ISTRUZIONI PER L USO. BINDAZYME ASCA IgG umane Kit EIA - MK053 BINDAZYME ASCA IgA umane Kit EIA - MK054. (Anticorpi anti-saccharomyces cerevisiae)

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1 ISTRUZIONI PER L USO BINDAZYME umane Kit EIA - MK053 BINDAZYME umane Kit EIA - MK054 (Anticorpi anti-saccharomyces cerevisiae) Per uso diagnostico in-vitro Italian Prodotto da: The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K. 1 UTILIZZO Telefono: +44 (0) Fax: +44 (0) info@bindingsite.co.uk I presenti dosaggi consentono la determinazione semi-quantitativa in vitro degli anticorpi anti-saccharomyces cerevisiae (Codice Prodotto MK053) o (Codice prodotto MK054) nel siero umano. La presenza di anticorpi ASCA può essere un sussidio nella diagnosi di pazienti con Morbo di Crohn. I risultati del test devono essere utilizzati in associazione ad ulteriori ricerche cliniche e ad altre analisi di laboratorio. Il test per gli anticorpi non deve essere impiegato da solo, come un generale test di screening per gli ASCA, ma deve essere considerato come un test complementare, non in grado di sostituire il test per la ricerca degli anticorpi, poiché alcuni sottogruppi di pazienti affetti da Morbo di Crohn possono non presentare anticorpi di classe IgA. Ciascun kit contiene materiale sufficiente per eseguire il dosaggio di un numero massimo di 41 campioni da testare in doppio o 8 campioni in singolo, con una curva di calibrazione, un controllo positivo ed uno negativo per il dosaggio semi-quantitativo. Qualora venga utilizzato come test di screening, si possono dosare 45 campioni in doppio o 3 in singolo, assieme ai controlli cut-off, positivo e negativo. 2 DATI CLINICI Le malattie infiammatorie croniche intestinali (MICI o IBD da Inflammatory bowel disease ) sono forme infiammatorie intestinali croniche e recidive. I pazienti possono avere una varietà di sintomi tra cui diarrea, dolori addominali e perdita di peso. Le due forme principali di MICI/IBD sono il morbo di Crohn (MC) e la colite ulcerosa (CU). Il morbo di Crohn colpisce sia uomini che donne a qualsiasi età. Al contrario, la colite ulcerosa è più frequente nelle donne, con un picco di maggior insorgenza intorno ai 20 anni. I pazienti MC possono avere sia anticorpi IgG che IgA diretti verso gli epitopi oligomannosidici del lievito Saccharomyces cerevisiae 1. La determinazione degli anticorpi anti-citoplasma perinucleare dei neutrofili (panca) in combinazione con gli ASCA dà la migliore differenziazione diagnostica tra MC e CU (Rutgeerts e Vermeire 2 ). In un altro lavoro, Peeters et al. 3 hanno riscontrato una sensibilità del 60%, una specificità dell 86% e un valore predittivo positivo (PPV) del 2% degli ASCA per il morbo di Crohn e in contrasto una sensibilità del 50%, una specificità del 4% e un PPV del 76% dei panca per la CU. La combinazione dei due metodi ne aumenta sia la specificità che il PPV. Gli stessi valori degli ASCA+/pANCA- per il morbo di Crohn sono rispettivamente del 56%, 2% e 5%, mentre le rispettive percentuali dei panca+/asca- per la CU sono 44%, 8% e 88%. Un sottogruppo dei pazienti MC non presenta anticorpi ASCA. Infatti, in uno studio su 0 pazienti MC la prevalenza degli ASCA è risultata relativamente bassa: 61% (Quinton et al, 18) 4, limitandone pertanto l utilità clinica a questo studio. Nei pazienti con colite indeterminata (CI), gli ASCA+/pANCA- hanno predetto il morbo di Crohn nell 80% dei pazienti e i panca+/asca- hanno predetto la CU nel 63% dei casi. Tuttavia il 48% dei pazienti CI non presentava anticorpi ASCA o panca, suggerendo che questi pazienti costituiscono un entità patologica a sè stante (Joossens et al, 2002) 5. Titoli ASCA positivi sono stati altresì associati al morbo celiaco nel 14-43% dei casi (Conrad et al 6, Damoiseaux et al 7 ). Combinando quindi gli anticorpi antitransglutaminasi tissutale (ttga) con gli ASCA e gli ANCA, si può ottenere un accuratezza ancora migliore. Gli ASCA+/ANCA-/tTGA- danno una sensibilità del 60%, una specificità del 0%, un PPV del 0% e un valore predittivo negativo del 0% per il morbo di Crohn. 