L equazione semplificata di un processo è così rappresentabile: Recupero PRODOTTO. cellule metaboliti primari metaboliti secondari prodotti complessi

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1 MICROBIOLOGIA DI PROCESSO è quella parte della microbiologia applicata dipendente dall impiego di microrganismi (o di cellule animali o vegetali) come mezzo di produzione di biomasse o metaboliti in condizioni controllate L equazione semplificata di un processo è così rappresentabile: SUBSTRATO Ingegneria di processo + CELLULE O LORO COMPONENTI Fermentazione Recupero PRODOTTO cellule metaboliti primari metaboliti secondari prodotti complessi prodotti di biotrasformazione

2 FERMENTAZIONI Si definisce FERMENTAZIONE quel tipo di metabolismo con il quale un m.o. ricava energia da un substrato in assenza di ossigeno In pratica vengono definite con FERMENTAZIONE INDUSTRIALE tutti i processi di produzione basati sulle attività metaboliche dei m.o. sia in aerobiosi che in anaerobiosi. Le FERMENTAZIONI TRADIZIONALI, sono quelle condotte in enologia per la produzione di bevande alcoliche, nella produzione di derivati del latte (es. yogurt) o nella produzione tradizionale di lievito per panificazione. In queste fermentazioni gli zuccheri contenuti nella materia prima vengono trasformati in diversi prodotti, etanolo, a. lattico, cellule di lievito. Le PRODUZIONI MODERNE sono disegnate e condotte per garantire accumuli di cellule o di prodotti del metabolismo di degradazione (es. etanolo, metano), o del metabolismo di biosintesi (es. antibiotici) da materie prime a basso costo e con alte rese

3 IL METABOLISMO MICROBICO Il metabolismo si divide in catabolismo ed anabolismo. I microrganismi possono essere distinti e classificati sulla base del loro catabolismo e delle esigenze nutrizionali. Radiazione Fototrofi Fonte di energia Ossidazione Chemotrofi Donatore di H Prod. inorg. ridotti Molec. org. ridotte NH 4+ ; NO 2- ; S 2- ; S; S 2 O 3 2- Zuccheri; lipidi; proteine Accettore di e - O 2 ; Mol.org.ox; NO 3- ; SO 4 2- ; CO 2 AerobiAnaerobi Le molecole entrano nelle cellule attraverso trasporto attivo mediato da ATPasi associate alle membrane, o attraverso trasporto passivo con un sistema di traslocazione che coinvolge zuccheri fosforilati

4 IL METABOLISMO CATABOLICO Lo schema generale del catabolismo è diviso in tre stadi: STADIO 1 Degradazione delle molecole complesse in monomeri più piccoli. Non viene rilasciata energia. STADIO 2 Ulteriore degradazione dei monomeri con rilascio di parte dell energia sottoforma di ATP, potere riducente (es. NADH + ) e importanti intermedi metabolici (es. piruvato): STADIO 3 Completamento della degradazione dei substrati e raccolta della maggior quantità di energia (ATP; potere riducente) con il ciclo di Krebs accoppiato alla catena di trasporto degli elettroni (respirazioni aerobiche e anaerobiche) od alle fermentazioni.

5 IL CATABOLISMO OSSIDATIVO Reazioni anaplerotiche Se si sottraggono intermedi dal ciclo (ad es. per le biosintesi metaboliche, o per la produzione industriale) reazioni anaplerotiche (di riempimento) intervengono per ripristinare l equilibrio ricostituendo i precursori del ciclo

6 IL CATABOLISMO FERMENTATIVO Glucosio

7 IL METABOLISMO ANABOLICO dalle vie degradative principali si originano tutti i pathways anabolici: per aminoacidi alifatici e aromatici, lipidi, nucleotidi purinici e pirimidinici, ecc.

