6CO 2 + 6H 2 O C 6 H 12 O 6 + 6O 2

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1 FOTOSINTESI utilizzazione energia della luce da parte delle piante, alghe e procarioti per sintetizzare composti organici 6CO 2 + 6H 2 O C 6 H 12 O 6 + 6O 2

2 Oltre al cibo alla biomassa e ai combustibili fossili la fotosintesi delle piante produce come prodotto secondario l ossigeno richiesto per l attività respiratoria di tutti gli organismi multicellulari e di molti unicellulari

3 La fotosintesi comprende una serie complessa di reazioni che coinvolgono l assorbimento della luce, la conversione dell energia, il trasferimento elettronico, e una via composta di molte tappe enzimatiche che converte CO 2 e H 2 O in carboidrati

4 FOTOSINTESI 6CO 2 + 6H 2 O C 6 H 12 O 6 + 6O 2 L acqua è ossidata e gli elettroni rilasciati vengono energizzati e infine trasferiti alla CO 2 con produzione di ossigeno e di carboidrati

5 esiste anche una fotosintesi anossigenica (solfobatteri purpurei) 6CO 2 + 6H 2 S C 6 H 12 O 6 + 6S 2

6 Il tessuto fotosintetico più attivo nelle piante superiori è rappresentato dal mesofillo fogliare. Le cellule del mesofillo possiedono un gran numero di cloroplati che contengono i pigmenti verdi: le clorofille, specializzati nell assorbimento della luce

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8 il cloroplasto un plastidio specializzato. (si ritiene che il cloroplasto delle piante sia derivato dall associazione endosimbiotica di una cellula protoeucariotica e di un batterio fotosintetico correlato ai moderni cianobatteri)

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10 Sistema di endomembrane del Cloroplasto

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12 captazione energia della luce produzione ATP e NADPH

13 H 2 O + NADP + + Pi +ADP ½O 2 + NADPH + H + + ATP

14 utilizzazione NADPH e ATP per la riduzione CO 2 e la sintesi di zuccheri

15 CO 2 + NADPH + H + + ATP C 6 H 12 O 6 + NADP + + ADP + Pi

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17 Concetti base fondamentali per comprendere il processo fotosintetico Uno dei maggiori progressi della fisica del ventesimo secolo è stata la scoperta che la luce, una forma di radiazione elettromagnetica, ha proprietà sia delle onde che delle particelle.

18 λ = c/ν La luce è un onda trasversale elettromagnetica, che consiste in campi elettrici e magnetici oscillanti perpendicolarmente gli uni rispetto agli altri e alla direzione di propagazione dell onda. Un onda è caratterizzata da una lunghezza d onda λ (lambda) che è la distanza fra due picchi successivi nell onda. La frequenza, rappresentata dalla lettera greca ni (ν) è il numero di picchi che intercorrono in un determinato tempo

19 La luce è anche una particella, che chiamiamo fotone. Ogni fotone contiene una determinata quantità di energia chiamata quanto. L energia (E) di un fotone dipende dalla frequenza della luce secondo la relazione: E = hν legge di Plank

20 Spettro elettromagnetico Esiste una relazione inversa fra la lunghezza d onda e la frequenza. La luce a lunghezza d onda corta (ad alta frequenza) possiede un alto contenuto energetico, mentre la luce a lunghezza d onda lunga (bassa frequenza) ha un basso contenuto energetico

21 Sensibilità dei nostri occhi = regione del visibile

22 il sole è una sorgente di fotoni a diversa frequenza diversa energia La clorofilla a assorbe fortemente nelle regioni del blu (430 nm) e del rosso (circa 660 nm). La clorofilla appare verde ai nostri occhi poiché assorbe la luce nelle regioni rosso e blu dello spettro, riflettendo così ai nostri occhi solo la luce verde.

