NOVA Lite ANCA Kits/Substrate Slides Per uso diagnostico In Vitro

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1 NOVA Lite ANCA Kits/Substrate Slides Per uso diagnostico In Vitro Codice Prodotto: , , , , Complessità CLIA: elevata Finalità d uso Questo prodotto (kit o vetrini con substrato) è utilizzato per lo screening e la titolazione di anticorpi antineutrofili citoplasmatici circolanti (ANCA). Questi anticorpi sono marker per la diagnosi e la terapia della granulomatosi di Wegener e altre vasculiti sistemiche. 1 Riassunto e Spiegazione del test Le vasculiti necrotizzanti, compresa la granulomatosi di Wegener, la poliarterite nodosa, la sindrome di Churg Strauss, la glomerulonefrite idiopatica e la vasculite sistemica associata sono un gruppo di patologie correlate che presentano molte manifestazioni cliniche e quindi causano dei problemi diagnostici. La granulomatosi di Wegener è una grave patologia vascolare caratterizzata da granulomi necrotizzanti del tratto respiratorio e da glomerulonefrite focale. Una diagnosi precoce è fondamentale poiché una terapia immunosoppressiva rapida ha un effetto importante sul rene nel futuro però i sintomi iniziali al momento della manifestazione della patologia e l esame istologico con biopsia sono frequentemente non specifici. 2 Nel 1982 Davies et al hanno descritto la presenza di anticorpi antineutrofili citoplasmatici (ANCA) nel siero di pazienti affetti di glomerulonefrite necrotizzante. 3 Ne è seguita nel 1985 una pubblicazione di van de Woude et al i quali avevano riscontrato che 25 dei 27 pazienti affetti da granulomatosi di Wegener attiva mostravano un aspetto di colorazione classico nel citoplasma (c-anca) all immunofluorescenza indiretta. 1 L aspetto classico dei c-anca su neutrofili fissati con etanolo indica una colorazione granulare tipica del citoplasma con una colorazione minima dei lobi nucleari. Il principale antigene target c-anca è la proteinasi 3, una serina proteasi. Un secondo aspetto della colorazione ANCA (perinucleare, p-anca) è stato descritto nel 1988 da Falk et al nei reni di pazienti affetti da vasculite sistemica. 4 Il principale antigene target p-anca sembrava essere la mieloperossidasi, anche se vi sono associati diversi altri antigeni (p.e. lattoferrina, elastasi, catepsina G) in minor misura. L aspetto p-anca sui neutrofili fissati con l etanolo presenta una colorazione nettamente delineata intorno al nucleo. Molti campioni sottoposti ai testi ANCA saranno anche positivi per gli anticorpi anti DNA doppio filamento, anti istone e altri autoanticorpi nucleari (ANA) che possono imitare l aspetto della colorazione dei p-anca. I campioni dei pazienti ANA positivi possono anche essere positivi per p-anca. Evidentemente è d importanza fondamentale distinguere gli aspetti della colorazione dei veri c-a N C A e p -ANCA da altri artefatti non-anca. Per farlo, si usa una combinazione di vetrini di neutrofili fissati con etanolo e fissati con formalina. La fissazione con etanolo dei neutrofili causa la migrazione delle proteine citoplasmatiche granulari caricate positivamente verso il DNA caricato negativamente del nucleo, con una conseguente colorazione perinucleare (p-anca). 