8 LA METANOGENESI POLIMERI MONOMERI 1 1 Acidogenesi COMP. C 1 H 2 ALCOLI SUCCINATO LATTATO ACIDI GRASSI C2 C3 3 ACETATO 4 5 CH 4 CO 2 2 Acetogenesi Metanazione 1. Batteri fermentanti acidogeni primari 2. Batteri fermentanti secondari (sintrofici) 3. Batteri omoacetogeni 4. Metanogeni idrogenotrofi 5. Metanogeni acetoclasti

9 GLI ARCHAEA METANOGENI ORDINE: METHANOBACTERIALES Famiglia: Methanobacteriaceae Genere:Methanobacterium Genere: Methanobrevibacter H 2 /CO 2 Genere: Methanosphaera formiato Famiglia: Methanothermaceae Genere: Methanothermus ORDINE: METHANOCOCCALES Famiglia: Methanococcaceae Genere: Methanococcus H 2 /CO 2 ORDINE: METHANOMICROBIALES Famiglia: Methanomicrobiaceae Genere: Methanomicrobium Genere: Methanogenium Genere: Methanoculleus Genere: Methanospirillum H 2 /CO 2 Famiglia: Methanocorpusculaceae Genere: Methanocorpusculum H 2 /CO 2 Famiglia: Methanoplanaceae Genere: Methanoplanus H 2 /CO 2 Famiglia: Methanosarcinaceae Genere: Methanosarcina acetato H 2 /CO 2 Genere: Methanococcoides Genere: Methanolobus methanolo Genere: Methanohalophilus Genere: Methanosaeta/Methanotrix acetato LE REAZIONI DI METANAZIONE 4H 2 + HCO 3- + H + CH 4 + 3H 2 O 4HCOO- + H + + H 2 O CH HCO - 3 CH 3 COO - + H 2 O CH 4 + HCO - 3 ACETATO: AFFINITA E V max K s V max (mm) (h -1 ) Methanosarcina Methanosaeta

10 GENOMI SEQUENZIATI

11 METANOGENESI: RESE ENERGETICHE E SINTROFIA E un processo metabolico molto meno esoergonico della respirazione aerobica o delle respirazioni anaerobiche La conversione di un esoso a CH 4 rilascia solo il 15% dell energia ottenibile dalla degradazione aerobica C 6 H 12 O 6 + 6O 2 6CO 2 + 6H 2 O (ΔG = kj/mole) C 6 H 12 O 6 3CO 2 + 3CH 4 (ΔG = -390 kj/mole) La bassa resa energetica della metanogenesi costringe i microrganismi coinvolti a cooperare molto efficientemente ed a stabilire relazione di SINTROFIA la cooperazione tra 2 organismi che dipendono l uno dall altro. La mutua dipendenza non può essere sostituita dall aggiunta di nutrienti. Ad es. la cocoltura di Methanobacillus omelianskii degrada l etanolo a: Strain S 2CH 3 CH 2 OH + 2H 2 O 2CH 3 COO - + 2H + + 4H 2 (ΔG = +19 kj per 2 mol of ethanol) Strain M.o.H. 4H 2 + CO 2 Co-Culture 2CH 3 CH 2 OH + CO 2 CH 4 + 2H 2 O (ΔG = -131 kj per mol of methane) 2CH 3 COO - + 2H + + CH 4 (ΔG = -112 kj per mol of methane)

12 METANOGENESI: RESE ENERGETICHE E SINTROFIA Un processo che favorisce la sintrofia è il TRASFERIMENTO INTERSPECIE DI H 2, HCOO - E CH 3 COO - in cui un efficiente scavenger per questi substrati (es. metanogeni o solfatoriduttori) ne mantiene una bassa concentrazione, favorendone la produzione da parte degli acetogeni sintrofici

13 METANOGENESI: RESE ENERGETICHE E SINTROFIA

14 METANOGENESI: PATHWAYS ALTERNATIVI Oltre al classico network metabolico con 3 livelli trofici (acidogenesi, acetogenesi, metanazione) è stato identificato un network metabolico a 2 livelli (acetogenesi e metanazione), in cui un gruppo batterico, le spirochete, produce direttamente acetato, H 2 e CO 2 da glucosio insieme a quantità variabili di lattato ed etanolo. 1 COMP. C 1 H 2 2 MONOMERI (glucosio) CH 4 CO 2 ACETATO 3 Acetogenesi Metanazione 1 Spirochete; 2 Metanogeni H-trofi; 3 Metanogeni acetoclasti In presenza di efficienti scavenger per l H 2 come i metanogeni la maggior parte del flusso elettronico del metabolismo delle spirochete va nella direzione di acetato, H 2 e CO 2 a spese di lattato ed etanolo. In questa situazione metabolica gli acetogeni sintrofici hanno un ruolo insignificante ed il processo di metanogenesi viene completato in due livelli trofici.

