite B. I risultati ottenuti con il BIO-FLASH anti-hbc sono stati coerenti con quelli di altri metodi commerciali per tutti i campioni. Precisione Si valutò, in conformità alle direttive CLSI EP05-A2, la precisione intra-test e totale (test per test e giorno per giorno) in svariati test. I risultati sono riepilogati nella seguente tabella:
6 Media (UA/mL) Intra-test Totale Controllo negativo 0,28 0,077 SD 0,094 SD Controllo positivo 2,12 4,3 % CV 5,8 % CV Intorno al valore di cut-off 1,09 5,0 % CV 7,3 % CV Riproducibilità Si valutò la riproducibilità tra duplicati, tra lotti e tra strumenti è stata valutata utilizzando 50 campioni. I risultati si mostrano nella seguente tabella: N Co-negatività Co-positività Duplicato 2 vs. Duplicato % 100% Lotto 2 vs. Lotto % 100% Strumento 2 vs. Strumento % 100% Interferenze Studi conformi alle direttive CLSI EP7-A2 hanno dimostrato che le seguenti sostanze potenzialmente interferenti non alterano i risultati del BIO-FLASH anti-hbc: Sostanza potenzialmente interferente Concentrazione % Interferenza Emoglobina 500 mg/dl 10 Bilirubina indiretta 18 mg/dl 10 Bilirubina diretta 18 mg/dl 10 Trigliceridi 1300 mg/dl 10 Fattore reumatoide 800 UI/mL 10 HAMA 1 µg/ml 10 Reattività crociata Sono stati analizzati con BIO-FLASH anti-hbc un totale di 111 campioni positivi per una serie di cross-reagenti e campioni di donne in stato interessante. Si suppone che un potenziale cross-reagente provochi una reattività crociata, quando la diagnosi passa da negativa a positiva o viceversa. I campioni reattivi sono stati comparati ad un test di riferimento per valutare la concordanza tra i test. I risultati sono riepilogati nella seguente tabella: Reattività crociata potenziale Concordanza ANA (anticorpi antinucleari) 5/5 anti-cmv (anticorpi contro il virus citomegalovirus) 6/6 anti-e. coli 12/12 anti-ebv (anticorpi contro il virus di Epstein-Barr) 4/4 anti-hav-igg (anticorpi contro il virus dell'epatite A) 6/6 anti-hav-igm (anticorpi contro il virus dell'epatite A) 5/5 anti-hdv IgG (anticorpi contro il virus dell'epatite D) 5/5 anti-hev (anticorpi contro il virus dell'epatite E) 4/4 anti-hiv (anticorpi contro il virus dell immunodeficienza umana) 7/7 anti-hsv (anticorpi contro il virus Herpes simplex) 5/5 anti-rubella 10/10 anti-toxoplasma 4/4 anti-vzv (anticorpi di contro il virus della Varicella-Zoster) 5/5 IgG elevate 5/5 IgM elevate 4/4 Mononucleosis 4/4 Donne in gravidanza 7/7 Donne in gravidanza (incluse multipare) 5/5 RF (fattore reumatoide) 5/5 RPR (Rapid Plasma Reagin) 3/3
7 Limite di rilevamento e sensibilità analitica In conformità alle direttive CLSI EP17-A, il limite di rilevamento (LR) si trova a 0,39 UA/mL. La sensibilità analitica ottenuta è stata di 0,74 PEI U/mL. È stata determinata per interpolazione del valore di taglio (cut-off) nella retta di regressione ottenuta testando diluizioni seriali del standard anti-hbc dell'istituto Paul Ehrlich (HBc Reference Material 82, IgG-anti-HBc). Secondo studi interni con BIO-FLASH anti-hbc, 1,00 PEI-U/mL è equivalente a circa 1,4 UI/mL del Primo standard internazionale WHO per l'anti-hbc (codice NIBSC 95/522). Effetto prozona Il test BIO-FLASH anti-hbc è d'inibizione a due step. Il protocollo di analisi comprende una fase di lavaggio dopo l'incubazione del campione, che elimina l'effetto prozona. Sperimentalmente, non è stato osservato alcun effetto prozona con un campione più alto da 160,00 UA/mL.
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