NOVA Lite HEp-2 External EB Kits Per uso diagnostico In Vitro Codice Prodotto: ,
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- Ugo Poli
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1 NOVA Lite HEp-2 External EB Kits Per uso diagnostico In Vitro Codice Prodotto: , Complessità CLIA: elevata Finalità d uso Questo prodotto (kit o substrato) è indicato per essere utilizzato per lo screening e la titolazione di anticorpi anti nucleo circolanti mediante un test di immunofluorescenza. Deve essere utilizzato come supporto nella diagnosi e nel trattamento del lupus eritematoso sistemico (LES), della Sindrome di Sjögren, dell artrite reumatoide e di altri patologie del tessuto connettivo. Riassunto e Spiegazione del test Anticorpo anti nucleo (ANA) è un termine che descrive una varietà di autoanticorpi diretti contro i costituenti dei nuclei cellulari comprendenti DNA, RNA e varie proteine nucleari 1. Questi ANA si riscontrano con un elevata frequenza nei pazienti con malattie reumatiche o del tessuto connettivo, in particolare il LES. Esiste un elevata correlazione tra il LES e la presenza di ANA, l assenza di ANA sostanzialmente esclude la patologia 2. Tuttavia, i pazienti affetti da patologie quali artrite reumatoide, scleroderma e dermatomiositi sono spesso ANA positivi e in altri stati patologici si osservano bassi titoli di ANA. Risultati positivi agli ANA sono stati inoltre riportati in pazienti anziani sani. Pur essendo l immunofluorescenza indiretta il metodo preferenziale per lo screening degli ANA circolanti, si raccomanda la titolazione dei campioni ANA positivi all end point insieme ad ulteriori indagini con test più specifici per gli autoanticorpi del DNA a doppio filamento (dsdna) e per gli antigeni nucleari estraibili (ENA). Le sezioni congelate di fegato di ratto storicamente erano il substrato più diffuso per l identificazione degli ANA, però queste sono state sostituite da vari tipi di linee cellulari. Le cellule HEp-2 3 costituiscono una linea cellulare epiteliale caratterizzata da nuclei estremamente grandi rispetto alle altre linee cellulari. Quando le cellule di HEp-2 sono utilizzate nello screening con ANA, i vantaggi sono molteplici: innanzitutto le cellule di HEp-2 sono un substrato di antigene standardizzato con minore variabilità da un lotto all altro rispetto al tessuto dei roditori; in secondo luogo, le cellule di HEp-2 sono più grandi e quindi consentono una visualizzazione più facile della morfologia cellulare con un conseguente aumento della sensibilità del test rispetto alle sezioni di fegato di ratto e infine molte cellule di HEp-2 si dividono attivamente, esponendo gli antigeni non normalmente espressi nelle cellule a riposo delle sezioni di fegato di ratto 3. Principio della Metodica Si utilizza una tecnica di immunofluorescenza indiretta 4 in cui i campioni del paziente e i controlli adeguati sono incubati con il substrato di HEp-2. Gli anticorpi che non reagiscono sono rimossi e poi viene applicato un coniugato adeguato marcato con fluoresceina. Il coniugato che non si lega viene rimosso come prima. I vetrini sono osservati con un microscopio a fluorescenza e i campioni positivi danno luogo alla fluorescenza di colore verde mela che corrisponde alle aree della cellula dell HEp-2 dove si è legato l autoanticorpo. Reagenti 1. Substrato di HEp-2 ANA vetrini a 6 o 12 pozzetti. 2. Siero di controllo positivo (pattern omogeneo/granuloso, intensità di colorazione 3+), contenente lo 0,09% di sodio azide. Preduilito, pronto all uso. 3. Siero di controllo positivo (pattern centromerico, intensità di colorazione 3+), contenente lo 0,09% di sodio azide. Preduilito, pronto all uso. 4. Siero di controllo negativo (universalmente negativo per tutti gli autoanticorpi), contenente lo 0,09% di sodio azide. Preduilito, pronto al uso. 5. FITC-IgG (H+L) coniugato con fluoresceina, contenente lo 0,09% di sodio azide. Preduilito, pronto all uso. 6. Blu di Evans all 1%. 7. Tampone PBS II, soluzione liquida concentrata 40 volte. 8. Mezzo di montaggio, contenente un agente anti-affievolimento 9. Vetrini coprioggetti. 1