3 PRINCIPIO DEL DOSAGGIO I micropozzetti sono sensibilizzati con mannano isolato da Saccharomyces cerevisiae. I calibratori, i controlli e i campioni diluiti vengono dispensati nei pozzetti. Gli eventuali autoanticorpi diretti verso il mannan si legheranno durante la prima incubazione. Dopo il lavaggio dei pozzetti, per rimuovere il materiale non legato, viene aggiunto il coniugato: anti-igg o -IgA umane di coniglio (catena γ- o α-specifiche) marcate con perossidasi. Il coniugato si legherà agli eventuali anticorpi umani catturati nel pozzetto mentre il coniugato in eccesso viene rimosso mediante ulteriore lavaggio. Il coniugato legato verrà evidenziato mediante aggiunta del substrato TMB (3,3,5,5 tetrametilbenzidina). In presenza di perossidasi, si ottiene una colorazione blu che virerà al giallo dopo aver aggiunto acido fosforico. L intensità del colore, proporzionale alla concentrazione di autoanticorpi nel campione, viene letta a 450nm. 4 PRECAUZIONI 4.1 AVVERTENZE Tutti i sieri umani forniti nel kit sono stati sottoposti a screening per donatori, risultando negativi per l antigene di superficie dell epatite B e per gli anticorpi verso i virus HIV1, HIV2 e HCV mediante l uso di dispositivi marcati CE, in ottemperanza alla Direttiva Europea 8/7/CE sui Dispositivi Medico-Diagnostici in vitro (Allegato II, Lista A). I suddetti dosaggi tuttavia non garantiscono la totale assenza di agenti infettivi. È opportuno quindi stabilire delle apposite modalità per la manipolazione e lo smaltimento di tali materiali. L uso del presente kit deve essere consentito solamente a personale qualificato per la gestione di materiali potenzialmente infetti. La sodio azide può reagire con il piombo ed il rame delle tubature, formando azidi di metallo altamente esplosive. Per evitare l accumulo di tali composti, far scorrere abbondante acqua sui reagenti eliminati. I tamponi ed i sieri forniti nel kit contengono vari inibitori enzimatici qui di seguito elencati. Tali reattivi devono essere manipolati con cautela: INIBITORE Kathon Sodio Azide Proclin 300 Bromonitrodioxane Methylisothiazone CONCENTRAZIONE 0,02% 0,0% 0,045% 0,002% 0,002% Proclin è un marchio Rohm & Haas Corp. Philadelphia, PA Il Kathon è un agente irritante e può causare sensibilizzazione cutanea. La soluzione bloccante contiene acido fosforico 3M, un agente irritante. Evitare il contatto con la pelle e con gli occhi. Schizzi ed eventuali rovesciamenti di reattivo devono essere ripuliti secondo le opportune modalità stabilite dalle direttive locali sui rifiuti speciali. 4.2 PRECAUZIONI Il presente prodotto deve essere utilizzato da personale specializzato. Si raccomanda di osservare la procedura del test alla lettera. Qualsiasi variazione potrebbe influire sui risultati e la qualità del dosaggio. Non trascurare le eventuali Note ed avvertenze contenute nelle istruzioni. I reattivi provenienti da lotti diversi di kit NON sono intercambiabili. Se si effettuano molti dosaggi, occorre avere l accortezza di controllare che tutti I reattivi provengano dallo STESSO lotto. Tutti gli strip utilizzati devono provenire dalla medesima custodia di