NOVA Lite dsdna Crithidia luciliae Kits/Substrate Slides Per uso diagnostico In Vitro
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- Erico Spinelli
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1 NOVA Lite dsdna Crithidia luciliae Kits/Substrate Slides Per uso diagnostico In Vitro Codice Prodotto: , , , Complessità CLIA: elevata Finalità d uso NOVA Lite dsdna Crithidia luciliae è un test immunofluorescenza indiretta per lo screening e la determinazione semi-quantitativa nel siero umano di DNA a doppia elica (dsdna). La presenza di anticorpi di DNA a doppia elica, assieme ad altri test sierologici ed ai riscontri clinici, più essere di ausilio nella diagnosi di lupus eritematoso sistemico (LES). Riassunto e Spiegazione del test Il test NOVA Lite dsdna Crithidia luciliae è un analisi degli anticorpi alla immunofluorescenza che utilizza come substrato l emoflagellato Crithidia luciliae. Questo organismo unicellulare possiede un mitocondrio gigante che contiene una massa molto condensata di dsdna circolare. 1 Questa massa di dsdna, conosciuta come cinetoplasto, sembra essere privo di istoni e di altri antigeni nucleari di mammifero. 1,2 Viene utilizzato come substrato sensibile e specifico per rilevare la presenza di autoanticorpi diretti verso il dsdna. Gli autoanticorpi verso il dsdna si riscontrano quasi esclusivamente in pazienti affetti da lupus eritematoso sistemico (LES) e per questo vengono considerati degli anticorpi marker. Gli Autoanticorpi verso il dsdna sono stati inclusi nei criteri revisionati per la classificazione del lupus eritematoso sistemico del 1982 compilata da un sottocomitato della Arthritis and Rheumatism Association (associazione per patologie artritiche e reumatiche). 3 L analisi comunemente utilizzata Anticorpi Antinucleo (ANA) è un analisi sensibile di screening per il LES ed altre malattie del tessuto connettivo, ma non è specifica del LES. Per tale motivo tutti i campioni risultati positivi agli ANA dovrebbero essere analizzati per la ricerca di anticorpi specifici contro il dsdna. La presenza di anticorpi verso il dsdna indica fortemente la presenza di LES; tuttavia la loro assenza non esclude il LES in tutti i casi. Nel corso degli anni si sono utilizzati una varietà di metodi per determinare la presenza di anticorpi verso il dsdna. Questi metodi includono la fissazione del complemento 4, l agglutinazione passiva 5 e la RIA. 6-8 Il vantaggio principale di un test per il dsdna basato sul C. luciliae è la sua specificità, dovuta alla natura della massa di dsdna circolare fortemente aggrovigliata nel cinetoplasto Questa caratteristica riveste importanza vitale per un analisi di un anticorpo markeri. Principio della Metodica Nel test all immunofluorescenza indiretta dei campioni vengono incubati con il substrato dell antigene e gli anticorpi che non hanno reagito vengono lavati via. Il substrato viene incubato con un coniugato specifico marcato con fluoresceina e successivamente il reagente che non si è legato viene lavato via. Quando i campioni positivi agli autoanticorpi vengono osservati con un microscopio a fluorescenza, mostrano una fluorescenza color verde chiaro che corrisponde alle aree delle cellule o dei nuclei dove si è legato l autoanticorpo. Reagenti 1. Crithidia luciliae, Vetrini (dsdna), 6 o 12 pozzetti/vetrino, con essiccante Solo kit 2. Coniugato anti-igg umano (capra) senza Evan s blu, marcato alla fluoresceina in tampone contenente azoturo di sodio allo 0,09% 3. Positivo dsdna 1 fiala di tampone contenente azoturo di sodio allo 0,09% ed anticorpi verso il dsdna da siero umano, prediluito 4. Controllo negativo sistema IFA, 1 fiala di tampone contenente azoturo di sodio allo 0,09% ma priva di anticorpi verso il dsdna da siero umano, prediluito 5. Concentrato PBS II (40x) 6. Liquido di montaggio, azoturo di sodio 0,09% 7. Coprivetrini Avvertenze 1. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-h I V, p e BsAg r H e per anticorpi anti- HCV mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Positivo dsdna ed Controllo Negativo Sistemi IFA devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. 1
