IL MODELLO DELL OPERON

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1 IL MODELLO DELL OPERON

2 La regolazione genica nei procarioti

3 I microrganismi presentano sorprendenti capacità di adattamento a diverse condizioni ambientali Questa capacità di adattarsi, e quindi di crescere, risiede nella capacità di esprimere velocemente i geni necessari a far fronte a specifici stimoli ambientali VANTAGGIO: risparmio energetico, quindi una crescita più veloce e migliore utilizzo delle risorse disponibili GENI sono sempre espressi nella cellula, geni essenziali per la cellula (ad esempio rrna, trna, proteine ribosomali, RNA polimerasi, ecc) COSTITUTIVI la loro attività è controllata in risposta alla necessità REGOLATI

4 Per regolare l espressione genica 1. Devono riconoscere le condizioni ambientali nelle quali attivare o reprimere l espressione di specifici geni 2. Devono essere in grado di attivare o reprimere l espressione cordinata di specifici geni o gruppi di geni

5 A che livello può agire la regolazione nei procarioti? DNA trascrizione mrna traduzione proteina controllo della trascrizione controllo della stabilità dei trascritti controllo della traduzione controllo della stabilità della proteina controllo dell attività proteica

6 Controllo delle proteine per l utilizzo di zuccheri I batteri possono utilizzare diversi zuccheri come fonte di carbonio e di energia (glucosio, lattosio, arabinosio, xylosio, ecc.) Le proteine necessarie per il metabolismo dello zucchero comprendono quelle che favoriscono l ingresso dello zucchero nella cellula quelle che catalizzano i passaggi di degradazione dello zucchero

7 Regolazione del catabolismo del lattosio in E. coli Il metabolismo del lattosio è stato studiato in dettaglio negli anni 1950 da François Jacob e Jacques Monod La loro descrizione del sistema di controllo della trascrizione è stata una scoperta di enorme valore scientifico che è valso loro il premio Nobel nel 1965

8 E. coli può crescere in un terreno minimo contenente glucosio I geni del metabolismo del glucosio sono costitutivi, la glicolisi è un processo fondamentale Se al terreno minimo viene aggiunto lattosio, al posto del glucosio, E. coli sintetizza gli enzimi utili per metabolizzare questo zucchero

9 Enzimi indotti dal lattosio β-galattosidasi (gene lacz) che scinde il lattosio in galattosio e glucosio catalizza l isomerizzazione del lattosio in allolattosio Lattosio permeasi (gene lacy) per promuovere il passaggio del lattosio all interno della cellula la β-galattoside transacetilasi (gene laca) trasferisce un gruppo acetilico ai β-galattosidi, ma la sua funzione è ancora poco chiara QUESTI GENI SONO DETTI GENI STRUTTURALI

10 Jocob e Monod studiarono le mutazioni che alterano il metabolismo del lattosio Mutazioni nei 3 geni strutturali (lacz, lacy e laca) le mutazioni nei geni lacz, lacy, laca furono mappate con tecniche classiche I tre geni sono strettamente concatenati e l ordine lacz lacy laca I tre geni sono trascritti in un unico mrna detto policistronico o poligenico Mutazioni che influenzavano la regolazione di tutti e 3 i geni strutturali Mutanti costitutivi i geni strutturali sono sempre espressi, sia in presenza che in assenza di lattosio Mutanti che bloccano l espressione dei geni strutturali anche quando è presente il lattosio

11 Mappatura dei mutanti costitutivi Sono state identificate due classi: 1 a classe: mappava in una regione piccola a monte del gene lacz che chiamarono operatore (laco) 2 a classe: mappava a monte dell operatore in un gene che chiamarono laci, che codifica per il repressore

12 Struttura della regione genomica Essi coniarono il termine di OPERONE per indicare un cluster di geni che svolgono funzioni correlate e che sono regolati in modo coordinato

13 Come potrebbe essere regolata la trascrizione di geni inducibili?

14 REGOLAZIONE Vie CATBOLICHE o di degradazione (lac) INDUCIBILI Vie ANABOLICHE o di biosintesi (trp) REPRIMIBILI GENE REGOLATORE ATTIVATORI REPRESSORI legano una regione regolativa in base alla presenza di MOLECOLE EFFETTRICI INDUTTORI CO-REPRESSORI Influenzano la struttura tridimensionale dei regolatori