2 Avvertenze/ Precauzioni Questo prodotto (kit) è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro Il prodotto deve essere utilizzato esclusivamente da personale adeguatamente formato. Si raccomanda di attenersi rigorosamente alla procedura indicata. Il siero di tutti i donatori umani fornito (solo kit) è stato testato ed è risultato negativo all antigene dell Epatite B e agli anticorpi del virus dell Epatite C e del HIV 1 e 2. Ciò nonostante, questi test non possono garantire l assenza di agenti infettivi. Devono essere stabiliti metodi di trattamento e di eliminazione adeguati come per tutti i materiali potenzialmente infettivi e soltanto personale esperto ed autorizzato deve eseguire le procedure. Alcuni dei componenti del kit contengono lo 0,09% di sodio azide come conservante e bisogna seguire certe precauzioni non ingerire né permettere il contatto con la pelle o le membrane mucose. In caso di contatto, lavare con molta acqua e rivolgersi al medico. Azotidrati metallici esplosivi si possono formare con il rame e il piombo. Lavare con molta acqua i recipienti che hanno contenuto questi reagenti allo scopo di evitare la formazione di azotidrato. Condizioni di conservazione Un kit o i vetrini non aperti devono essere conservati a 2-8 C e possono essere usati fino alla data di scadenza indicata. NON CONGELARE. Una volta estratti dal loro involucro, i vetrini devono essere usati immediatamente. Il tampone PBS II diluito può essere conservato fino ad un mese a 2-8 C. Il coniugato fluoresceinato deve essere conservato lontano dalla luce naturale, fluorescente o UV il più possibile. Tutti i reagenti devono essere conservati a 2-8 C. Raccolta dei campioni I prelievi di sangue devono essere effettuati per via venosa. Lasciare che il sangue si coaguli in modo naturale per separare il siero il più rapidamente possibile onde evitare l emolisi. Il siero può essere conservato a 2-8 C per un massimo di 7 giorni prima del dosaggio (rif. 11), oppure per periodi più lunghi, aliquotare e conservare a -20 C o temperature inferiori. NON congelare e decongelare più di una volta. Evitare l uso di sieri lipemici, emolizzati o contaminati da batteri in quanto si potrebbero avere titoli più bassi o pattern di colorazione non chiari. Procedura Materiali Forniti HEp-2 ANA Substrate Slide (6-well) (Vetrini x 6 pozzetti con cellule HEp-2) 1 1mL Homo. Ptn. (use w/conj or ) (homogeneous) (Controllo positivo Omog. Ptn. (da utili/ con Coniugato o ), prediluito) 1 1mL Centromere Positive Control (Controllo positivo centromerico, prediluito) 1 1mL IFA System Negative Control (Controllo negativo, prediluito) 1 7mL FITC IgG (H+L) HEp Conjugate (fluorescein) (Coniugato fluoresceinato FITC-IgG (H+L) HEp) 1 3mL 1% Evans Blue Counterstain (Blu di Evans al 1%) 2 25mL PBS II Concentrate (x40) (PBS II concentrato, x 40) 1 3mL PVA Mounting Medium (Mezzo di montaggio) 1 10 Coverslips (Vetrini coprioggetti) HEp-2 ANA Substrate Slide (12-well) (Vetrini x 12 pozzetti con cellule HEp-2 ANA) 1 1mL Homo. Ptn. (use w/conj or ) (homogeneous) (Controllo positivo Omog. Ptn. (da utili/con Coniugato o ),prediluito) 1 1mL Centromere Positive Control (Controllo positivo centromerico, prediluito) 1 1mL IFA System Negative Control (Controllo negativo, prediluito) 1 15mL FITC IgG (H+L) HEp Conjugate (fluorescein) (Coniugato fluoresceinato FITC-IgG (H+L) HEp) 1 3mL 1% Evans Blue Counterstain (Blu di Evans al 1%) 2 25mL PBS II concentrate (x40) (PBS II concentrato, x 40) 1 10mL PVA Mounting Medium (Mezzo di montaggio) 1 20 Coverslips (Vetrini coprioggetti) Materiali richiesti ma non forniti 1. Acqua distillata o deinoizzata per diluire il PBS II concentrato. 2. Recipiente per contenere il PBS II diluito e bottiglia in plastica a pressione per il lavaggio iniziale con PBS II. 3. Micropipette e puntali monouso per dispensare i campioni dei pazienti. 4. Camera umida per le fasi d incubazione 5. Microscopio a fluorescenza con filtro 495nm e filtro 515nm. Se sono forniti solo i vetrini, è può procurarsi da INOVA:: i controlli positivi p.e. Omog. Ptn. (da utili/ con Coniugato o ) (504090), centromerice (508184), il controllo negativo (508186), il coniugato anti-igg (H+L) umane purificato per affinità (504088, , prediluito pronto all uso, o , (diluire 1/50 1/200 al uso), PBS II (508998), Blu di Evans ( facoltativo), mezzo di montaggio (504046, ), vetrini coprioggetti. 2