15 COMUNITA FLESSIBILI E STABILITA FUNZIONALE Quale è la stabilità dei processi metabolici metanogenici esposti a stress? La risposta di reattori con i 2 tipi di pathway metanogenici (a 2 o 3 livelli) a shock da sovraccarico di substrato indica che la miglior reazione metabolica si ha dove il flusso elettronico di degradazione del substrato a CH 4 avviene per vie metaboliche parallele piuttosto che sequenziali. FLUSSI METABOLICI PARALLELI Nel caso di reattori ad alto contenuto di spirochete la formazione dei substrati di metanazione (acetato ed H 2 ) da glucosio avviene attraverso 2 vie indipendenti, quella diretta catalizzata dalle spirochete a quella con l intervento di acetogeni sintrofici FLUSSI METABOLICI SEQUENZIALI Nel pathway metanogenico a tre livelli la produzione di acetato e H 2 metabolici sequenziali catalizzati da diversi gruppi trofici. avviene attraverso step

16 COMUNITA FLESSIBILI E STABILITA FUNZIONALE Per verificare la risposta a stress di sovraccarico organico di comunità microbiche metanogeniche che si differenziano per flussi metabolici paralleli piuttosto che sequenziali, sono stati comparati due tipi di reattori derivanti dal medesimo inoculo e condotti nelle medesime condizioni operative, ma selezionati sulla base di differenze per il tempo medio di residenza cellulare (17,5 contro 5,8 giorni). FLUSSI METABOLICI PARALLELI FLUSSI METABOLICI SEQUENZIALI

17 COMUNITA FLESSIBILI E STABILITA FUNZIONALE L analisi d immagine computerizzata dei morfotipi microbici e l analisi ARDRA dei cloni in librerie di 16S ottenute dai due set di reattori indicavano una distinta composizione in m.o.: REATTORI HS (highspirochete) dominati da spirochete, bastoncini corti e Methanosarcina. REATTORI LS (low spirochete) dominati da cocchi e Methanosaeta. Il sovraccarico di substrato (glucosio) determinava una maggior variazione delle popolazioni nelle comunità HS che ritornavano alla composizione iniziale dopo 24 giorni dall inizio della perturbazione. Mentre le popolazioni nel reattore LS rimanevano relativamente stabili.

18 COMUNITA FLESSIBILI E STABILITA FUNZIONALE Dal punto di vista metabolico, la comunità LS reagiva più prontamente: ripristinando in un tempo più breve gli equilibri iniziali di concentrazione dei metaboliti del processo di metanogenesi. Le caratteristiche del processo HS erano: i) Più lenta utilizzazione del substrato glucosio. ii) Mantenimento di un livello più basso dei metaboliti intermedi. iii) Inizio simultaneo dei diversi processi fermentativi (produzione dei diversi acidi).

19 METANOGENESI: DIVERSITA MICROBICA E STABILITA FUNZIONALE Comunità microbiche con i principali flussi metabolici paralleli sono funzionalmente più stabili in risposta a perturbazioni esterne come shock da sovraccarico organico rispetto a comunità con flussi metabolici seriali. Comunità microbiche più complesse (con maggiore biodiversità) possono rispondere meno prontamente agli stress di comunità microbiche più semplici ma organizzate in maniera funzionalmente diversa. Per un efficiente risposta agli stress alla biodiversità genetica e fenotipica deve accompagnarsi una biodiversità funzionale.