15 SISTEMI INDUCIBILI: REGOLAZIONE POSITIVA

16 SISTEMI INDUCIBILI: REGOLAZIONE POSITIVA INDUTTORE ASSENTE INDUTTORE PRESENTE INDUTTORE

17 SISTEMI INDUCIBILI: REGOLAZIONE NEGATIVA

18 SISTEMI INDUCIBILI: REGOLAZIONE NEGATIVA INDUTTORE operatore

19 Per meglio definire il ruolo di ciascun componente dell operone Jacob e Monod si servirono di ceppi parzialmente diploidi Utilizzarono ceppi F che portavano alcuni geni dell operone sul fattore di fertilità F Poterono definire quali mutazioni sono dominanti e quali recessive Formulare ipotesi circa il ruolo svolto da ciascuna regione dell operone

20 Diploide parziale per mutazioni laco c GENOTIPO: laci + P O + Z - Y + F laci + P O c Z + Y laci + P O + Z Y + CROMOSOMA BATTERICO PLASMIDE F CELLULA BATTERICA

21 laci + P O + Z Y + F laci + P O c Z + Y SENZA INDUTTORE CON INDUTTORE β-galattosidasi + + permeasi (sintesi della forma mutata) + Il gene Lac Z è espresso in modo costitutivo Il gene Lac Y è soggetto a controllo inducibile SI PUO DEDURRE CHE UNA MUTAZIONE laco c ALTERA SOLO I GENI A VALLE SULLA STESSA MOLECOLA DI DNA QUESTO TIPO DI MUTAZIONI SONO DETTE CIS-DOMINANTI L operatore NON CODIFICA PER UN PRODOTTO DIFFUSIBILE altrimenti uno dei due alleli controllerebbe tutti i geni per l utilizzo del lattosio

22 Diploide parziale per mutazioni laci GENOTIPO: laci + P O + Z Y + F laci P O + Z + Y laci + P O + Z Y + CROMOSOMA BATTERICO PLASMIDE F CELLULA BATTERICA

23 laci + P O + Z Y + F laci P O + Z + Y β-galattosidasi permeasi SENZA INDUTTORE L espressione di entrambi i geni è inducibile laci + nella cellula è dominante su laci DATO CHE I GENI laci SI TROVANO SU MOLECOLE DIVERSE DI DNA (configurazione in trans) LA MUTAZIONE laci + E DETTA TRANS-DOMINANTE SU laci Jacob e Monod ipotizzarono quindi che il gene laci codificasse per un REPRESSORE DIFFUSIBILE nella cellula

24 IL MODELLO DI REGOLAZIONE NEGATIVO PROPOSTO DA JACOB E MONOD IN ASSENZA DI LATTOSIO

25 IN PRESENZA DI LATTOSIO

26 Il modello spiega i mutanti trovati? I MUTANTI laco c IN ASSENZA DI LATTOSIO

27 I MUTANTI COSTITUTIVI laci-

28 Il modello proposto per i diploidi parziali GENOTIPO laci + P O + Z - Y + A + F laci + P O c Z + Y - A + IN ASSENZA DI LATTOSIO SENZA INDUTTORE β-galattosidasi + permeasi (sintesi della forma mutata)

29 laci + P O + Z - Y + A + GENOTIPO F laci + P O c Z + Y - A + IN PRESENZA DI LATTOSIO CON INDUTTORE β-galattosidasi + permeasi +

30 Il secondo diploide parziale analizzato GENOTIPO laci + P O + Z Y + A + F laci P O + Z + Y A + IN ASSENZA DI LATTOSIO β-galattosidasi permeasi SENZA INDUTTORE

31 GENOTIPO laci + P O + Z Y + A + F laci P O + Z + Y A + IN PRESENZA DI LATTOSIO CON INDUTTORE β-galattosidasi + permeasi +

32 I mutanti di regolazione identificati GENE MUTAZIONE FENOTIPO laci laci - sintesi costitutiva dei 3 enzimi laco laco c sintesi costitutiva dei 3 enzimi laci laci s nessuna sintesi anche in presenza di lattosio lacp lacp - nessuna sintesi anche in presenza di lattosio La mutazione laci s (superrepressore) Nei diploidi parziali (laci + /laci s ) laci s è TRANS-DOMINANTE bloccando la sintesi dei geni strutturali su entrambe le copie dell operone

33 L operone lattosio ha anche un sistema di regolazione positiva Questo sistema di regolazione assicura che i geni dell operone lattosio siano espressi ad alti livelli solo se i lattosio è l unica fonte di carbonio e se non è presente anche il glucosio Il glucosio è preferito perché può essere direttamente utilizzabile nella glicolisi per produrre energia Gli altri zuccheri devono essere convertiti in glucosio prima di poter essere utilizzati queste conversioni richiedono energia