3 Esecuzione del test Controllo di qualità I controlli negativi e positivi devono essere usati ogni volta che sono testati i campioni. 1. Mezzo di montaggio: Togliere il mezzo di montaggio dal frigorifero per portarlo a temperatura ambiente (18-28 C) con anticipo. 2. Diluire il PBS II concentrato. Diluire il PBS II con acqua distillata o deinoizzata (1 parte di PBS II + 39 parti di acqua distillata o deinoizzata) e mescolare. NB: Preparare tutto il PBS II soltanto se l intero kit deve essere utilizzato in un mese. Il PBS II si usa per diluire i campioni dei pazienti e come tampone di lavaggio. 3. Diluire i campioni dei pazienti. Screening: Diluire i campioni 1/40 aggiungendo 25µL di siero in 975µL di PBS II. Titolazione: Fare una serie di diluizioni del siero nel PBS II (p.e. 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 e 1/640 ecc.). Per esempio: Prendere 500µL della diluizione del campione 1/40, diluire con 500µL di PBS II per ottenere una diluizione 1/80. Ripetere questa procedura per raddoppiare ulteriormente le diluizioni. 4. Vetrini con substrato. I vetrini devono essere portati a temperatura ambiente (18-28 C) circa 30 minuti prima di essere tolti dalla confezione. Etichettare correttamente i vetrini, metterli nella camera umida e aggiungere una goccia di ciascuno dei due controlli positivi e di un controllo negativo rispettivamente nei pozzetti 1, 2 e 3. Aggiungere 25µL di campioni diluiti nei pozzetti rimanenti. 5. Incubazione vetrini. Incubare i vetrini per 30 minuti in una camera umida a temperatura ambiente (18-28 C). (Dei fazzoletti di carta inumiditi sul fondo della camera manterranno l umidità.) 6. Lavaggio PBS II. Togliere i vetrini dalla camera umida e risciacquarli con cura con il PBS II in una bottiglia di plastica a pressione. Sistemare i vetrini in una vaschetta di Coplin di PBS II diluito o in un rack immerso in PBS II per un massimo di 5 minuti. 7. Aggiunta di coniugato fluorescente. Riportare i vetrini nella camera umida e coprire immediatamente ogni pozzetto con una goccia di coniugato fluorescente. NON LASCIARE I POZZETTI SCOPERTI PER OLTRE 15 SECONDI. L ESSICATURA DEL SUBSTRATO COMPROMETTE SERIAMENTE I RISULTATI. 8. Incubazione vetrini. Incubare i vetrini per 30 minuti in una camera umida a temperatura ambiente (18-28 C) al buio. 9. Lavaggio PBS II. Lavare nuovamente come descritto nella fase.6. Colorazione di contrasto opzionale. Aggiungere 2-3 gocce di Blu di Evans al 1% per 100mL di PBS II prima di immergere i vetrini. 10. Montaggio con il vetrino coprioggetti. Rimuovere un vetrino alla volta dal lavaggio PBS II. Asciugare rapidamente intorno ai pozzetti e aggiungere una goccia di mezzo di montaggio in ciascun pozzetto. Abbassare con cura il vetrino sul vetrino coprioggetti, evitando le bolle d aria, ma se ci sono non tentare di rimuoverle. 11. Lettura dei vetrini con il microscopio a fluorescenza. I vetrini finiti devono essere letti il più presto possibile ma possono essere conservati a 2-8 C nell oscurità fino a 1 settimana, senza una grossa perdita di fluorescenza. Controllo di qualità Il controllo positivo omogeneo del kit deve dare un pattern di colorazione omogeneo di colore verde mela brillante nei nuclei delle cellule (3+). Il controllo positivo centromerico del kit deve dare un pattern granuloso discreto (3+) di solito in multipli di 46). Il controllo negativo del kit deve avere una colorazione verde scuro in tutte le cellule HEp-2, senza fluorescenza visibile. Se i controlli non risultano come sopra descritto, il test non è valido e deve essere ripetuto. NB: Se si usa il Blu di Evans come colorazione di contrasto, un campione negativo avrà un aspetto arancione scuro. Nel campione positivo, invece, i nuclei si coloreranno di verde e le regioni non colorate della cellula avranno un colore rosso scuro. Interpretazione dei risultati Negativo Un campione è considerato negativo se la colorazione specifica del nucleo è equivalente o inferiore a quella del pozzetto di controllo negativo. 3
