La Nuova Generazione di Analisi e Preparazione dei Campioni di N-Glicani [SOLUZIONI PER L'ANALISI DEI GLICANI]

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1 La Nuova Generazione di Analisi e Preparazione dei Campioni di N-Glicani [SLUZINI PER L'ANALISI DEI GLICANI]

2 [SLUZINI PER L'ANALISI DEI GLICANI] [SLUZINI PER L'ANALISI DEI GLICANI] Utilizzo Congiunto di Tecniche Complementari per ttimizzare le Analisi dei Glicani Waters offre approcci completi basati sul flusso di lavoro per l analisi delle glicoproteine a tutti i livelli strutturali. Profili glicoproteici Analisi delle subunità Mappatura dei glicopeptidi Caratterizzazione e monitoraggio dei glicani rilasciati Composizione dei monosaccaridi Complessità del metodo CMPSIZINE DEI MNSACCARIDI MAPPATURA DEI GLICPEPTIDI ANALISI DEI GLICANI RILASCIATI ANALISI DELLE SUBUNITÀ ANALISI DI PRTEINE INTATTE Aumento di informazioni 3 2

3 Cosa accadrebbe se... le analisi di N-glicani rilasciati fossero ottimizzate e ad alta sensibilità? Un flusso di lavoro intelligente e senza compromessi. Finalmente! 5

4 [SLUZINI PER L'ANALISI DEI GLICANI] Flusso di lavoro di Analisi di Proteine Intatte GLICPRTEINA Standard di controllo della massa intatta degli mab INIEZINE SU CLNNA PER ANALISI LC ANALISI SU LC CN RIVELATRE TUV CNFERMA DELLA MASSA CN MS QTof Cartucce di desalinazione MassPREP o ACQUITY UPLC BEH C 4, colonne 300Å, miscela standard MassPREP e kit analisi della massa intatta Sistemi ACQUITY UPLC MS Xevo G2-XS QTof SYNAPT G2-Si HDMS Flusso di Lavoro di Analisi delle Subunità GLICPRTEINA DIGESTINE ENZIMATICA IdeS CN RIDUZINE PZINALE Standard di controllo della massa intatta degli mab INIEZINE SU CLNNA PER ANALISI LC ANALISI SU LC CN RIVELATRE UV ACQUITY UPLC Protein BEH C 4, colonne 300Å Sistemi Alliance HPLC o Sistemi ACQUITY UPLC Flusso di Lavoro di Mappatura dei Glicopeptidi GLICPRTEINA Standard di controllo della massa intatta degli mab RIDUZINE, ALCHILAZINE E DIGESTINE/I DI ENZIMI INIEZINE SU CLNNA PER ANALISI LC ANALISI SU LC CN RIVELATRE TUV Frammenti peptidici glicosilati e non Fase inversa o colonna BEH Amide di Waters Sistemi ACQUITY UPLC Flusso di Lavoro di Composizione dei Monosaccaridi GLICPRTEINA RILASCI DI MNSACCARIDI Idrolisi con acido 3 MARCATURA CN FLURFR Iniezione su colonna per analisi LC ACQUITY UPLC BEH C18, colonne 130Å, 1,7 μm, 2,1 x 100 mm

5 [SLUZINI PER L'ANALISI DEI GLICANI] +51 Risultati G0F/G0F G0F/G1F G0F/G2F ELABRAZINE DEI DATI Software UNIFI e MassLynx G1F/G1F, G1F/G2F G2F/G2F Spettro MS a tempo di volo con ionizzazione a elettronebulizzazione di un mab m/z massa Spettro MS a tempo di volo con ionizzazione a elettronebulizzazione deconvoluto 0,24 Fc/2 +glicani Risultati 0,18 LC Fd CNFERMA DELLA MASSA CN QTdi MS MS Xevo G2-XS QTof SYNAPT G2-Si HDMS ELABRAZINE DEI DATI Software MassLynx A214 0,12 0,06 0, min Risultati A Ingrandito 6 volte MS BPI B ANALISI DELLA MAPPATURA PEPTIDICA CN QTdi MS MS Xevo G2-XS QTof SYNAPT G2-Si HDMS ELABRAZINE DEI DATI Software MassLynx e UNIFI Ingrandito 4 volte Glicopeptidi min 280 nm UV N-acetilglucosamina (GlcNAc) 2. N-acetilglucosamina (GalNAc) 3. Galattosio (Gal) 4. Mannosio (Man) 5. Glucosio (Glc) 6. Fucosio (Fuc) Risultati EU 20 2 Analisi su LC con rivelatore FLR Sistemi Alliance HPLC o Sistemi ACQUITY UPLC ELABRAZINE DEI DATI Software Empower min 5