2 3. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 4. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto (kit) è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili. 3. Un lavaggio incompleto o non accurato dai pozzetti IFA può causare un un elevato background. 4. L'adattamento di questo test per l'uso con un processatore automatico di campioni ed altri dispositivi di manipolazione di liquidi, in tutto od in parte, può portare differenze nei risultati dei test rispetto a quelli ottenuti eseguendo la procedura manuale. E' responsabilità di ogni laboratorio validare la loro procedura automatizzata affinché fornisca risultati dei test entro limiti accettabili. 5. La prestazione del test è influenzata da diversi fattori. Questi includono la temperatura iniziale dei reagenti, la luminosità della lampada del microscopio usato, l'accuratezza e riproducibilità della tecnica di pipettamento, la precisione del lavaggio e la lunghezza dei tempi d'incubazione durante il test. E' richiesto di prestare particolare attenzione alla consistenza per ottenere risultati accurati e riproducibili. 6. Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del vetrini e kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. 2. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 4 settimana a 2-8 C. Raccolta dei campioni Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L aggiunta al campione di sodio azide o di altri conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l uso di sieri fortemente emolizzati o lipemici. Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A3 dell NCCLS (CLSI) raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8 C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a -20 C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati. Procedura Materiali forniti (kits) pozzetti Vetrini di substrato di dsdna Crithidia luciliae 1 4 ml Coniugato anti-igg umano 1 0,5 ml Positivo dsdna 1 0,5 ml Controllo Negativo Sistemi IFA 1 25 ml Concentrato PBS II (40x) 1 7 ml Liquido di montaggio 1 10 Coprivetrini pozzetti Vetrini di substrato di dsdna Crithidia luciliae 1 15 ml Coniugato anti-igg umano 1 0,5 ml Positivo dsdna 1 0,5 ml Controllo Negativo Sistemi IFA 2 25 ml Concentrato PBS II (40x) 1 7 ml Liquido di montaggio 1 20 Coprivetrini Materiali forniti (vetrini) Vetrini x 6-pozzetti di substrato di dsdna Crithidia luciliae Vetrini x 12-pozzetti di substrato di dsdna Crithidia luciliae Vetrini x 12-pozzetti di substrato di dsdna Crithidia luciliae Materiali richiesti ma non forniti Micropipette in grando di erogare volume di µl Acqua distillata o deionizzata Bottiglie di plastica a spruzzo o pipette Pasteur Camera umida Beuta da 1l per diluire il PBS II Vaschette Coplin Microscopio a fluorescenza con eccitatore a 495 nm e filtro barriera 515 nm 2
3 Metodica Prima di incominciare 1. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26 o C) e mescolarli bene. 2. Diluire il concentrato PBS II: IMPORTANTE: diluire il concentrato PBS II 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone contenente il concentrato PBS II in 975 ml di acqua distillata o deionizzata e mescolare accuratamente. Il tampone PBS II viene utilizzato per diluire i campioni dei pazienti e come tampone di lavaggio. Il tampone diluito può essere conservato al massimo per 4 settimane 2-8 C. 3. Diluire i campioni del paziente: a. Screening iniziale: diluire i campioni 1:10 con il tampone PBS II diluito (ovvero, aggiungere 100 µl di siero a 900 µl di tampone PBS II). b. Titolazione: preparare delle diluizioni seriali doppie dalla diluizione di screening iniziale per tutti i campioni positivi con il tampone PBS II diluito (ovvero 1:20, 1:40,... 