5 Se i neutrofili sono trattati con un fissatore come la formalina, in tal caso si impedisce la migrazione di cui sopra e le proteine citoplasmatiche granulari rimangono nel citoplasma e i veri campioni p-anca presenteranno un aspetto di colorazione canca citoplasmatica granulare sui vetrini fissati con formalina. I campioni ANA positivi, quando saranno testati sui neutrofili fissati con formalina, diventeranno negativi o presenteranno un intensità di colorazione fortemente ridotta. I campioni ANA specifici dei granulociti (GS-ANA) che producono una reazione nucleare o perinucleare sui neutrofili fissati con etanolo diventeranno negativi quando saranno testati sui neutrofili fissati con formalina. L immunofluorescenza indiretta su vetrini di neutrofili è il metodo preferenziale per lo screening degli ANCA. I vetrini INOVA usano neutrofili umani purificati, preparati e fissati in maniera tale da ottenere pattern di colorazione ottimale. Si raccomanda di titolare i campioni che danno degli aspetti di colorazione ANCA positivi, ANA e atipici. Principio della Metodica Il kit usa una tecnica di immunofluorescenza indiretta. 6 I campioni dei pazienti e i controlli adeguati sono incubati con il substrato di neutrofili. Gli anticorpi non specifici sono eliminati con il lavaggio, quindi viene applicato un marker fluorescente appropriato. Il coniugato non legato viene eliminato come prima con il lavaggio. Per la lettura dei vetrini si usa un microscopio a fluorescenza. I campioni positivi producono una fluorescenza nelle zone del neutrofilo dove l anticorpo si è legato. Reagenti 1. Vetrini per substrato con neutrofili fissati con formalina e etanolo (6 o 12 pozzetti). 1

2 Solo kit 2. Due o più sieri di controllo positivi contenenti lo 0,09% di sodio azide (p.e. p-anca, c-anca, ANA). Prediluito pronto per l uso. 3. Siero di controllo negativo contenente lo 0,09% di sodio azide. Prediluito pronto per l uso. 4. Antisiero di capra anti IgG umane, purificato per affinità coniugato di fluoresceina con Blu di Evans contenente lo 0,09% di sodio azide. Prediluito pronto per l uso. 5. Blu di Evans al 1%, facoltativo 6. Tampone PBS II (x40) 7. Mezzo di montaggio, contenente un agente anti-affevolimento 8. Vetrini coprioggetti Avvertenze/Precauzioni Questo prodotto è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. ll prodotto deve essere utilizzato esclusivamente da personale adeguatamente formato. Si raccomanda di attenersi rigorosamente alla procedura indicata. Il siero di tutti i donatori umani fornito (solo kit) è stato testato ed èisultato negativo all antigene dell Epatite B, agli anticorpi del virus dell Epatite C e del HIV 1 e 2. Ciò nonostante, questi test non possono garantire l assenza di agenti infettivi. Devono essere stabiliti metodi di trattamento e di eliminazione adeguati come per tutti i materiali potenzialmente infetti e soltanto del personale esperto ed autorizzato deve eseguire le procedure. Alcuni dei componenti del kit contengono lo 0.09% di sodio azide come conservante e bisogna seguire certe precauzioni non ingerire né permettere il contatto con la pelle o le membrane mucose. In caso di contatto, lavare con molta acqua e rivolgersi al medico. Azotidrati metallici esplosivi si possono formare con il rame e il piombo. Lavare con molta acqua i recipienti che hanno contenuto questi reagenti allo scopo di evitare l accumulo di azide. Condizioni di conservazione I kits o i vetrini non aperti devono essere conservati a 2-8 C e possono essere usati fino alla data di scadenza indicata. NON CONGELARE. Una volta estratti dal loro involucro, i vetrini devono essere usati immediatamente. Il tampone PBS II diluito può essere conservato fino ad un mese a 2-8 C. Il coniugato di fluoresceina deve essere conservato lontano dalla luce naturale, fluorescente o UV il più possible e conservato a 2-8 C. Tutti i reagenti devono essere conservati a 2-8 C. Raccolta dei campioni I prelievi di sangue devono essere effettuati per via venosa. Lasciare che il sangue si coaguli in modo naturale per separare il siero il più rapidamente possibile onde evitare l emolisi. Separare il siero il più rapidamente possibile onde evitare l emolisi. Il siero può essere conservato a 2-8 C per un massimo di 7 giorni prima del dosaggio 10, oppure per periodi più