6 [SLUZINI PER L'ANALISI DEI GLICANI] MNITRAGGI DI RUTINE Esplorate le possibilità Grazie alla maggiore efficienza di ionizzazione e all'elevata affinità protonica di RapiFluor-MS, la rivelazione di massa di glicani tramite il rivelatore ACQUITY QDa è finalmente possibile. Fornisce una sensibilità senza pari per rivelazioni FLR e MS. ffre maggiore affidabilità con la conferma della massa dei picchi FLR. Riduce i tempi di analisi cromatografica con un profilo dei glicani MS mirato per un rapido sviluppo del processo. Può essere facilmente integrato con flussi di lavoro UPLC esistenti conformi alle normative GMP mediante il software Empower 3. Monitoraggio dei glicani mediante il sistema ACQUITY UPLC H-Class Bio con rivelazione FRL e ACQUITY QDa 480 FLR EU min 3,2x10 6 MS Intensità 1,6x min N-glicani marcati con RapiFluor-MS monitorati mediante un sistema ACQUITY UPLC H-Class Bio con rivelatore di massa FLR e ACQUITY QDa, per la conferma di strutture note e dati di massa per i picchi non assegnati. 13

7 [SLUZINI PER L'ANALISI DEI GLICANI] Presentazione del kit RapiFluor-MS per N-glicani Waters, leader nelle innovazioni per le analisi bioterapeutiche, ha ripensato il flusso di lavoro per le analisi di N-glicani rilasciati. Il nostro nuovo reagente, RapiFluor-MS, è dotato della capacità di ionizzazione necessaria per ottimizzare le informazioni generate dalla rivelazione MS. Il nostro nuovo flusso di lavoro accelera la deglicosilazione e ottimizza la marcatura. È il flusso di lavoro intelligente che i laboratori biofarmaceutici stavano aspettando da tempo: per quanto riguarda la spettrometria di massa, non dovrete più scegliere tra uno strumento di marcatura "rapida" e uno sensibile. Inoltre, non ci saranno più processi laboriosi e complicati con possibili margini di errore. Grazie a Waters, non esistono compromessi tra velocità e sensibilità nella preparazione di campioni, ma solo fiducia nei vostri risultati analitici. Unitevi a Waters nel pensare fuori dagli schemi per l'analisi degli N-glicani rilasciati. VELCITÀ/PRDUTTIVITÀ QUANTIFICAZINE FLR PRESTAZINI MS 6

8 [SLUZINI PER L'ANALISI DEI GLICANI] Funzionamento L'analisi di N-glicani rilasciati è una tecnica che fornisce molte informazioni, ma comporta procedure di preparazione dei campioni complesse. In origine, i glicani venivano rilasciati tramite PNGase F e la marcatura era necessaria per una separazione e una rivelazione efficaci. Grazie al nuovo protocollo Waters, avrete a disposizione un flusso di lavoro versatile per: Identificazione dei glicani Struttura dei glicani GLICPRTEINA N-GLICANI RILASCIATI Monitoraggio dei glicani GLICPRTEINA Standard di controllo della massa intatta degli mab N-GLICANI RILASCIATI MEDIANTE DEGLICSILAZINE PNGase F Rapida e Tampone GlycoWorks e Surfattante RapiGest SF GLICANI MARCATI Marcatura con GlycoWorks RapiFluor-MS INIEZINE SU CLNNA PER ANALISI LC Colonna Glycan BEH Amide, Standard per test delle prestazioni di glicani e scala di calibrazione del destrano GLICANI PURIFICATI Piastra o Cartucce GlycoWorks HILIC µelution ANALISI SU LC CN RIVELATRE FLR CARATTERIZZAZINE CNFERMA DELLA MASSA 1,2E+6 FLR Sistemi Alliance HPLC o Sistemi ACQUITY UPLC Rivelatore ACQUITY QDa MS Xevo G2-XS QTof SYNAPT G2-Si HDMS 0,0E min 1,2E+6 MS 0,0E min Risultati ELABRAZINE DEI DATI Software UNIFI, MassLynx e Empower Scoprite i vantaggi scientifici del NUV REAGENTE GlycoWorks RapiFluor-MS, che vi consente di ottenere nuove funzionalità per il monitoraggio, la caratterizzazione e l'analisi dei glicani. Guardate il nostro video su waters.com/seethescience 7

