ANA screening: un test storico e con recenti rivisitazioni

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Cecilia Conti
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1 Approccio critico alla diagnosi di laboratorio: ANA screening: un test storico e con recenti rivisitazioni Angela Tincani e Nice Carabellese Spedali Civili e Università degli Studi di Brescia

2 Le due solitudini I medici che vedono i pazienti & interpretano il risultato degli autoab nell ambito della malattia sono concentrati sul: -fare una diagnosi corretta -iniziare il trattamento I laboratoristi che ricevono il siero & interpretano i risultati nell ambito di coorti sierologiche si sforzano di: -dare il risultato giusto

3 Una storia vecchia Detection and quantification of autoantibodies are vital tests in the diagnosis and management of autoimmune diseases Fritzler et al. Arthritis Res Ther 2003;5: Wiik et al. Lupus 2006;15: Aspetti nuovi Aumento del numero delle richieste I tests non sono più confinati a laboratori specialistici Introduzione di nuove tecniche di indagine Test automatizzati Il problema della riproducibilità diventa il problema centrale!!

4 Ulteriori problemi Le manifestazioni cliniche all esordio di una malattia autoimmune sistemica sono spesso modeste e non caratteristiche La diagnosi precoce è requisito essenziale per il successo del trattamento Un test sbagliato può ritardare la diagnosi o Può essere responsabile di costi aggiuntivi dovuti alla ripetizione di tests di conferma e/o alla esecuzione di altre procedure diagnostiche magari inutili. Aspetti etici (Bossuyt et al. Ann Rheum Dis 2008;67: ).

5 Un esempio paradigmatico del problema sono i test di screening per gli anticorpi antinucleo (ANA)

6 HEp2 IIF ANA screening test Dagli anni 70 le sezioni di tessuto usate come substrato sono state sostituite da cellule da coltura(cellule HEp2, cellule epiteliali di carcinoma di laringe umana) - alta sensibilità: > 80% - alta specificità: NHS 5-15% +ve * Importante la diluizione di partenza: raccomandata 1/160 (Tan et al A&R 97) Sempre più usato negli ultimi 25 anni - Utilizzatori: reumatologi, nefrologi, dermatologi, internisti, ginecologi, epatologi, neurologi, pediatri, oculisti, otorinolaringoiatri, endocrinologi, pneumologi, medici di medicina generale.

7 Gli ANA in IIF 1:160

8 Limiti degli ANA testati in IIF Le cellule Hep-2 cells hanno circa 150 Ags diversi Ma il metodo IIF non riesce a rilevare tutti gli anticorpi utili dal punto di vista clinico; talvolta difficile è rilevare: - Jo-1, Ag P Ribosomiale, PCNA, CENP, Ro/SS- A La presenza di multiple positività può mascherare Grande variazione tra ditta e ditta Possibilità di falsi positivi

9 ANA HEp-2 pattern is a critical parameter for discriminating ANApositive healthy individuals & patients with autoimmune rheumatic diseases (Mariz Ha et al A&R 11) Nuclear homogeneous, nuclear coarse speckled, and nuclear centromeric patterns appeared exclusively in patients with ARDs. The nuclear dense fine speckled pattern occurred only in healthy individuals. The most frequent ANA pattern in both groups was the nuclear fine speckled pattern, which occurred at lower titer in healthy individuals than in patients with ARDs (P<0.001). (Observed at 1:80 dilution in 2 distinct commercial HEp-2 slides by 2 blinded independent observers). Dense Fine Speckled (DSF70)

10 Siamo di fronte a un problema Gli ANA screening che utilizzano ELISA o altre fasi solide (beads) sono metodiche più economiche e veloci e hanno iniziato a sostuire la IIF in molte realtà. Un piccolo ma significativo numero di pazienti con LES o altre ARD possono risultare positivi alla IIF ma negativi nei tests in fase solida (che studiano un numero di Ag limitato).

11 .e alle sue conseguenze Negli USA nel 2008 sono stati segnalati numerosi casi di falsi risultati negativi di ANA nella pratica clinica con conseguenti problemi anche assicurativi!!

12 Volume 360: February 12, 2009 Number 7 Case A 47-Year-Old Woman with a Rash and Numbness and Pain in the Legs Daniela Kroshinsky, M.D., John H. Stone, M.D., M.P.H., Donald B. Bloch, M.D., and Alireza Sepehr, M.D. Il risultato negativo degli ANA eseguiti all inizio della storia clinica ha ritardato per mesi la diagnosi di LES.

13 COMMITTEE OF AUTOANTIBODY STANDARDIZATION INTERNATIONAL UNION OF IMMUNOLOGICAL SOCIETIES (AutoAb.org) ACR Annual Meeting Boston 2008 ACR Study Group Autoantibodies in Diagnosis and Follow-up of Rheumatic Diseases Coordinators: Angela Tincani, MD, and Edward K.L. Chan, PhD Moderator: Pier Luigi Meroni, MD Session Objectives:.. Discuss the current ACR topic of inaccurate results for antinuclear antibody when using ANA Enzyme-linked Immuno-Sorbent Assay or coated beads for screening Inaccurate Results for ANA by John A. Goldman, MD, Atlanta, GA ACR Annual Meeting S. Francisco 2009 ACR Study Group Autoantibodies in Diagnosis and Follow-up of Rheumatic Diseases Coordinators: Angela Tincani, MD, and Edward K.L. Chan, PhD Moderator: Pier Luigi Meroni, MD Session Objectives: identify the common clinical problems associated with inaccurate ANA results describe the current technologies that clinical laboratories are using and how physicians should be engaged with the clinical laboratory outline the proper use and interpretation of autoantibody testing in a clinical rheumatology setting state the role and ethical obligations of the manufacturer, diagnostic laboratory and the clinician in the production, sale and use of autoantibody diagnostic kits Cases of Inaccurate ANA by Merlin R. Wilson, MD, New Orleans, LA Screening ANA Assays: Immunofluorescence on HEp-2 cells vs Enzyme Immunoassays and Multiplex Bead Assays by Eng M. Tan, MD, La Jolla, CA

ANA Task Force Negli USA nel 2008 sono stati segnalati numerosi casi di falsi risultati negativi di ANA nella pratica clinica Questi dati sono stati riportati ai membri del

14 ANA Task Force Negli USA nel 2008 sono stati segnalati numerosi casi di falsi risultati negativi di ANA nella pratica clinica Questi dati sono stati riportati ai membri del ACR e discussi in diversi gruppi di studio (in presenza anche dell industria). ed è stato costituito un gruppo per analizzare il problema ed arrivare ad una opinione comune

15 Le possibili ragioni del problema I metodi in fase solida possono rilevare Abs soltanto verso gli antigeni che vengono copulati alla fase solida. Le cellule Hep-2 contengono un numero infinito di Ag. In caso venga copulato in fase solida il così detto estratto nucleare da Hep-2, non siamo in grado di dire quali antigeni siano disponibili. Si potrebbero perdere importanti epitopi durante il processo di estrazione o durante quello di copulazione.

18 Standardizzazione dei tests diagnostici per le malattie autoimmuni alcuni degli aspetti su cui lavorare Valutazione della variabilità dei metodi; Interpretazione dei tests e impostazione algoritmi; Caratterizzazione degli Ag utilizzati come bersaglio per gli autoanticorpi presenti nel siero dei pazienti; Disponibilità di materiale di riferimento; Lettura computerizzata immagini digitali.

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