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24 Gruppo metilico Gruppo formile Le molecole di clorofilla hanno una struttura di tipo porfirinico che contiene un atomo centrale di Mg collegato ai quattro anelli pirrolici. Le clorofille contengono anche una lunga catena idrocarburica che rende le molecole idrofobiche. Varie clorofille differiscono per i loro sostituenti attorno alla struttura ad anello.

25 biosintesi della clorofilla 2 molecole sono condensate 4 molecole reagiscono Punto di biforcazione comune alla sintesi di eme e clorofille ad opera di una chelatasi specifica

26 Varie clorofille differiscono per i loro sostituenti attorno alla struttura ad anello

27 Xatonfille

28 carotenoidi

29 I carotenoidi e le xantofille giocano un ruolo importante nel proteggere l apparato fotosintetico dal danno ossidativo

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34 La clorofilla (chl) nel suo stato energetico minore, o stato basale, assorbe un fotone e passa a un livello energetico superiore o stato eccitato (chl*) Chl+ hν Chl*

35 gli stati di singoletto e tripletto sono definiti dallo spin degli elettroni esterni Nelle molecolole possono esistere due tipi di stati eccitati. Il cosiddetto stato di singoletto ha vita relativamente breve e contiene elettroni con spin opposti (antiparalleli); lo stato di tripletto, che ha una vita molto più lunga, ha elettroni con spin allineati (paralleli)

36 l eccitazione di un elettrone in una molecola porta l elettrone a uno o l altro degli stati energetici distinti

37 Chl + hν Chl*

38 nel secondo stato eccitato la Chl è altamente instabile perdita energia (calore) I stato

39 nel I stato eccitato la Chl è stabile per 10-9 s. A causa di questa instabilità inerente dello stato eccitato ogni processo volto a catturarne l energia dovrà essere estremamente rapido. Nello stato di minor eccitazione, la clorofilla eccitata ha numerose vie possibili di dissipazione dell energia disponibile. FLUORESCENZA. La Chl emette un fotone e torna al suo stato basale CALORE. La Chl torna al suo stato basale senza emettere fotoni TRASFERIMENTO DI ENERGIA. La Chl trasferisce la sua energia ad un altra molecola REAZIONE FOTOCHIMICA. L energia dello stato eccitato viene utilizzata per permettere che avvengano reazioni chimiche

40 la reazione fotochimica è velocissima resa quantica di un processo = Φ = numero di molecole eccitate che decadono attraverso un determinato processo Resa quantica del processo fotochimico è dato Φ = resa prodotti fotochimici/n. totale quanti assorbiti Φ fotochimica = 0.95 Φ fluorescenza = 0.05 La somma delle rese quantiche di tutti i processi possibili è 1.0 La maggior parte delle molecole di clorofilla eccitate porta quindi al processo fotochimico

41 Φ O 2 = 0.1 per la produzione di una molecola di O 2 sono necessari 10 quanti di luce richiesta quantica = 1/ Φ =10

42 Nello stato basale la molecola è un debole agente riducente (perde elettroni da un orbitale a bassa energia) e un debole agente ossidante (accetta elettroni solo in un orbitale ad alta energia). Durante lo stato eccitato la situazione è capovolta e un elettrone può essere perso dall orbitale ad alta energia, rendendo la molecola un agente riducente estremamente potente

43 la maggior parte dei pigmenti funzionano come un antenna dove avvengono le reazioni chimiche che portano all accumulo a lungo termine dell energia

44 NELLA FOTOSINTESI DUE FOTOSISTEMI OPERANO IN SERIE

45 Effetto caduta nel rosso l effetto non è dovuto al fatto che l assorbimento diminuisce, poiché la resa quantica misura solo la luce assorbita ma, la luce con lunghezza d onda maggiore di 680 nm è molto meno efficace di quella a lunghezze d onda inferiori