9 [SLUZINI PER L'ANALISI DEI GLICANI] Che cosa fareste se la preparazione dei campioni di N-glicani rilasciati fosse semplice e veloce? Preparazione semplice e rapida dei campioni di N-glicani rilasciati marcati. Riduzione al minimo dell'errore e della perdita di campione. Formazione degli analisti e metodi di trasferimento semplici a ogni livello della vostra organizzazione. 3 FASI IN 30 MINUTI GLICPRTEINA N-GLICANI RILASCIATI GLICANI MARCATI GLICANI PURIFICATI Standard di controllo della massa intatta degli mab PNGase F rapida e tampone GlycoWorks e surfattante RapiGest SF Marcatura con GlycoWorks RapiFluor-MS Piastra o cartucce GlycoWorks HILIC µelution FASE 1 FASE 2 FASE 3 < 15 minuti 5 minuti 10 minuti Guardate la breve dimostrazione della durata di 2 minuti del kit RapiFluor-MS per N-glicani. 8

10 [SLUZINI PER L'ANALISI DEI GLICANI] Cosa fareste se fosse possibile ottenere una sensibilità FLR e MS senza pari? Miglior comprensione della qualità del prodotto grazie alla caratterizzazione approfondita di picchi non identificati in precedenza mediante la quantificazione della fluorescenza e con la risposta degli spettrometri di massa equivalenti. Accelerazione dei processi decisionali. Identificazione più semplice dei glicani N-linked a bassa concentrazione. SENSIBILITÀ SENZA PARI Marcati con RapiFluor-MS 100 Fluorescenza 100 MS (BPI) N N NH Glicani NH NH Marcati con AB istantanea NH 2 Glycan NH NH Marcati con 2-AB Glycan NH NH 2 Marcati con procainamide N NH Glycan NH Prestazioni relative (%) RapiFluor-MS 2X 52,5 AB Istantanea 14X 7,0 7,0* 2-AB Procainamide* RapiFluor-MS 1000X 160X AB Istantanea 0,1 0,6 3X 30,0* 2-AB Procainamide* Fluorescenza 14 volte maggiore e risposta degli spettrometri di massa 160 volte più elevata rispetto alle marcature tradizionali (2-AB e procainamide). Fluorescenza 2 volte maggiore e risposta degli spettrometri di massa 1000 volte più elevata rispetto alle marcature istantanee. *Basato su valori teorici pubblicati. Scoprite come le analisi che svolgete ogni giorno possono approfittare di straordinarie possibilità. 9

11 [SLUZINI PER L'ANALISI DEI GLICANI] Che cosa fareste con dati di massa semplici e sempre disponibili per le analisi di routine dei glicani? Incremento dell'affidabilità nel monitoraggio del profilo dei glicani con la rivelazione di massa di routine. Recupero di informazioni sulle modifiche del processo produttivo grazie alla rapidità dei tempi di analisi dei campioni. Risoluzione rapida dei problemi relativi allo sviluppo e al trasferimento di metodi. FIDUCIA NEI RISULTATI Dettaglio del profilo di N-glicani di un mab 1,2E+6 FLR 0,0E min 1,2E+6 MS 0,0E min La maggiore efficienza di ionizzazione di RapiFluor-MS consente l'abbinamento della fluorescenza quantitativa con la rivelazione di massa grazie al rivelatore ACQUITY QDa. Guardate il breve video della durata di 1 minuto su come potenziare la rivelazione di massa nel vostro laboratorio. 10