34 Il modello di regolazione positiva dell operone lattosio di E.coli CAP camp (AMPciclico) (Catabolite Activator Protein) RNA polimerasi La proteina regolatrice CAP sente la presenza di glucosio nella cellula legandosi al camp la cui concentrazione è inversamente correlata alla quantità di glucosio nella cellula Il legame del camp alla proteina CAP aumenta l affinità di questo complesso con un sito adiacente a lacp Il legame del complesso CAP-cAMP al DNA favorisce il legame della RNA polimerasi al promotore CAP e camp mantengono gli operoni dell arabinosio e del galattosio

35 Gli operoni sono molto comuni nei Permettono di: procarioti regolare contemporaneamente più geni coinvolti nello stesso metabolismo mantenere i rapporti dei trascritti bilanciati rispondere velocemente alle variazioni ambientali Altri esempi di operoni: triptofano arabinosio

36 L operone triptofano Operone reprimibile negativo trpr P O trpe trpd trpc trpb trpb repressore attivo repressore inattivo triptofano Acido Corismico->Triptofano L operone è sotto il controllo negativo del repressore codificato dal gene trpr Il triptofano agisce come corepressore, attivando il repressore e bloccando la trascrizione

37 L operone triptofano L attenuazione della trascrizione trpr P O leader trpe trpd trpc trpb trpb 162 nt codoni trp mrna peptide leader (14AA) attenuatore Se deleta la sequenza leader determina incremento di espressione dell operone trp Senza effetti sulla reprimibilita dell operone.

38 L operone triptofano L attenuazione della trascrizione trpr P O leader trpe trpd trpc trpb trpb 162 nt codoni trp mrna peptide leader (14AA) Attenuatore Seq. palindroma ricca in G:C seguita da coppie A:T Secondo livello di regolazione -> attenuazione In presenza di trna trp carico di triptofano causa la terminazione prematura della trascrizione dell operone-> trascritto tronco (140nt)

39 Trascrizione di questa sequenza e dei segnali di terminazione della seq attenuatore mrna UUUUUUU Attenuatore (terminatore della trascrizione) RNA nascente che puo formare una struttura a forcina seguita da alcuni uracili Avviene un cambiamento conformazionale nell RNApolimerasi associata causando la terminazione della trascrizione MA..Se al segmento 1 viene impedito di appaiarsi con il segmento 2, quest ultimo si appaia con il segmento 3. Il 4 rimane singolo e non si forma il terminatore TRASCRIZIONE ATTIVA E la presenza del trp come influenza l attenuazione? 4

40 Il comportamento del ribosoma durante la traduzione del peptide leader regola l attività della RNA polimerasi NB:Nei procarioti trascrizione e traduzione avvengono contemporaneamente peptide leader AUG 1 UGA mrna Se è presente sufficiente triptofano il ribosoma sintetizzerà il peptide leader arrivando fino al codone di stop. Il ribosoma sporge sul segmento 2 impedendogli l appaiamento con il segmento AUG 1 UGA 2 PRESENZA TRIPTOFANO -> Forcina di Terminazione ->OPERONE TRP NON TRASCRITTO

41 Il comportamento del ribosoma durante la traduzione del peptide leader regola l attività della RNA polimerasi peptide leader AUG 1 UGA mrna Se manca il triptofano, il ribosoma si fermerà in corrispondenza dei 2 codoni trp adiacenti impedendo al segmento 1 di appaiarsi con 2. Il segmento 2 si associa con il segmento AUG 1 UGA 4

42 PRESENZA TRIPTOFANO -> ATTENUAZIONE ->OPERONE trp ATTENUATO La polimerasi termina la trascrizione FORCINA DI TERMINAZIONE ASSENZA TRIPTOFANO -> LOOP ->OPERONE trp NON ATTENUATO La polimerasi continua 2 3

43 Agendo insieme, repressione e attenuazione possono coordinare la velocità di sintesi degli enzimi biosintetici per gli amminoacidi con la disponibilità degli amminoacidi e la velocità globale della sintesi proteica. Quando il triptofano è presente ad alte concentrazioni, qualsiasi RNA polimerasi non bloccata dal repressore probabilmente non oltrepasserà la sequenza dell attenuatore. La repressione riduce la trascrizione di circa 70 volte e l attenuazione la riduce ulteriormente di 8-10 volte: quando entrambi i meccanismi operano insieme, la trascrizione può essere ridotta di circa 600 volte. Sembra che l attenuazione abbia un ruolo importante nella regolazione della biosintesi di molti amminoacidi