20 METANOGENESI: I REATTORI Per la digestione anaerobica dei reflui si distinguono diversi tipi di reattori che si differenziano per: Schema idraulico dei sistemi Forma della biomassa (libera, adesa)

21 METANOGENESI: I REATTORI PER REFLUI Reattori a biomassa libera Reattori a biomassa adesa Migliore contatto tra le cellule e migliore sintrofia (es. la rimozione dell H 2 prodotto dagli acetogeni sintrofici, Sintrophomonas e Sintrophobacter, da parte dei metanogeni idrogenotrofi che agiscono da scavenger dell H 2 tossico per gli acetogeni) Stabilità della biomassa nel reattore (basso washout cellulare) Reattori UASB (upflow anaerobic sludge bed) Reattori a letto fisso espanso fluidizzato Strati di microrganismi La biomassa è organizzata in biofilm autoimmobilizzato in granuli compatti (diam cm) ad alta sedimentabilità Materiale di supporto Le cellule sono immobilizzate in un biofilm adeso ad un supporto inerte (plastica, legno,ecc.)

22 METANOGENESI: I REATTORI UASB Biogas Effluente Ricircolo Influente MESOFILI TERMOFILI

23 METANOGENESI: I REATTORI UASB Nei reattori UASB (Upflow anaerobic sludge Blanket) si sviluppano granuli con biomassa strati-ficata in cui sono particolarmente effi-cienti gli scambi tro-fici tra i diversi m.o. (es. metanogeni e acetogeni sintrofici). L ibridazione in situ con sonde specifiche per Archaea (rosse) e per Bacteria (verdi) mostra che gli strati superficiali sono prevalentemente colonizzati da batteri, mentre gli strati profondi dei granuli sono colonizzati da archaea, sia in granuli mesofili che termofili. La parte centrale dei granuli non da segnale di ibridazione e sembra costituita da residui cellulari e materiale inorganico.

24 M.saeta (rosso) Eubacteria (verde) M.saeta (rosso) Eubacteria (verde) MESOFILI M.bacteriaceae (rosso) Eubacteria (verde) M.microbiaceae (rosso) Eubacteria (verde) M.bacteriaceae (rosso) Eubacteria (verde) M.sarcinaceae (rosso) Eubacteria (verde) TERMOFILI METANOGENESI: I REATTORI UASB

25 ARC915: sonda universale per Archaea ( fluorescina) SYN-7: sonda spec. acetogeno sintrofico SYN-7 (rodamina) ARC915 SYN-7 ARC915+SYN-7 ARC915: sonda universale per Archaea (fluorescina) EU338: sonda universale per Bacteria (rodamina) MX825: sonda spec. per Methanosaeta sp. (rodamina) MG1200: sonda spec. per M.microbiaceae (fluorescina) SYN-7: sonda spec. acetogeno sintrofico SYN-7 (rodamina) ARC915+EU338+MX825 MG1200+SYN-7 METANOGENESI: I REATTORI UASB

26 Sekiguki et al Appl. Environ. Microbiol., 67:

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30 INTERAZIONE METANOGENI-SOLFATORIDUTTORI IN UASB L interazione spaziale tra solfatoriduttori e metanogeni, 2 gruppi microbici che competono per i donatori di elettroni diretti (acetato e H 2 ) ed indiretti (es. lattato, etanolo, ecc.) è stata studiata attraverso impiego di microsensori per CH 4 e H 2 S, per misurare negli strati di granuli UASB metanogenici e sulfidogenici-metanogenici, la concentrazione dei 2 gas e l attività metanogenica e sulfidogenica. Granuli metanogenici-sulfidogenici Granuli metanogenici Le analisi di attività e di microprofili dei gas indicano che i solfatoriduttori si posizionano negli strati più esterni del biofilm, mentre gli archaea metanogeni colonizzano il centro del granulo. Questi risultati venivano confermati da esperimenti di ibridazione in situ.