alluminio. La sostituzione di qualsiasi componente può portare a risultati errati. Per evitare contaminazioni, utilizzare solamente vetreria/contenitori di plastica nuovi o perfettamente puliti. Mai versare reattivi inutilizzati nuovamente nel flacone di origine. Non lasciare i flaconi dei reattivi stappati; qualsiasi evaporazione o contaminazione che ne risultasse darà luogo a risultati inattendibili. Il substrato TMB deve essere mantenuto al riparo dalla luce e dall acqua. I sieri con contaminazioni microbiche, emolizzati o lipemici ed i campioni contenenti particelle non devono essere utilizzati. L accuratezza della diluizione dei campioni non può essere verificata in quanto i controlli sono pronti per l uso. Si consiglia pertanto l utilizzo di pipette calibrate e di sieri di controllo interni. L utilizzo di campionatori automatici, diluitori per campioni o di qualsiasi altro tipo di strumentazione automatica può dar luogo a differenze nei risultati, rispetto al procedimento manuale. È responsabilità del laboratorio convalidare il sistema di automazione, verificando che i risultati rientrino nei limiti definiti nella presente metodica e nel certificato QC annesso. Tutta la strumentazione utilizzata dovrà essere tarata e sottoposta alla manutenzione periodica suggerita dalla casa madre. 4.3 CONSERVAZIONE E STABILITÀ Il kit deve essere conservato a 2-8 C e non deve essere congelato. Temperature di conservazione inappropriate possono influire sui risultati. Il tampone di lavaggio diluito in un contenitore pulito può essere conservato a temperatura ambiente (20-24 C) per un massimo di 4 settimane. La scadenza del kit è evidenziata sull etichetta esterna. 5 RACCOLTA E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI I campioni di sangue devono provenire da prelievi venosi, lasciati coagulare naturalmente, separandone poi il siero. Il siero può essere conservato a 2-8 C per un massimo di 7 giorni prima del dosaggio 8, oppure per periodi più lunghi, aliquotare e conservare a -20 C o temperature inferiori. Evitare ripetuti congelamenti/scongelamenti dei campioni. I campioni di siero non devono essere inattivati mediante calore, in quanto ciò può dar luogo a risultati falsi positivi. 6 MATERIALI 6.1 MATERIALI FORNITI Componenti comuni ad entrambi i kit Metodica: con tutti i dettagli del dosaggio. Certificato QC: con i valori attesi del lotto in questione. Mannan Coated Wells (Pozzetti rivestiti con mannan): 12 x 8 strip di pozzetti sensibilizzati con mannan. Ciascuna piastra è inserita in una custodia di alluminio richiudibile con 2 bustine di agente essiccante. Insert Codes: E053.I, Version: 20 July 2006, Page 1 of 5

2 Type III Sample Diluent (Diluente dei campioni tipo III): 2 flaconi contenenti 50mL di tampone per la diluizione dei campioni. Colorato in giallo. Pronto per l uso. Wash Buffer (Tampone di lavaggio): 1 flacone contenente 50mL di tampone concentrato 20x per il lavaggio dei pozzetti. TMB Substrate (Substrato TMB): un flacone contenente 14mL di substrato TMB. Pronto per l uso. Stop Solution (Soluzione bloccante): un flacone contenente 14mL di acido fosforico 3M. Pronto per l uso. 6.2 MATERIALI SPECIFICI FORNITI RISPETTIVAMENTE PER O IgA: BINDAZYME (MK053) Calibrators (Calibratori ): 5 flaconcini, ciascuno contenente 1,2mL di siero umano diluito alle seguenti concentrazioni di autoanticorpi : 0; 33,3; 11,1; 3,7; 1,23 U/mL. Pronti per l uso. Cut-off Control (Controllo cut-off ): 1 flaconcino contenente 1,2mL di siero umano diluito. Pronto per l uso. Positive Control (Controllo positivo ): 1 flaconcino contenente 1,2mL di siero umano diluito. Il