46 EFFETTO DI AMPLIFICAZIONE La velocità della fotosintesi in presenza contemporanea di luce rossa e rosso lontano è superiore alla somma delle velocità ottenute dalle singole lunghezze d onda. Questo esperimento fornì una prova basilare al concetto che la fotosintesi è condotta da due sistemi fotosintetici che lavorano in tandem, ma che possiedono dei valori ottimali di lunghezza d onda leggermente differenti

47 principali complessi proteici dei tilacoidi FOTOSISTEMA I FOTOSISTEMA II CITOCROMO b 6 f ATP sintasi

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50 I fotosistemi I e II sono spazialmente separati all interno della membrana tilacoidale Tale separazione può essere interpretata nella regolazione dell input di energia luminosa ai due fotosistemi non è richiesta una stechiometria 1:1 il fotosistema II è in eccesso 1:5:1 PSI:PSII:citb 6 f il rapporto può cambiare in funzione delle condizioni ambientali

51 le piante C4 hanno un eccesso di fotosistema I (cellule della guaina del fascio)

52 La funzione dei sistemi antenna è di cedere energia in maniera efficace ai centri di reazione ai quali sono associati

53 i sistemi antenna inviano l energia ai centri di reazione molecole Chl per centro di reazione diverse centinaia di carotenoidi trasferimento di energia per risonanza. L energia di eccitazione viene trasferita da una molecola all altra per mezzo di un processo radiante (es. del diapason) il 99% dei fotoni assorbiti dai pigmenti antenna raggiunge il centro di reazione processi fotochimici

54 Trasferimento di energia per risonanza tra Clb e Cla fornisce l irreversibilità al processo Lo stato energetico eccitato dei pigmenti aumenta con la distanza dal centro di reazione; cioè, i pigmenti che sono più vicini al centro di reazione posseggono minor energia di quelli che sono più lontani. Questo gradiente energetico assicura che il trasferimento di eccitazione verso il centro di reazione sia energeticamente favorevole e che venga sfavorito il trasferimento di eccitazione in direzione inversa verso le parti periferiche dell antenna.

55 Complessi antenna possiedono un motivo strutturale comune Proteine del complesso II per la cattura della luce l LHC II Struttura è stata determinata attraverso tecniche cristallografiche Il complesso è un pigmento transmembrana, con strutture ad elica. Al complesso sono associate molecole di clorofilla a e b e numerosi carotenoidi. Discendono quasi sicuramente da una comune proteina antenna. Clorofilla a Clorofilla b carotenoidi

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57 L organizzazione della clorofilla nel PSI e PSII Il modello mostra l associazione di ciascun complesso che lega la clorofilla con il PSI e PSII. Nel PSII un core di proteine leganti clorofilla a e b, dette CP43 e CP47, associate strettamente al centro di reazione; fanno anche parte della struttura numerose proteine leganti clorofilla a e b, o complessi LHC-II. Nel PSI il complesso del core contiene circa 90 molecole di clorofilla a, altre molecole di clorofilla sono presenti nei complessi LCH-I, i quali contengono sia clorofilla a sia b.

58 Struttura ai raggi X del centro di reazione del batterio fotosintetico Rhodopseudomonas viridis Huber 1980: premio nobel La componente proteica del complesso è formata da quattro peptidi separati. Due di essi, definiti L e M si l e g a n o a l l e batterioclorofille, ai chinoni e ai carotenoidi, cofattori del complesso. La struttura ha una simmetria doppia rispetto ad un asse perpendicolare al piano della membrana, suggerendo una natura dimerica del centro di reazione.

59 Modello strutturale del centro di reazione del PSII Il centro di reazione PSII è dominato da due subunità D1 e D2(alcune sequenze sono simili ai peptidi L e M dei batteri purpurei). CP43 e CP47 proteine leganti la clorofilla a. IL P680 è ridotto da Z (e- derivante dall ossidazione dell acqua), un residuo di tirosina nella subunità D1.