lunghi, aliquotare e conservare a -20 C o temperature inferiori. Evitare di congelare e scongelare più di una volta. Evitare l uso di sieri lipemici, emolizzati o contaminati da batteri in quanto si potrebbero avere titoli più bassi o pattern di colorazione non chiari. Procedura Materiali forniti (kits) Neutrophil Slide 6-well (Vetrini con neutrofili fissati in formalina x 6 pozzetti) 1 1mL panca Positive Control (Controllo positivo panca, prediluito) 1 1mL ANA Positive Control (Controllo positivo ANA, prediluito) 1 1mL IFA System Negative Control (Controllo negativo, prediluito) 1 7mL anti Human IgG AFF Fluorescein with Evans Blue (Coniugato di fluoresceina anti-igg umane purificato per affinità con Blu di Evans) 2 25mL PBS II concentrate (x40) (Liquido concentrato, x 40) 1 3mL 1% Evans Blue Counterstain (Blu di Evans al 1%) 1 3mL Mounting Medium (Mezzo di montaggio) 1 10 Coverslips (Vetrini coprioggett) Neutrophil Slide 12-well (Vetrini con neutrofili fissati in formalina x 12 pozzetti). 1 1mL panca Positive Control (Controllo positivo panca, prediluito) 1 1mL canca Positive Control (Controllo positivo canca, prediluito) 1 1mL ANA Positive Control (Controllo positivo ANA, prediluito) 1 1mL IFA System Negative Control (Controllo negativo, prediluito) 1 15mL anti Human IgGAFF Fluorescein with Evans Blue (Coniugato di fluoresceina anti-igg umane purificato per affinità con Blu di Evans) 2 25mL PBS II concentrate (x40) (Liquido concentrato, x 40) 1 3mL 1% Evans Blue Counterstain (Blu di Evans al 1%) 1 10mL Mounting Medium (Mezzo di montaggio) 1 20 x Coverslips (Vetrini coprioggett) Materiali forniti (vetrini) x ANCA Neutrophil Substrate Slide 6-well (fissati in formalina) x ANCA Neutrophil Substrate Slide 12-well (fissati in formalina) 2

3 Materiali richiesti ma non forniti 1. Acqua distillata per diluire il PBS II concentrato 2. Recipiente per contenere il PBS II. 3. Micropipette e puntali monouso per applicare i campioni dei pazienti. 4. Camera umida per le fasi d incubazione 5. Microscopio a fluorescenza con filtro 495nm e filtro 515nm. 6. Bottiglia di plastica a pressione per lavaggio iniziale nel PBS II. Se si usano soltanto i vetrini, saranno necessari anche i seguenti materiali (Parte i numeri INOVA forniti ove applicabili): controllo positivo, p.e. c-anca (508191), p-anca (508291), controllo negativo (508007), coniugato FITC anti-igg umane AFF FITC (508113) o anti-iggam umane AFF FITC (504031), PBS II (508998), Blu di Evans (504049, optional), mezzo di montaggio (508001, , ), vetrini coprioggetti. Procedura Controllo di qualità I controlli negativi e positivi devono essere usati ogni volta che è testato un lotto di campioni. 1. Diluire il PBS II concentrato. Diluire il PBS II con acqua distillata (1 parte di PBS II + 39 parti di acqua distillata) e mescolare. Il PBS II si usa per diluire i campioni dei pazienti e come tampone di lavaggio. NB: Preparare tutto il tampone soltanto se l intero kit deve essere utilizzato in un mese. 2. Diluire i campioni dei pazienti. Screening: Diluire i campioni dei pazienti 1/20 aggiungendo 10µL di siero in 190µL di PBS II. Titolazione: Fare una serie di diluizioni dei campioni risultati positivi allo screening con il PBS II (p.e. 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 e 1/640 ecc.) Per esempio: Prendere 100µL della diluizione del campione 1/20, diluire con 100µL di PBS II per ottenere una diluizione 1/40. Ripetere questa procedura per ulteriori diluizioni. 3. Vetrini di reazione: Portare i vetrini a temperatura ambiente (18-28 C) per circa 30 minuti prima di estrarli dall'involucro.contrassegnare in maniera appropriata i vetrini,aggiungere una goccia di siero di controllo positivo e una goccia di siero di controllo negativo del kit in esame negli appositi pozzetti. Aggiungere 25µL dei campioni diluiti nei restanti pozzetti. 