4 Positivo Un campione è positivo se la colorazione del nucleo è superiore a quella del controllo negativo e l aspetto è chiaramente visibile sulla maggior parte delle cellule HEp-2. Di solito, i controlli del kit hanno un intensità 3+. La tabella qui di seguito riassume una varietà di pattern di colorazione del nucleo che è possibile osservare in base ai tipi e alle relative quantità di anticorpi presenti nel campione: PATTERN ASPETTO ANTIGENTI COINVOLTI Omogeneo Granuloso Forte colorazione del nucleo (Scl- 70 può presentare un aspetto maculato) Macchie fini o granulari (grosse), di solito senza colorazione del nucleo DNA doppio filamento DNA monofilamento Istoni Scl-70 SS-A SS-B Sm RNP + altri PRINCIPALI MALATTIE ASSOCIATE Titoli elevati: LES Titoli bassi: LES o altre patologie del tessuto connettivo 5 Titoli elevati: Sindrome di Sjögren complexo sicca LES Patologie miste del tessuto connettivo Scleroderma Titoli bassi: altre patologie del tessuto connettivo PATTERN ASPETTO ANTIGENTI COINVOLTI Nucleolare Centromero Mitocondriale Jo-1 Macchie grosse larghe (di solito meno di 6 macchie per nucleo, con o senza macchie fini) Macchie di medie dimensioni (di solito un multiplo di 46) Pattern granuloso citoplasmatico filamentoso granulare grosso che si estende intorno al nucleo e nel citoplasma Colorazione a macchie sottili concentrate intorno al nucleo Pm-Scl Nucleoli Ku e altri antigeni nucleari sconosciuti Centromerico Cromosomico M2 9,10 Jo-1 (Istidil-tRNA sintetasi) PRINCIPALI MALATTIE ASSOCIATE Titoli elevati: Scleroderma & sindrome di Sjögren 6 Sindrome di CREST 7 Cirrosi biliare primaria Scleroderma (40%) e a volte sindromi sovrapposte Polimiositi, dermatomiositi associate con malattia polmonare interstiziale Limitazioni del test 1. Titoli elevati di ANA sono generalmente associati a malattie del tessuto connettivo ma l anamnesi del paziente e altri risultati sierologici devono essere presi in considerazione prima di fare la diagnosi. 2. Una piccola percentuale di pazienti con LES possono essere ANA negativi con l immunofluorescenza indiretta ma possono risultare ANA positivi con altri metodi I pazienti con LES indotto da farmaco possono presentare una positività omogenea o periferica. Al contrario, i pazienti sottoposti a terapia steroidea possono risultare ANA negativi con altri metodi In un campione può essere presente più di anticorpo. Diluendo il siero, i vari pattern si possono vedere meglio. Allo stesso modo, con titoli molto elevati, si può avere un effetto che maschera la reale positività. Tutti i campioni sospetti o con titoli apparentemente bassi devono essere diluiti ulteriormente. 5. La fonte luminosa, i filtri e l ottica dei microscopi a fluorescenza di diverse marche influiranno sulla sensibilità del test. La performance del microscopio è influenzata notevolmente da una corretta manutenzione, e in particolare dalla centratura e dalla sostituzione della lampada a vapori metallici dopo il periodo di tempo consigliato. 6. Un basso livello di anticorpi ANA può essere rilevato in pazienti che presentano condizioni cliniche differenti dalle malattie reumatiche e del tessuto connettivo. Negli individui normali l incidenza dei risultati positivi per gli anticorpi ANA cresce con l aumentare dell età. 7. Quando s interpretano i pattern di colorazione, deve essere considerata la presenza eventuale di più di una specificità di anticorpi. Combinazioni di anticorpi possono presentare pattern omogenei o granulosi. Si consigliano dei test specifici per il DNA monofilamento e per gli ENA da eseguire su tutti i campioni omogenei. 4