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61 LO SCHEMA Z Il diagramma a Z mostra la cooperazione di PSI e PSII nel trasferire gli elettroni dall acqua al NADP +. Alla luce il PSII genera un forte ossidante, capace di ossidare l acqua, e un riducente. Se illuminato, invece, il PSI genera un riducente forte capace di ridurre il NADP +, e un ossidante debole. I due fotosistemi sono legati da una catena di trasporto elettronico, che permette alla specie ossidante del PSI di ricevere elettroni dalla specie riducente del PSII

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63 L ossidazione dell acqua coinvolge una complessa serie di reazioni nel PS-II L acqua è una molecola molto stabile. L ossidazione dell acqua per formare ossigeno molecolare è molto difficile ed il complesso fotosintetico per lo sviluppo di ossigeno è l unico sistema biochimico noto e capace di compiere questa reazione l apparato di evoluzione dell ossigeno esiste in diversi stati di ossidazione

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65 serie di flash produzione O 2 cloroplasti al buio l O 2 viene prodotto al III flash e ogni 4 flash successivi

66 lo stato S4 è l unico in grado di ossidare l acqua Stato altamente ossidato

67 le reazioni sono complicate da: buchi (un lampo che non riesce a ossidare il P680 colpi doppi (un lampo che ossida il P680 due volte) rilassamenti (decadimenti degli stadi S2 e S3 allo stato S1 al buio)

68 qual è la natura biochimica del complesso che evolve l ossigeno? alghe e cloroplasti isolati carenza di manganese = no O 2 studi spettroscopici atomi di Mn associati a D1 il cloro e il calcio sono implicati il cluster del manganese Il Mn è il principale accumulatore di cariche

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71 il legame tra il P680 + e il cluster del Mn non è diretto Z = residuo di tirosina della proteina D1

72 Feofitina È una molecola di clorofilla in cui l atomo centrale di magnesio è rimpiazzato da due atomi di idrogeno È il primo accettore elettronico, riceve elettroni dal centro di reazione P680 e li trasferisce a due plastochinoni.

73 plastochinone

74 un elettrone è trasferito dalla feofitina a Q A Q A - (plastosemichinone) l elettrone passa da Q A a Q B Q A - diventa Q A un secondo elettrone passa dalla feofitina a Q A Q A diventa Q A - l elettrone passa da Q A - a Q B - Q B 2- Q B H + Q B H 2 (idrochinone)

75 l idrochinone si dissocia dal PS-II e diffonde attraverso la membrana plasmatica dove a sua volta trasferisce i suoi elettroni al complesso citocromo b 6 f riduzione citocromo b 6 f i due protoni vengono presi dallo stroma

76 plastochinone citocromo b 6 f

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78 CITOCROMO b 6 f È una grande proteina costituita da molte subunità e possiede numerosi gruppi prostetici, contiene due emi di tipo b un eme di tipo c. Il complesso contiene una ferro-zolfo proteina di Rieske in cui i due atomi di ferro sono collegati da due atomi di zolfo

79 Il gruppo protoeme si trova nei citocromi di tipo b, mentre il gruppo eme c nei citocromi di tipo c. Il gruppo eme c è legato covalentemente alla proteina tramite legami tioetere, attraverso due residui cisteinici della proteina, mentre il gruppo protoeme non è legato covalentemente alla proteina. Nei citocromi ridotti l atomo di Fe è nello stato di ossidazione 2+, mentre passa allo stato di ossidazione 3+ nei citocromi ossidati

80 Struttura della proteina Fe-S di Rieskie La figura mostra i due ligandi di cisteina coordinano un atomo di ferro del centro 2Fe-2S, e due ligandi di istidina legano l altro atomo di ferro

81 CICLO Q ossidazione plastochinone un elettrone va verso il PS-I un elettrone innesca un processo ciclico plastocianina = proteina solubile contenente rame

82 Plastosemichinone ridotto Plastochinolo ridotto plastochinone Sito chinonico Emi del citocromo Sito chinolico per la formazione di PQH 2 vengono utilizzati due protoni dello stroma Tappa limitante del trasporto elettronico