valore atteso è riportato sul Certificato QC. Pronto per l uso. ASCA Negative Control (Controllo negativo ASCA): 1 flaconcino contenente 1,2mL di siero umano diluito. Il valore atteso è riportato sul Certificato QC. Pronto per l uso. Conjugate (Coniugato ): un flacone contenente 12mL di anticorpi anti-igg umane, purificati, coniugati con perossidasi. Colorato in rosso. Pronto per l uso BINDAZYME (MK054) Calibrators (Calibratori ): 5 flaconcini, ciascuno contenente 1,2mL di siero umano diluito alle seguenti concentrazioni di autoanticorpi : 0; 33,3; 11,1; 3,7; 1,23 U/mL. Pronti per l uso. Cut-off Control (Controllo cut-off ): 1 flaconcino contenente 1,2mL di siero umano diluito. Pronto per l uso. Positive Control (Controllo positivo ): 1 flaconcino contenente 1,2mL di siero umano diluito. Il valore atteso è riportato sul Certificato QC. Pronto per l uso. ASCA Negative Control (Controllo negativo ASCA): 1 flaconcino contenente 1,2mL di siero umano diluito. Il valore atteso è riportato sul Certificato QC. Pronto per l uso. Conjugate (Coniugato ): un flacone contenente 12mL di anticorpi anti-iga umane, purificati, coniugati con perossidasi. Colorato in verde. Pronto per l uso. 6.3 MATERIALI E STRUMENTI AGGIUNTIVI non forniti Lavatore automatico per micropiastre: Raccomandato pur essendo possibile il lavaggio manuale delle piastre. Lettore per micropiastre: In grado di misurare le densità ottiche a 450nm (contro aria). Acqua distillata o deionizzata: Della migliore qualità disponibile. Micropipette calibrate: Per dispensare 00, 0 e µl. Pipetta multicanale: Raccomandata per dispensare i 0µL di coniugato, substrato e soluzione bloccante. Provette di vetro/plastica: Per la diluizione dei campioni. 7 METODO DI DOSAGGIO 7.1 PREPARAZIONE DEL DOSAGGIO 1. Portare il kit a temperatura ambiente Il kit è stato messo a punto per una procedura a temperatura ambiente (20-24 C). Togliere il kit dal luogo di conservazione e attendere che raggiunga la temperatura ambiente (per circa 60 minuti). I pozzetti non devono essere rimossi dalla custodia di alluminio finché non abbiano raggiunto la temperatura ambiente. Nota: I kit si mantengono a temperatura ambiente per una settimana. 2. Componenti del kit Miscelare uniformemente ciascun componente del kit prima dell uso. 3. Diluizione del tampone di lavaggio Aggiungere 50mL di tampone di lavaggio concentrato a 50mL di acqua distillata (diluizione 1:20) in un contenitore pulito e miscelare. Il tampone di lavaggio diluito può essere conservato a temperatura ambiente per un massimo di 4 settimane. Se non si prevede di utilizzare l intero kit in quest arco di tempo, è opportuno frazionare i quantitativi da diluire. 4. Diluizione dei campioni Diluire µl di ciascun campione con 00µL di diluente dei campioni (1:0) e miscelare accuratamente. Nota: I campioni diluiti devono essere utilizzati entro 8 ore. 5. Manipolazione degli strip e del supporto Inserire il numero desiderato di pozzetti negli strip, a partire dal pozzetto A1, riempiendo le colonne da sinistra a destra, fino a completare l intera piastra. Durante tale procedura è opportuno premere sui lati più lunghi del supporto, per evitare la fuoriuscita dei pozzetti. Nota: Riporre immediatamente i pozzetti non utilizzati nella custodia di alluminio con le 2 bustine di essiccante, richiudendo saldamente per ridurre al minimo l esposizione all umidità. Assicurarsi che non vi siano strappi o forature nella custodia di alluminio: AVVERTENZA: L esposizione dei pozzetti all umidità, la contaminazione da polvere o da qualsiasi altro tipo di particelle può dar luogo al deterioramento degli antigeni, con risultati del dosaggio poco attendibili. 