31 STABILITA DELLA BIOMASSA Biogas Effluente FAVORIRE: Bassa idrofobicità superficiale biofilm Batteri a superficie idrofilica sulla superficie del biofilm Washout Washout 1 cm Influente

32 WASH-OUT DEI GRANULI E TENSIONE SUPERFICIALE La stabilità dei granuli è determinata dall interazione con le microbolle di gas e quindi dalla tensione superficiale all interfaccia superficie granulo/bolla di gas secondo i ΔG di adesione descritti dalla seguente legge che è funzione delle diverse tensioni interfacciali: Ad alti carichi organici ed alte produzioni di biogas la biomassa granulare inizia a flottare ed è trasportata fuori dal reattore con il fenomeno del wash-out della biomassa

33 WASH-OUT DEI GRANULI E TENSIONE SUPERFICIALE La maggior parte degli acidogeni sono IDROFILICI, mentre la maggior parte dei metanogeni e degli acetogeni sono IDROFOBICI

34 WASH-OUT DEI GRANULI E TENSIONE SUPERFICIALE La stabilità dei granuli è determinata dall interazione con le microbolle di gas e quindi dalla tensione superficiale all interfaccia superficie granulo/bolla di gas secondo i ΔG di adesione descritti dalla seguente legge che è funzione delle diverse tensioni interfacciali: C è quindi una finestra ottimale di tensione superficiale del liquido che aumenta l esposizione di batteri idrofilici sulla superficie dei granuli e abbassa i valori di ΔG di adesione per i microganismi idrofilici

35 WASH-OUT DEI GRANULI E TENSIONE SUPERFICIALE La configurazione dei granuli UASB in relazione alla tensione superficiale del reflo e in accordo a considerazioni termodinamiche può essere così schematizzata: La configurazione 1 risponde anche al flusso trofico che deve essere stabilito tra l esterno e l interno del granulo. All esterno del granulo è abbondante il glucosio e gli zuccheri substrati del primo gruppo trofico della metanogenesi, gli ACIDOGENI che sono idrofilici

36 Olive Mill Wastewater Southern Europe Countries world major producers of olive oil and hence major producers of OMW OMW characteristsics Very high COD (up to 200 g l -1 ) High content of polyphenols (up to 6 g l -1 ) Relatively low ph (4-5) OMW anaerobic digestion CH 4 production Spontaneous separation of CH 4 Low sludge production [Bertin et al FEMS Microbiol. Ecol. 48: ] Polyphenols can strongly decrease the process efficiency being toxic for methanogenic Archaea, a key component of the reactor microflora [Field & Lettinga 1987 Water Res. 21: ] How methanogen community respond to increasing OMW organic loads?

37 Anaerobic Digester for OMW Treatment GC Gas Counter Contact reactor Fixed bed filter Biogas Anaerobic digester (11 L) Up-flow fixed bed digester (7.5 L) Contact reactor (3.5 L) Packing with wood chips HRT = 48 h Temperature = 37 C Vol. Org. Load = 1-15 g COD l -1 d -1 OMW Influent OMW Effluent OMW-Influent Diluted OMW Influent ph = N correction with NH 4 Cl Influent COD = g l -1

38 Process Performances TABLE 1. Process parameters of OMW anaerobic digestion at different VOL. For each process phase average values SD of the parameters were calculated for a number of samples n reported in brackets. Parameter VOL (g COD l -1 react d -1 ) 2.7±0.47 (28) 5.7±0.5 (13) 6.6±0.9 (10) 10.1±2.4 (11) 15.2±3.7 (8) Treatment time (d) HRT (d) 2.2±0.3 (61) 2±0.1 (26) 2±0.1 (20) 2.2±0.3 (18) 2±0.1 (23) Influent ph 6.17±0.12 (50) 6.38±0.09 (23) 6.4±0.07 (19) 6.42±0.14 (16) 6.4±0.1 (23) Effluent ph 7.77±0.21 (43) 7.82±0.3 (17) 7.8±0.28 (18) 7.98±0.35 (14) 7.76±0.26 (24) Infl. COD (g l -1 ) 5.9±0.8 (30) 11.9±0.8 (13) 13.2±1.3 (10) 21.8±2.7 (11) 31.3±7.8 (8) Effl. Sol. COD(g l -1 ) 0.96±0.3 (23) 1.4±0.4 (11) 1.4±0.4 (7) 1.61±0.48 (8) 2.92±48 (6) Sol COD removal (%) 84.1±5.1 (23) 88.5±3.6 (11) 88.7±3.9 (7) 92.4±1.6 (8) 89.2±1.9 (6) Spec. CH 4 prod. (l g -1 COD rem ) 0.33±0.08 (22) 0.26±0.06 (11) 0.27±0.04 (7) 0.23±0.06 (8) 0.16±0.04 (6) CH 4 in the biogas (%) 74.2±2.5 (29) 71.9±1.6 (15) 71.6±1.4 (11) 69.6±1.8 (13) 69.5±3.4 (17) COD Removal (%) COD removal Time (d) VOL CH VOL (g COD l -1 d -1 ) CH 4 (l/10g COD rem)