1:640). Esecuzione del test 1. Preparare i vetrini del substrato: lasciare raggiungere la temperatura ambiente al vetrino del substrato prima di toglierlo dal sacchetto. Contrassegnarlo con una matita e porlo in una camera umida adeguata. Aggiungere 1 goccia (20-25 µl) dei controlli positivi e negativi non diluiti rispettivamente nei pozzetti 1 e 2. Aggiungere 1 goccia (20-25 µl) del campione diluito del paziente nei rimanenti pozzetti. 2. Incubazione dei vetrini: incubare il vetrino per minuti in una camera umida (un tovagliolo di carta inumidito disteso sul fondo di un contenitore in plastica o vetro manterrà le condizioni di umidità adeguate). Non lasciare asciugare il substrato durante la procedura d esame. 3. Lavare i vetrini: dopo l incubazione utilizzare una bottiglia di plastica a spruzzo o una pipetta per lavare via delicatamente il siero utilizzando il tampone PBS II diluito. Orientare il vetrino e la direzione del flusso del tampone PBS II in modo da impedire il più possibile al tampone di scavalcare i vari pozzetti. Evitare di dirigere il flusso direttamente nei pozzetti per evitare danni al substrato. Se voluto, disponga gli vetrini i in un vaso di Coplin dell'amplificatore diluito di PBS II per fino a 5 minuti. 4. Aggiunta del coniugato fluorescente eliminare il tampone PBS II II in eccesso. Porre nuovamente il vetrino nella camera umida ed immediatamente coprire tutti i pozzetti con una goccia di coniugato fluorescente. Incubare i vetrini per ulteriori minuti. 5. Lavare i vetrini: ripetere la fase Coprire i vetrini: le procedure per coprire i vetrini variano da laboratorio a laboratorio. Le seguenti procedure sono raccomandate: a. Porre un coprivetrino su un tovagliolo di carta. b. Applicare il liquido di montaggio in una linea continua lungo il bordo inferiore del coprivetrino. c. Eliminare il tampone PBS II in eccesso e fare combaciare il bordo inferiore del vetrino con il bordo del coprivetrino. Abbassare con delicatezza il vetrino sul coprivetrino in modo che il collante scorra fino al bordo superiore del vetrino senza formare bolle d aria. Controllo di qualità Il Positivo dsdna ed il Controllo negativo sistema IFA dovrebbero essere effettuati su ogni vetrino in modo da assicurarsi che tutti i reagenti e le procedure siano state eseguite nel modo corretto. Si può preparare dell ulteriore siero di controllo formando ed aliquotando un pool di siero umano e conservandolo a < -70 o C. I risultati dell analisi devono soddisfare tutti i criteri elencati qui di seguito per essere considerati validi. Se uno qualunque non viene soddisfatto, si dovrebbe considerare non valido il risultato dell esame e si dovrebbe ripetere il test. 1. Il Positivo dsdna non diluito deve essere > Il Controllo negativo sistema IFA deve risultare negativo. Interpretazione dei risultati Reazione negativa. Un campione è considerato negativo se la colorazione specifica del cinetoplasto è inferiore rispetto a quella del controllo negativo. La colorazione di altre strutture quali il corpo basale, il flagello o il nucleo senza una concomitante colorazione del cinetoplasto dovrebbe essere considerata negativa per reattività dsdna. Reazione positiva. Un campione è considerato positivo se la colorazione specifica del cinetoplasto, oppure del cinetoplasto più il nucleo, risulta più elevata rispetto al controllo negativo. Tutti i campioni positivi dovrebbero essere titolati utilizzando diluizioni seriali doppie fino all estremo. Determinare il grado o l intensità di fluorescenza utilizzando questi criteri: 4+ Fluorescenza verde chiaro brillante 3+ Fluorescenza verde chiara accesa 2+ Fluorescenza positiva chiaramente distinguibile 1+ La fluorescenza specifica più bassa che permette di distinguere chiaramente la colorazione cinetoplasto rispetto alla fluorescenza di fondo 3