7.2 METODO DEL DOSAGGIO Mantenere lo stesso ordine di dispensazione durante tutta la seduta. 1. Dispensazione dei campioni Dispensare 0µL dei 5 calibratori (per il dosaggio semi-quantitativo) o 0μL del controllo cut-off (per il test di screening), dei controlli e dei campioni prediluiti (1:0) nei rispettivi pozzetti, all interno della piastra. Nota: I campioni devono essere dispensati il più velocemente possibile per ridurre al minimo l effetto deriva sul dosaggio. Far partire il timer dopo aver dispensato l ultimo campione. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. 2. Lavaggi La procedura di lavaggio rappresenta un passaggio critico e richiede particolare attenzione. Una piastra non lavata correttamente può dare risultati inaccurati, con scarsa precisione ed elevati rumori di fondo. Terminata l incubazione, lavare la piastra 3 volte con μL di tampone di lavaggio per pozzetto. Utilizzare un lavatore automatico oppure procedere manualmente come qui di seguito riportato. Dopo l ultimo lavaggio automatico, capovolgere la piastra su carta assorbente picchiettando delicatamente. Le piastre possono essere lavate manualmente come segue: a. Rovesciare il contenuto della piastra in uno scarico. b. Capovolgere la piastra su carta assorbente picchiettando delicatamente. c. Con una multicanale, dispensare μL di tampone di lavaggio. d. Agitare la piastra delicatamente su una superficie piana. e. Ripetere a-d due volte. f. Ripetere a e b. 3. Dispensazione del coniugato Dispensare 0μL di coniugato in tutti i pozzetti. Rimuovere eventuali schizzi sulla superficie dei pozzetti con carta assorbente. Nota: Per evitare contaminazioni, non versare il coniugato in eccesso nuovamente nel flacone d origine. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. 4. Lavaggio Procedere come al punto Dispensazione del substrato (TMB) Dispensare 0µL di substrato TMB in tutti i pozzetti. Rimuovere eventuali schizzi sulla superficie dei pozzetti con carta assorbente. Nota: Per evitare contaminazioni, non versare il substrato in eccesso nuovamente nel flacone d origine. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al riparo dalla luce. 6. Dispensazione del bloccante Dispensare 0µL di soluzione bloccante in tutti i pozzetti. Il colore virerà dal blu al giallo. 7. Lettura delle densità ottiche Leggere le densità ottiche (DO) dei pozzetti a 450nm in un lettore per micropiastre, entro 30 minuti dalla dispensazione del bloccante. 8 RISULTATI E CONTROLLO QUALITÀ 8.1 DOSAGGI SEMI-QUANTITATIVI / SCREENING 1. Controllo qualità Per essere valido il dosaggio deve rispettare i seguenti requisiti: I calibratori/controllo cut-off (a seconda) e i controlli negativo e positivo devono essere inclusi in ogni seduta. I valori/do ottenuti per i controlli positivo e negativo devono rientrare nei range specificati sul Certificato QC. Solo per dosaggi semi-quantitativi - la forma della curva dovrà essere simile a quella riportata sul Certificato QC. Se non vengono rispettati i suddetti criteri, il dosaggio sarà invalidato e si dovrà ripetere la seduta. 2. Calcolo delle densità ottiche medie (solo per dosaggi in doppio) Calcolare la DO media delle due letture per ciascun calibratore, controllo e campione dispensato in doppio. Il CV% di ciascun replicato dovrà essere inferiore al 15%. 8.2 DOSAGGIO SCREENING INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI 1. Verifica qualità delle densità ottiche La DO del controllo positivo deve essere maggiore di 0,6 e maggiore della DO del controllo cut-off. La densità ottica del siero negativo deve essere minore di 0,3. La densità ottica del controllo cut-off deve essere maggiore della DO del controllo negativo. 2. Interpretazione dei risultati Utilizzando il controllo cut off, interpretare i risultati in base alla seguente tabella: RISULTATO INTERPRETAZIONE AZIONE DO maggiore del controllo cut-off DO minore o uguale al controllo cut-off Sospetta presenza di ASCA Negativo Dosare con il test semi-quantitativo se è richiesto il valore Riportare come negativo Insert Codes: E053.I, Version: 20 July 2006, Page 2 of 5