83 il PS-II funziona come un acquaplastochinone ossidoreduttasi dipendente dalla luce

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85 Modello strutturale del centro di reazione del PSI Lo schema mostra l organizzazione delle due proteine maggiori di questo complesso, le subunità psaa e psab. Gli elettroni sono trasferiti dal P700 a una molecola di clorofilla A0, poi all accettore di elettroni A1, il fillochinone. Il trasporto degli elettroni procede poi attraverso una serie di centri Fe-S indicati come Fx, Fa, Fb, e infine alla proteina ferro zolfo solubile, ferredossina (Fdx). Il p700+ riceve i suoi elettroni dalla plastocianina ridotta.

86 Organizzazione dei trasportatori di elettroni nel centro di reazione del PSI cianobatterico

87 Trasportatori elettronici del PSI PsaA PsaB P700 Ao = Chl A A1 = fillochinone Fe-S F X F A F B Ferredossina proteina solubile Fe-S accettore finale (forte riducente) localizzata nello stroma del cloroplasto.

88 La ferredossina Questo trasportatore elettronico non trasferisce elettroni direttamente al NADP +, ma attraverso l intermedio dell enzima detto ferredossina-nadp + reduttasi (FNR) L FNR è un enzima contenente FAD che può essere ridotto in due tappe di un singolo elettrone ciascuna serve a ridurre il NADP + in NADPH

89 il PS-I funziona come una plastocianina-ferredossina ossidoreduttasi luce-dipendente

90 durante la riduzione del NADP + a NADPH un protone viene prelevato dallo stroma

91 la distribuzione dell energia è controllata dalla fosforilazione di LHC-II durante il trasporto elettronico il plastochinone ridotto (PQH 2 ) viene accumulato, attiva una chinasi che fosforila LHC-II si ha un disimpilamento della membrana a causa della repulsione elettrostatica migrazione di LHCII riduzione efficienza PSII favorendo l attivazione del PS-I che causa l ossidazione di PQH 2 si attiva una fosfatasi LHC-II si defosforila LHC-II migra verso il PS-II

92 esiste anche una catena di trasporto ciclico di elettroni PSI riduce la Fdx Fdx red riduce il PQ PQH 2 riduce il cit b 6 f SI ATP NO NADPH

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95 Oltre all energia accumulata come equivalenti redox (NADPH) attraverso le reazioni luminose, una parte dell energia fotonica viene catturata sotto forma di legame fosfato ad alta energia nella molecola di ATP. Meccanismo chemiosmotico (Mitchell): La differenza di concentrazione di protoni attraverso la membrana, viene utilizzata per sintetizzare ATP

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98 ATP sintasi CF 1 α 3, β 3, γ, δ, ε CF 0 a, b, b, c 12 Altamente idrofobica

99 Modello per il complesso dell ATP sintasi La struttura delle subunità dell ATP sintasi indica l esistenza di due regioni principali nella proteina: u n a p o r z i o n e p r o t e i c a integrale della membrana (CF0 contiene quattro subunità diverse), che funziona da canale per i protoni che passano attraverso la membrana e una porzione intrinseca (CF1), che consiste in due domini grandi: α e β, più tre subunità più piccole. Il CF1 contiene il sito catalitico coinvolto nella sintesi dell ATP

100 Meccanismo dello scambio di legame per la sintesi di ATP aperto lasco Sito di legame forte per i nucleotidi Boyer 1997: premio Nobel per la chimica

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104 Meccanismi di protezione e riparazione del danno da eccesso di fotoni Prima linea di difesa: soppressione del danno tramite l estinzione del processo di eccitazione con produzione di calore. Seconda linea di difesa: produzione di sostanze o sistemi di salvataggio Terza linea di difesa: distacco e degradazione della proteina D1 danneggiata dalla fotoinibizione, con l inserimento di una nuova proteina D1 appositamente sintetizzata e reinserita nel centro di reazione del PSII per riformare un unità funzionante.