4 Limitazioni del test 1. L utente dovrebbe essere a conoscenza degli effetti dell eccesso di anticorpo e la possibilità di ottenere pattern di colorazione non-dsdna durante la lettura dei vetrini. 2. La sensibilità del test è influenzata da una serie di fattori esterni fra cui il tipo di microscopio a fluorescenza utilizzato, la forza e l età della lampadina, l ingrandimento utilizzato, il filtro utilizzato e l osservatore. 3. Se viene utilizzato un filtro a banda invece di un filtro barriera 515, si può osservare un numero maggiore di artefatti di colorazione. 4. Si dovrebbe utilizzare solamente una matita per marcare i vetrini. Qualunque altro tipo di materiale per scrivere può causare artefatti. 5. Le vaschette Coplin utilizzate per lavare i vetrini non dovrebbero contenere residui di colorante. L utilizzo di vaschette Coplin che contengono residui di colorante può causare artefatti. 6. I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e del risultato degli altri test sierologici. 7. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero. I vetrini venduti separatamente vengono classificati come Reagenti analita-specifici. Ad eccezione di un componente del kit NOVA Lite dsdna Crithidia luciliae Kit, le caratteristiche analitiche e prestazionali non sono stabilite. Valori attesi Il substrato NOVA Lite dsdna Crithidia luciliae è stato utilizzato per analizzare una varietà di pazienti affetti da malattie del tessuto connettivo ed anche 200 donatori di sangue scelti in maniera casuale. I risultati appaiono qui di seguito: Gruppo di pazienti Numero Numero di positivi al NOVA Lite dsdna Crithidia luciliae LES Lupus indotto da droghe 24 0 Artrite reumatoide 40 0 Sclerodermia 24 0 Dermatomiosite 14 0 Sindrome di Sjögren 14 0 Normali
5 Bibliografia 1. Aarden LA, de Groot ER, Feltkamp TE: Immunology of DNA. III. Crithidia luciliae, a simple substrate for the detection of anti-dsdna with immunofluorescence techniques. Ann. NY Acad. Sci. 254: , Crowe W, Kusher I: An immunofluorescent method using Crithidia luciliae to detect antibodies to double-stranded DNA. Arthritis and Rheumatism 20: , Tan EM, et al.: The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: , Arana R, Seligmann M: Antibodies to native and denatured deoxyribonucleic acid in systemic lupus erythematosus. J. Clin. Invest. 46: , Inami YH, Nakamura RM, Tan EM: Microhemagglutination test for the detection of native and single-stranded DNA antibodies and circulating DNA antigen. J. Immunol. Methods 3: , Aarden LA, Lakmaker F, de Groot ER, et al.: Detection of antibodies to DNA by radioimmunoassay and immunofluorescence. Scand. J. Rheu. Suppl. 11: 12-19, Fish F, Ziff M: A sensitive solid phase microradioimmunoassay for anti double-stranded DNA antibodies. Arthritis and Rheumatism 24: , Pincus T, Schur P, Rose JA, et al.: Measurement of serum DNA-binding activity in systemic lupus erythematosus. The New England J. of Medicine 281: , Somerfield SD, Roberts MW, Booth RJ: Double-stranded DNA antibodies: comparison of four methods of detection. J. Clin. Path. 34: , Sontheimer RD, Gilliam JD: An immunofluorescence assay for double-stranded DNA antibodies using the Crithidia luciliae kinetoplast as a double-stranded DNA substrate. J. Lab Clin. Med. 91: , Stingl G, Meingassner JG, Swelty P, Knapp W: An immunofluorescence procedure for the demonstration of antibodies to native, double-stranded DNA and of circulating DNA-anti DNA complexes. Clin. Immunol. Immunopath. 6: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5 th Edition. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2009 Fornitore: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Rappresentante Autorizzato: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: ITA December 2012 Revision 16 NOVA Lite e INOVA Diagnostics, Inc. sono marchi registrati. Copyright 2012 Tutti i diritti riservati. 5
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