4. Incubazione vetrini. Incubare i vetrini per 30 minuti in una camera umida a temperatura ambiente (18-28 C). 5. Lavaggio PBS II. Togliere i vetrini dalla camera umida e risciacquarli con cura con il PBS II con una bottiglia di plastica a pressione. Non spruzzare direttamente nei pozzetti. Posizionare i vetrini in un rack e immergerli nel PBS II, in agitazione per 10 minuti. 6. Aggiunta di coniugato fluorescente. Eliminare l eccesso di PBS II. Riportare i vetrini nella camera umida e coprire immediatamente ogni pozzetto con una goccia di coniugato fluorescente. NON LASCIARE I POZZETTI SCOPERTI PER OLTRE 15 SECONDI. L essicatura del substrato compromette seriamente i risultati. 7. Incubazione vetrini. Incubare i vetrini per 30 minuti in una camera umida a temperatura ambiente (18-28 C) al buio. 8. Lavaggio PBS II. Lavare nuovamente come descritto nella fase 5. Colorazione di contrasto opzionale: Aggiungere 2-3 gocce di Blu di Evans al 1% per 100mL di PBS II prima di immergere i vetrini. 9. Montaggio con il vetrino coprioggetti. Rimuovere un vetrino alla volta dal lavaggio PBS II. Asciugare rapidamente intorno ai pozzetti e aggiungere una goccia di mezzo di montaggio in ciascun pozzetto. Posizionare con cura il vetrino coprioggetto sul vetrino, evitando le bolle d aria, ma se ci sono non tentare di rimuoverle. 10. Lettura dei vetrini con il microscopio a fluorescenza. I vetrini preparati devono essere conservati a 2-8 C e preferibilmente letti il prima possibile. Controllo di qualità Sui neutrofili fissati con formalina, i campioni c-anca e p-anca devono presentare una colorazione granulosa citoplasmatica. Su neutrofili fissati con formalina non deve aversi nessuna positività agli ANA. Il controllo negativo non deve presentare nessuna fluorescenza visibile. Se i controlli non risultano come sopra descritto, il test non è valido e deve essere ripetuto. Interpretazione dei risultati Risultato negativo Un campione è considerato negativo se la colorazione specifica dei neutrofili è equivalente o inferiore a quella del pozzetto di controllo negativo. Risultato positivo Un campione è considerato positivo quando si osserva una colorazione citoplasmatica. N.B: Ogni laboratorio deve stabilire a che punto un risultato positivo è considerato clinicamente significativo. Intepretazione dell aspetto Aspetto c-anca (colorazione citoplasmatica) Sui vetrini fissati con formalina, i campioni c-anca positivi presenteranno una colorazione granulare generalizzata del citoplasma. 3

4 Aspetto p-anca (colorazione perinucleare) p-anca campioni presenteranno una colorazione granulare generalizzata del citoplasma, indistinguibile da quella ottenuta con i campioni c-anca positivi. Aspetto ANA Sui vetrini fissati con formalina, la maggior parte degli antigenti nucleari è stata distrutta, di conseguenza i campioni ANA positivi presenteranno una fluorescenza negativa o notevolmente ridotta rispetto al controllo positivo p-anca. Limitazioni del test 1. I campioni inattivati dal calore, emolizzati o defibrinati in modo incompleto possono causare un elevata colorazione del fondo e rendere difficile l interpretazione. E necessario ottenere dei campioni freschi e ripetere il test. I campioni problematici possono essere diluiti con il PBS II contenente siero bovino o albumina al 2%, allo scopo di ridurre la colorazione del fondo. 2. La fonte luminosa, i filtri e l ottica dei microscopi a fluorescenza di diverse marche influiranno sulla sensibilità del test. La performance del microscopio è influenzata notevolmente da una corretta manutenzione, e in particolare dalla centratura e dalla sostituzione della lampada ai vapori metallici dopo il periodo di tempo consigliato. 