39 Process Performances VFA and C2 g (mg l -1 ) VFA VOL C Time (d) VOL (g COD l -1 d -1 ) - VFA: below 800 mg l -1 - Acetic acid (C2): 70-80% of VFA Low VFA and C2 indicate efficient acetogenic and methanogenic phases - At VOL 10 g COD l -1 d -1 the effluent COD is 1.6 g l -1 - Since 1g C2 gives 1g COD, more than 50% of effluent COD was due to VFA - Hence low residual polyphenols A decrease of specific CH 4 production at VOL of 10 g COD l -1 d -1!!

40 acetone (50 ml) sample (25 ml) discarded centrifugation flocculated solids concentration under N 2 stream acetone eliminated n-hexane (50ml) water solution discarded (extraction repeated lipid fraction 4 times) H 2 O (1ml) CH 3 CN (10 ml) n-hexane (20 ml) (extraction repeated 6 times) freeze drying sonication n-hexane discarded lipid fraction polyphenolic extract in CH 3 CN concentration under N 2 flux, 30 C CH 3 CN eliminated MeOH (3ml) methanolic polyphenolic extract Fig. 1. Scheme of the procedure used for the extraction of polyphenols from olive mill waste waters and from the plant effluents. The average recovery of polyphenols on the basis of addition of known concentrations of gallic acid was 59%. The average percent removal of polyphenols in the ractor was 89.5% [100% for 2-(p-hydroxy)phenilethanol]. Removal of 2-(p-hydroxy)phenilethanol was calculated on the basis of the response factor of the corresponding standard while the content of the remain polyphenols was calculated using the responce factor of caffeic acid.

41 Methanogen counts (Log MPN g -1 VSS) Methanogenic Archaeal Community H 2 Acetate VOL (g COD l -1 d -1 ) No apparent changes in the methanogen assemblage in the effluent as shown by MPN counts and coenzyme F F 420 Coenzyme (nmoles g -1 VSS) VOL F VOL (g COD l -1 d -1 ) Time (d)

42 Analysis of Methanogenic Archaeal Community Analysis by SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) can resolve the diversity of bacteria and Archaea by separation of single strand fragments with different conformations Preparazione delle singole eliche A- con la temperatura Double str. single strands A B C B- con primer fosforilati e digestione con λ-esonucleasi λ exon. C- con primer biotinilati e cattura magnetica biotin Streptavidin+magnetic beads magnet

43 Methanogenic Archaeal Community: Diversity Methanogen-specific primer PCR with a P-labelled primer - λ-nuclease digestion of the P-labelled strand - PCR on a collection of 30 methanogen species - PCR on biofilm collected at 5.7 and 10 g COD l -1 d P 5 end phosphorilated primer Archaea-universal primer SSCP analysis of 16S rrna gene No apparent qualitative differences in the Archaea community pattern. The methanogen community was apparently dominated by M.bacterium H 2 consuming M.sarcina/M.saeta Acetate consuming

44 Methanogenic Archaeal Community: Abundance Quantification of the different phylogenetic groups of methanogens based on extinction of PCR signals amplified from biofilm sludge DNA [Wang et al., 1996 Appl. Environ. Microbiol. 62: ] PCR sensitivity (the minimal n of cells giving amplification) PCR titer (The maximum sludge DNA dilutions for positive PCR) Microscopic cell counts PCR sensitivity PCR Titer PCR Culture Sample Culture dilutions DNA extr PCR Sample dilutions DNA extr.