5 8. Sebbene venga generalmente utilizzata per lo screening una diluzione del siero del paziente di 1/40, in alcuni casi è possibile riscontrare un basso livello di colorazione aspecifica dei nuclei in presenza di alcuni campioni a bassa diluzione. 9. Il test ANA costituisce soltanto un aiuto alla formulazione della diagnosi e non costituisce un test diagnostico da solo. I risultati del test devono essere interpretati quale parte di un quadro clinico completo. I vetrini venduti separatamente vengono classificati come Reagenti analita-specifici. Ad eccezione di un componente del kit, le caratteristiche analitiche e prestazionali non sono stabilite. Prestazioni Precisione La procedura di controllo qualità per ciascun lotto prevede il test di vetrini multipli con un controllo a concentrazione nota diluito fino alla diluizione limite. Ciascun lotto possiede un controllo a titolo finale predefinito. Questo dimostra che non esistono differenze significative nelle prestazioni di vetrini appartenenti allo stesso lotto o a lotti diversi. Sensibilità La sensibilità dei test e il limite d identificazione dipendono dal microscopio utilizzato. Non esiste nessun dispositivo di calibrazione internazionale per standardizzare questi parametri. Specificità Un pannello di oltre 50 campioni clinici di diversa caratterizzazione, compresi almeno 10 campioni negativi, è stato testato con il kit HEp-2 di The Binding Site e con un equivalente kit HEp-2 disponibile in commercio. Le prestazioni del kit HEp-2 di The Binding Site sono risultate paragonabili, in termini di specificità ed intensità, a quelle del kit equivalente. Resumen del procedimiento 1. Portare il mezzo di montaggio a temperatura ambiente. 2. Diluire il PBS II 1/40 con acqua distillata o deinoizzata. 3. Diluire i sieri 1/40 con PBS II. 4. Togliere i vetrini dal frigorifero e portarli a temperatura ambiente (18-28 C). 5. Togliere il vetrino dalla confezione e metterlo in una camera umida. Aggiungere 25µL di controlli e di sieri diluiti. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (18-28 C). 6. Risciacquare i vetrini con un getto di PBS II e lavarli per 5 minuti in un rack o vaschette coplin. 7. Riportare il vetrino nella camera umida e aggiungere immediatamente una goccia di coniugato fluorescente. 8. Incubare i vetrini per 30 minuti. 9. Lavare ancora come descritto nella fase Aggiungere il mezzo di montaggio in ciascun pozzetto e il vetrino coprioggetti. 11. Leggere i vetrini con il microscopio a fluorescenza. 5
6 Bibliografia 1. Tan, E.M. (1982): Autoantibodies to nuclear antigens: Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology. 33: Tan, E.M. et al (1982): The 1982 revised criteria for classification of systemic lupus erythematosus. Arth and rheum. 25: Miyachi, K., Fritzler, M.J., Tan, E.M. (1978): Autoantibody to nuclear antigen in proliferating cells. J. Immunol. 121: Weller, T.H., Coons, A.H. (1954): Fluorescent antibody studies with agent of Varicella and Herpes Zoster propagated in vitro: Prov. Soc. Exp. Biol. Med. 86: Notman, D.D., Kurata, N., Tan, E.M. (1975): Profiles of antinuclear antibodies in systemic rheumatic diseases. Ann. Int. Med. 83: Ritchie, R.F. (1970): Antinuclear antibodies. Their frequency and diagnostic application. N. Enr. J. Med. 282: Tan, E.M., Rodman, G.P., Garcia, I. (1980) et al: Diversity of antinuclear antibodies in progressive systemic sclerosis. Arthritis Rheum. 23: Gladman, D.D., Chalmers, A., Urowitz, M.B. (1978): Systemic lupus erythematosus with negative LE cells and anitnuclear factors. J. Rheum.: MacKay, I.R., Gershwin, M.E. (1989): Molecular basis of mitochondrial autoreactivity in primary biliary cirrhosis. Immunol.Today: 10: 9: Laung, P.S.C., MacKay, I., Gershwin, M.E. (1994): Mitochondrial autoantigens. Man Biol. Mark; B8.1,1-14. Eds W.J.Van Venrooij and R.N. Maini. Kluwer Academic Pubs. Netherlands. 11. Protein Refence Unit Handbook of Autoimmunity (3 rd Edition) Ed A Milford Ward. J Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14. Fornitore: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Rappresentante Autorizzato: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: ITA Rev. 5 January 2014 NOVA Lite e INOVA Diagnostics, Inc. sono marchi registrati. Copyright 2013 Tutti i diritti riservati. 6
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