3. I risultati positivi IFA debbono essere confermati con i dosaggi immunoenzimatici (EIA) mieloperossidasi (MPO) e proteinasi 3 (PR3). 11,12 La formalina fissata sui vetrini di reazioni dell ANCA può anche contribuire alla determinazione degli autoanticorpi specifici, specialmente per i campioni con titoli moderati ed alti. 4. I campioni ANCA positivi possono non sempre risultare positivi alla mieloperossidasi (MPO) o alla serina proteinasi 3 (PR3) usando gli AIE, poiché altri antigeni primari possono essere responsabili dell aspetto di colorazione classico p- o c -ANCA positivo. Questi comprendono elastasi, lattoferrina, catepsina G, proteina cationica 57 e altri antigeni neutrofili ancora non identificati. 5. Gli anticorpi anti-muscolatura liscia (actina) possono reagire con i neutrofili umani fissati con etanolo come pure con gli alloanticorpi quali mart o NB1. 7 Gli anticorpi anti-actina o anti-muscolatura liscia reagiscono con il citoplasma dei neutrofili dando un aspetto della colorazione c-anca omogeneo piuttosto che tipicamente granuloso. Anche gli alloanticorpi reagiscono con il citoplasma dei neutrofili dando un aspetto di colorazione granuloso fine. Di solito, risulteranno fluorescenti soltanto il 40% delle cellule o meno. 6. I campioni possono contenere più di un anticorpo, p.e. c-anca e p-anca o c-anca e ANA. 7. Gli anticorpi dei neutrofili possono anche essere presenti nel siero dei pazienti con malattie intestinali infiammatorie o con colite ulcerosa. 8 Sui vetrini dei neutrofili fissati con etanolo, questi campioni si presentano con un aspetto p-anca con una colorazione perinucleare molto accentuata. Sui vetrini dei neutrofili fissati con formalina questi campioni risultano negativi oppure presentano una fluorescenza notevolmente ridotta. 8. Il test non costituisce un diagnostico di per sé. E necessario prendere in considerazione tutti gli altri fattori compresa l anamnesi clinica dei pazienti e altri risultati sierologici o della biopsia. I vetrini venduti separatamente vengono classificati come Reagenti analita-specifici. Ad eccezione di un componente del kit NOVA Lite ANCA IFA Kit, le caratteristiche analitiche e prestazionali non sono stabilite. Valori attesi e prestazioni Risultati attesi % Positivi Gruppo pazienti No. p-anca c-anca Persone sane Morbo di Crohn Colite ulcerosa Colangite sclerosante primitiva con malattie intestinali infiammatorie Cirrosi biliare primitiva Epatite autoimmune Granulomatosi di Wegener Poliarterite nodosa * Tutte le informazioni sopra indicate sono state riportate da Seibold et al (rif. 9), salvo quella contrassegnata da *, risultato di studi condotti presso la Binding Site Ltd. Precisione I sieri di dieci pazienti (tre p-anca-positivi, tre c-anca-positivi, due ANA-positivi e due negativi) sono stati testati nove volte (tre volte su tre lotti di kit separati). L aspetto della colorazione per ogni campione differiva di non oltre un unità di colorazione (sulla base di una scala da 1+ (colorazione debole) fino a 3+ (colorazione forte). 4

5 Studio comparativo 100 campioni clinici e 40 sieri di donatori adulti sani (20 maschi, 20 femmine) sono stati testati con il Combi Kit ANCA di Binding Site e il kit con vetrini di un concorrente. I risultati sono i seguenti: C o n c o r r e n t e THE BINDING SITE c-anca p-anca AN A Neg. p-/c-anca c-anca p-anca p-/c-anca AN A Neg su 140 campioni testati hanno dato risultati identici con i due metodi. Per l aspetto c-anca, la sensibilità relativa è stata del 95%, la specificità relativa del 96% e l accordo relativo del 96%. Per l aspetto p-anca, la sensibilità relativa è stata del 90%, la specificità relativa del 97% e l accordo relativo del 96%. Per i sei campioni che presentavano aspetti diversi, risultava una colorazione molto forte o molto debole su uno o entrambi i kits, cosa che può rendere difficile l interpretazione. Sintesi della precedura 1. Diluire il PBS II con acqua distillata. 