12 [SLUZINI PER L'ANALISI DEI GLICANI] Informazioni sugli ordini Kit Completi di Preparazione dei Campioni Descrizione Kit di partenza GlycoWorks RapiFluor-MS per N-Glicani Il kit contiene: modulo di deglicosilazione, modulo di marcatura, modulo di purificazione e modulo di raccolta dei campioni GlycoWorks, ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide, 1,7 μm, colonna 2,1 x 150, concentrato per fasi mobili: formiato di ammonio Kit GlycoWorks RapiFluor-MS per N-glicani Il kit contiene: modulo di deglicosilazione, modulo marcatura, modulo purificazione e modulo di raccolta campione GlycoWorks Codice Standard e accessori Descrizione Quantità Codice Scala di calibrazione del destrano di RapiFluor-MS 50 μg/vial Standard del test delle prestazioni di glicani di RapiFluor-MS 400 pmol total/vial Analisi dei glicani con soluzione di formiato di ammonio Spessori collettore sottovuoto Spaziatore per collettore a pressione positiva per il kit GlycoWorks RapiFluor-MS per N-glicani Seminario Lunch & Label Scoprite come marcare i glicani durante la pausa pranzo Siete interessati a scoprire come il kit RapiFluor-MS per N-glicani e il rivelatore di massa ACQUITY QDa possono aiutarvi a migliorare le analisi dei glicani? Possiamo illustrarvelo durante la pausa pranzo nella vostra sede. Per ulteriori informazioni o per l'iscrizione al seminario "Lunch & Label", visitate il sito waters.com/glycansforlunch 11

13 [SLUZINI PER L'ANALISI DEI GLICANI] La nuova generazione di marcatura dei glicani Basato sull'esperienza di Waters nella marcatura per Reagente RapiFluor-MS fluorescenza rapida degli amminoacidi, RapiFluor-MS è stato progettato con proprietà chimiche avanzate per un livello superiore di analisi dei glicani. Con una reazione della durata di 5 minuti, RapiFluor-MS modifica le glicosilammine ottenute con il rilascio enzimatico da una glicoproteina. Marcatura rapida Fluorescenza efficiente Risposta degli spettrometri di massa senza pari N Rapida Gruppo carbammato NHS di marcatura rapida NH N Fluorescenza Fluoroforo di derivazione chinolinica NH N MS Tag della carica delle ammine terziarie GlycoWorks RapiFluor-MS CARATTERIZZAZINE Identificare i componenti dei glicani a bassi livelli con maggiore facilità e affidabilità Raggiungete livelli senza pari nelle assegnazioni strutturali di sensibilità MS e MS/MS combinando RapiFluor-MS con i migliori spettrometri di massa del settore, Xevo G2-XS QTof o SYNAPT G2-Si HDMS. Caratterizzazione dei glicani mediante FLR UPLC con spettrometro di massa Xevo G2-XS QTof 1130,9423, 2+ 1: TF MSES+ FA2G2Ga1BPI 6.93e6 2-AB convenzionale Glicano da 10 µg di proteina 1,5 giorni per la preparazione dei campioni RapiFluor-MS Glicano da 0,1 μg di proteina <1 ora per la preparazione dei campioni Galattosio 1: TF MSES+ BPI 6.93e6 5,5 10,0 15,0 20,0 25,0 min 800 Fucosio GlcNAc Mannosio 1600 m/z Confronto del cromatogramma LC-MS di N-glicani marcati con 2-AB rispetto a N-glicani marcati con RapiFluor-MS dallo stesso mab. È stata osservata una risposta ESI+ MS 100 volte maggiore per il campione marcato con RapiFluor- MS. Uno spettro MS (riquadro) mostra lo spettro riassuntivo per un glicano a bassa concentrazione all'interno del campione. 12

14 UFFICI VENDITE: Austria Australia Belgio e Lussemburgo Brasile Canada Cina Repubblica Ceca Danimarca Finlandia Francia Germania Hong Kong Ungheria India Irlanda Israele Italia Giappone Corea Messico Paesi Bassi Norvegia Polonia Portogallo Portorico Russia/CSI / Singapore Spagna Svezia Svizzera Taiwan Emirati Arabi Uniti Regno Unito Stati Uniti Waters S.p.A. Viale dell'innovazione Milano ITALIA T: F: Waters, THE SCIENCE F WHAT'S PSSIBLE., ACQUITY UPLC, UPLC, Alliance, ACQUITY, QDa, UNIFI, SYNAPT, Empower, Xevo, MassPREP e MassLynx sono marchi depositati di Waters Corporation. RapiFluor- MS, GlycoWorks e RapiGest sono marchi di fabbrica di Waters Corporation Waters Corporation. Stampato negli Stati Uniti d'america Febbraio IT KP-SIG