3 8.3 DOSAGGIO SEMI-QUANTITATIVO - CALCOLO DEI RISULTATI 1. Tracciare la curva di calibrazione La curva di calibrazione potrà essere tracciata in automazione o manualmente come segue, con la concentrazione degli autoanticorpi o IgA su scala log, rispetto alle DO su scala lin, per ciascun calibratore: In automazione utilizzare un software adeguatamente validato, scegliendo il fitting che meglio si adatta ai dati. Manualmente utilizzando carta log/lineare (semilogaritmica) tracciare una curva uniforme attraverso i punti (non una retta o una punto-punto). 2. Trattamento dei punti anomali Se uno dei punti fuoriesce dalla curva, questo potrà essere rimosso. Se in seguito a tale rimozione la curva assume una forma diversa rispetto a quella riportata sul Certificato QC o se più punti risultano fuorvianti, il dosaggio dovrà essere ripetuto. 3. Calcolo dei valori dei controlli Leggere i livelli degli autoanticorpi ASCA nei controlli direttamente sulla curva di calibrazione. I valori dei controlli dovrebbero rientrare nei range riportati sul Certificato QC. 4. Calcolo dei livelli anticorpali nei campioni prediluiti Leggere i livelli degli autoanticorpi ASCA nei campioni prediluiti direttamente sulla curva di calibrazione. Nota: I valori dei calibratori sono già corretti considerando un fattore 0 per la prediluizione 1:0 dei campioni. Non sono pertanto necessarie ulteriori correzioni. 5. Calibrazione del dosaggio Il dosaggio è calibrato in U/mL rispetto a un calibratore di riferimento interno arbitrario, in quanto non sono attualmente disponibili standard internazionali. 6. Limiti del dosaggio Un risultato negativo per gli o IgA non deve far escludere la presenza del Morbo di Crohn. Un risultato negativo per gli o IgA non deve portare ad escludere la presenza degli anticorpi ASCA, in quanto la loro concentrazione potrebbe essere inferiore al limite di rilevazione del dosaggio. Anche campioni provenienti da pazienti con morbo celiaco possono contenere anticorpi. Un risultato positivo indica soltanto la presenza di anticorpi verso S. cerevisiae e non denota necessariamente la presenza del Morbo di Crohn. Le caratteristiche di performance del test sono state verificate solamente su campioni di siero. Le prestazioni del dosaggio non sono state determinate su campioni pediatrici con Morbo di Crohn o su campioni di pazienti affetti da colite ulcerosa. I risultati di questi test devono essere considerati unitamente ad altre ricerche cliniche ed analisi serologiche. FDA (USA) Avvertenze: vedere la pagina iniziale delle instruzioni per l uso in Inglese. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Il range di normalità è stato determinato sul siero di 200 donatori sani adulti. I range rappresentano unicamente un parametro guida. I dosaggi ELISA risultano molto sensibili e in grado rivelare differenze minime nelle popolazioni dei campioni. Si raccomanda pertanto che ciascun laboratorio stabilisca i propri limiti di normalità, in base alla popolazione locale, alla strumentazione e alle tecniche impiegate. Risultato negativo 22,0 U/mL 7,0 U/mL Risultato positivo >22,0 U/mL >7,0 U/mL CARATTERISTICHE METODOLOGICHE.1 PRECISIONE PRECISIONE INTRA-SAGGIO La precisione intra-saggio è stata determinata su 6 campioni che rientravano nei range della curva di calibrazione e che sono stati testati 20 volte in duplicato. I CV% di ciascun campione sono qui di seguito riportati: n=20 Concentrazione CV % Campione 1 12,1 3,7 Campione 2 14,2 4,2 Campione 3 33,0 4,1 Campione 4 46,8 2,3 Campione 5 67,1 6,4 Campione 6 81,3 6,7 n=20 Concentrazione CV % Campione 1 2, 7,3 Campione 2 3,1 4,7 Campione 3,5 4,1 Campione 4 15,0 2,0 Campione 5 30, 4,7 Campione 6 67,8 2, PRECISIONE INTER-SAGGIO La precisione inter-saggio è stata determinate su 8 campioni clinici testati 6 volte in duplicato per tre giorni. I CV% di ciascun campione sono riportati di seguito: n=6 Conc. Numero di campioni Numero di campioni CV % n=6 Conc. IgG ASCA range di normalita IgG ASCA U/mL IgA ASCA range di normalita IgA ASCA U/mL CV % Campione 1,2 8, Campione 5 38,4 7,8 Campione 2 12,7,4 Campione 6 48,7 6,6 Campione 3 28,7 7,5 Campione 7 67, 7, Campione 4 37,0 8,8 Campione 8 80,0 4,7 n=6 Conc. CV % n=6 Conc. CV % Campione 1 2, 5, Campione 5,2 4,7 Campione 2 3,0 7,7 Campione 6 14, 7,2 Campione 3 6,5,2 Campione 7 63,2 7,3 Campione 4 6,6 12,0 Campione 8 8,4 7,3.2 RANGE DI NORMALITÀ Sono stati determinati i livelli e IgA nei sieri proveninenti da 200 donatori sani. I risultati sono illustrati nei seguenti grafici. campioni (il 5%) erano sopra al cut-off a 22 U/mL (ca. media + 2 DS). 3 campioni con valori di,2; 643,1 e 30, U/mL sono risultati positivi in un kit alternativo, mentre i rimanenti 7 campioni avevano valori tra 23,0-34,8 U/mL. Nessuno dei campioni era sopra al cut-off a 7,0 U/mL (ca. media + 5 DS). Tali range di normalità costituiscono unicamente un parametro guida. Si raccomanda che ciascun laboratorio determini i propri limiti di normalità. Insert Codes: E053.I, Version: 20 July 2006, Page 3 of 5

4 .3 SPECIFICITÀ, SENSIBILITÀ E CONCORDANZA Sono state determinate specificità, sensibilità e concordanza relative, rispetto a kit EIA alternativi per e IgA, utilizzando 120 campioni normali e 5 campioni di pazienti con Morbo di Crohn clinicamente accertato. Ulteriori 6 sieri provenienti da pazienti con colite ulcerosa sono stati inclusi in uno studio di incidenza riguardante GI. EIA alternativo + Zona dubbia* - BINDAZYME Percentuale concordanza positiva 70,2% Percentuale concordanza negativa 6,8% Concordanza totale 88,7% EIA alternativo + Zona dubbia* - BINDAZYME Percentuale concordanza positiva 1,4% Percentuale concordanza negativa 5,7% Concordanza totale 5,0% *I campioni nella zona dubbia dei kit alternativi (4 campioni) sono stati esclusi dal dosaggio..4 INCIDENZA DI POSITIVITÀ AD E IgA IN GRUPPI CON MALATTIE INFIAMMATORIE GI L incidenza degli ASCA è stata esaminata in 5 campioni provenienti da pazienti con Morbo di Crohn (CD) e colite ulcerosa (CU) clinicamente accertati ed è confrontata qui di seguito con l incidenza osservata nel range di normalità (qui sopra). Dei 31 campioni positivi sia per che IgA, 27 (87%) provenivano dal gruppo dei pazienti con Morbo di Crohn. BINDAZYME Risultato ASCA EIA Gruppo N = IgG Morbo di Crohn IgA IgG o IgA IgG e IgA 5 44% (46) 37% (3) 55% (58) 26% (27) CU 6 14% (13) 6% (6) 17% (16) 3% (3) Normali 120 5% (6) 3% (4) 8% () 1% (1) L incidenza dei risultati positivi nel gruppo di campioni normali conferma l incidenza riportata nello studio relativo al range di normalità..5 INCIDENZA DI POSITIVITÀ AD E IgA IN GRUPPI CON ALTRE MALATTIE.7 RANGE DI MISURAZIONE Il range di misurazione del dosaggio è tra 1,23-0 