2. Diluire i sieri 1/20 con PBS II. 3. Togliere i vetrini dal frigorifero e portarli a temperatura ambiente (18-28 C). 4. Togliere il vetrino dalla confezione e metterlo in una camera umida. Aggiungere 25µL di controlli e di sieri dei pazienti. 5. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (18-28 C). 6. Risciacquare i vetrini con un getto di PBS II. 7. Lavarli per 10 minuti in un rack. 8. Riportare il vetrino nella camera umida e aggiungere immediatamente una goccia di coniugato fluorescente. 9. Incubare i vetrini per 30 minuti. 10. Lavare un altra volta come descritto nella fase Aggiungere i mezzi di montaggio in ciascun pozzetto e il vetrino coprioggetti. 12. Leggere i vetrini con il microscopio a fluorescenza. NOVA Lite è un marchio registrato di INOVA Diagnostics, Inc. Copyright 2012 Tutti i diritti riservati 5

6 Bibliografia 1. Van der Woude F.J. et al (1985) Autoantibodies against neutrophils and monocytes: Tool for diagnosis and marker of disease activity in Wegener s granulomatosis. Lancet I, Goeken J. A. (1991) Antineutrophil cytoplasmic antibody a useful serological marker for vasculitis, J. Clin. Immunol. 11, Davies D. J. et al (1982) Segmental necrotizing glomerulonephritis with antineutrophil antibody: possible arbovirus aetiology? Br. Med. J. 285, Falk R. J. and Jenette J. C. (1988) Antineutrophil cytoplasmic auto antibodies with specificity for myeloperoxidase in patients with systemic vasculitis and idiopathic neutotizing and crescentic glomerlonephritis N. Engl. J. Med. 318, Charles L. A., Falk R. J. and Jenette J. C. (1989) Reactivity of antineutrophil cytoplasmic autoantibodies with HL-60 cells. Clin. Immunol. Immunpathol. 53, Weller T. H. and Coons A. H. (1954) Fluorescent antibody studies with agent of Varicella and Herpes Zoster propagated in vitro: Proc. Soc. Exp. Biol. Med 86, Stroncek D. F. et al (1993) Neutrophil alloantibodies react with cytoplasmic antigens: a possible cause of false positive indirect immunofluorescence assays for antibodies to neutrophil cytoplasmic antigens. Am. J. Kidney Dis. 21, Hardarson S. et al (1992) Antineutrophil cytoplasmic antibody in inflammatory bowel and hepatobiliary diseases. Clinical Microbiology and Immunology 99, No Seibold, F. et al (1992) Clinical significance of antibodies against neutrophils in patients with inflammatory bowel disease and primary sclerosing cholangitis. Gut 33, Protein Refence Unit Handbook of Autoimmunity (3 rd Edition) Ed A Milford Ward. J Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield Savige J, Gillis D, Benson E, Davies D, Esnault V, Falk RJ, Hagen EC, Jayne D, Jennette JC, Paspaliaris B, Pollock W, Pusey C, Savage CO, Silvestrini R, van der Woude F, Wieslander J, Wiik A. International Consensus Statement on Testing and Reporting of Antineutrophil Cytoplasmic Antibodies (ANCA) Am J Clin Pathol Apr;111(4): Review. 12. Savige J, Dimech W, Fritzler M, Goeken J, Hagen EC, Jennette JC, McEvoy R, Pusey C, Pollock W, Trevisin M, Wiik A, Wong R; International Group for Consensus Statement on Testing and Reporting of Antineutrophil Cytoplasmic Antibodies (ANCA). Addendum to the International Consensus Statement on testing and reporting of antineutrophil cytoplasmic antibodies. Quality control guidelines, comments, and recommendations for testing in other autoimmune diseases. Am J Clin Pathol Sep;120(3): Review. Hersteller: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Rappresentante Autorizzato: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: ITA December 2012 Revision 1 6