U/mL..8 SOSTANZE INTERFERENTI Sostanze interferenti varie sono state aggiunte a un campione ASCA a titolo elevato e uno a titolo basso, che sono stati susseguentemente dosati. Il metodo utilizzato per verificare tali sostanze si basa sull Interference Check A plus - Kokusai Shiyaku, Giappone, mentre per il fattore reumatoide è stato impiegato materiale Cliniqa, CA, USA. Sostanza Bilirubina F (libera) Bilirubina C (coniugata) Emoglobina emolizzata Chilo Fattore reumatoide Concentrazione 18,6mg/dL 22,4mg/dL 480mg/dL 1670 unità 113,5 IU/mL Non si sono riscontrate interferenze nei campioni dosati. 11 BIBLIOGRAFIA 1. Vermeire S et al. Comparative study of ASCA (Anti-Saccharomyces cerevisiae antibody) assays in inflammatory bowel disease: Gastroenterology. 2001; 120: Rutgeerts P, Vermeire S. Serological diagnosis of inflammatory bowel disease Lancet. 2000; 356; Peeters M et al. Diagnostic value of Anti-Saccharomyces cerevisiae and antineutrophil cytoplasmic autoantibodies in inflammatory bowel disease. Am J Gastroenterol.2001;6: Quinton J-F et al. Anti-Saccharomyces cerevisiae mannan antibodies combined with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibodies in inflammatory bowel disease: prevalence and diagnostic role Gut.18; 42: Joossens S et al. The value of serologic markers in indeterminate colitis: a prospective follow-up study. Gastroenterology. 2002; 122: Conrad K et al. Serological differentiation of inflammatory bowel diseases. Eur J Gastroenterol Hepatol 2002 ;14: Damoiseaux JGMC et al. Diagnostic value of anti-saccharomyces cerevisiae and antineutrophil cytoplasmic antibodies for inflammatory bowel disease: high prevalence in patients with celiac disease. J Clin Immunology. 2002;22: Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield Muratori P, Muratori L, Guidi M, Maccariello S, Pappas G, Ferrari R, Gionchetti P, Campieri M, Bianchi FB. Anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies (ASCA) and autoimmune liver diseases. Clin exp Med : Riente L, Chimenti D, Pratesi F, Delle Sedie A, Tommasi S, Tommasi C, Bombardieri S, Migliorini P. Antibodies to tissue transglutaminase and Saccharomyces cerevisiae in ankylosing spondylitis and psoriatic arthritis. J Rheumatol :5: SCHEMA PIASTRA Vedi sul retro della metodica. Malattia Epatite tipo 1 autoimmune 23% (7/30) Epatite tipo 2 11% autoimmune (4/37) Cirrosi primaria 7% biliare (7/6) AMA* positivo Cirrosi primaria 35% biliare (6/17) AMA* negativo Colangite 28% primaria (7/25) sclerosante Spondilite 12% anchilosante (5/43) Artrite psoriatica 5% (4/75) Artrite % reumatoide (8/7) Morbo celiaco 32% (12/37) *AMA, anticorpi antimitocondriali. 20% (6/30) 5% (2/37) 16% (17/6) 35% (6/17) 32% (8/25) 23% (/43) % (7/75) 18% (14/7) 30% (11/37) e IgG 17% (5/30) 5% (2/37) 4% (4/6) 18% (3/17) 16% (4/25) 1% (7/37) Rif. 7 Riassunto del metodo 1. Dispensare 0μL di ciascun controllo e calibratore pronto per l uso e dei campioni diluiti 1:0 nei rispettivi pozzetti. Lavare. 2. Dispensare 0μL di coniugato in tutti i pozzetti. Lavare. 3. Dispensare 0μL di substrato in tutti i pozzetti. 4. Dispensare 0μL di soluzione bloccante in tutti i pozzetti. Misurare l assorbanza a 450nm. BINDAZYME è un marchio registrato da The Binding Site Ltd. P.O. Box 11712, Birmingham B14 4ZB. England.6 SENSIBILITÀ ANALITICA La sensibilità è stata determinata come concentrazione media + 2 DS, su 20 determinazioni del diluente dei campioni. Dosaggio Sensibilità 0,61 U/mL 0,3 U/mL Insert Codes: E053.I, Version: 20 July 2006, Page 4 of 5

5 Schema piastra A B C D E F G H Insert Codes: E053.I, Version: 20 July 2006, Page 5 of 5