45 Methanogenic Archaeal Community: Abundance Specific PCR for the different phylogenetic groups of methanogens were set up basing on 16S rrna gene signatures [Raskin et al., 1994 Appl. Environ. Microbiol. 60: ] 5 end bitinilated probe B Magnetic Capture hybridization Methanogen-specific primer Archaea-universal primer Fwd M.bact. M.sarc. M.coc. M.micr Specific PCR Species (strains) Primer sets PCR sensitivity Mb Mc Mm Ms1 Ms2 Mb. formicicum 1535, 3637, 3636, 2639, 3722, 6299; Mb. ulginosum ; Mb. ivanovii 2611; Mb. bryantii 863; Mb. palustre 3108; Mb. thermoalcaliphilum 3267; Mb. thermoautotrophicum 1053, 3720; Mb. thermoaggregans 3266; Mb. wolfei 2970; Mb. thermophilum 6529; Mbrev. arboriphilicus 1125; Msph. stadtmanae 3091 Mc. maripaludis 2067; Mc. voltae 1537; Mc. vannieli Mg. cariaci 1497; Mcull. marisnigri 1498; Mspirillum hungatei 864; Mcorp. parvum 3823; Mcorp. sinense 4274; Mp. limicola 2279 Msar. barkeri 800; Msar. mazei 2053; Msar. vacuolata 1232; Msar acetivorans 2834 Mtrix thermophila 6194; Msaeta concilii

46 Methanogenic Archaeal Community: Abundance H 2 consuming Acetate consuming PCR TITER IN THE BIOFILM VOL = 5.7 (5.7 g COD l -1 d -1 ) VOL = 10.1 (g COD l -1 d -1 ) M.bacteriaceae M.microbiaceae M.coccaceae n.d. n.d. M.sarcina/M.saeta Methanogen counts (Log MPN g -1 VSS) H 2 Acetate H 2 Acetate Following VOL increase methanogen community responded by changing the relative abundance of different phylogenetic/physiological groups

47 Conclusions In the adopted reactor OMW were efficiently treated (COD removal around 90%) up to VOL of 15 g COD l -1 d -1 A decrease of CH 4 specific production occurred at VOL of 10 g COD l -1 d -1 The overall diversity of methanogen was not affected as shown by SSCP and sequencing Methanogen community reacted by re-balancing the H 2 trophic/acetotrophic methanogen ratio

48 TRATTAMENTO DEGLI EFFLUENTI DI CANTINA VINICOLA Gli scarti delle cantine vinicole sono costituiti dalle acque di lavaggio degli impianti di vinificazione e contengono parti dei raspi e le bucce degli acini I reflui di cantina contengono concentrazioni residue di zuccheri e acido tartarico (dall uva), etanolo, acido acetico e acido lattico (residui delle fermentazioni) I reflui che derivano dalla vinificazione del vino rosso contengono anche considerevoli quantità di composti fenolici (antociani e tannini) che possono avere effetto tossico sui microrganismi coinvolti nella degradazione anaerobica, in particolare i metanogeni. Trattamento dei reflui di cantina: trattamento aerobico elevato consumo di energia richiesto dall aerazione, e necessità di aggiungere nutrienti digestione anaerobica abbattimento del carico organico, con recupero di energia (produzione di metano)

49 TRATTAMENTO DEGLI EFFLUENTI DI CANTINA VINICOLA Un processo di digestione anaerobica degli effluenti di cantina vinicola è stato messo a punto in un impianto in scala di laboratorio IMPIANTO: digestore cilindrico, h= 130 cm, riempito con materiale inerte di riempimento (truciolato di legno) come matrice di supporto. Caricamento in fase ascendente. Il digestore conteneva una microflora selezionata nei trattamenti dei precedenti anni (depurazione degli effluenti di pirolisi, dell acqua di vegetazione delle olive, degli impasti di cartiera) TRATTAMENTO: le acque di cantina erano diluite fino ad avere un carico organico di COD=7-7,5 g/l, ed addizionate di NaHCO 3 e NH 4 Cl. Dopo un periodo di adattamento, il reattore ha raggiunto una fase di equilibrio steady state con una rimozione del COD del 90%. Il carico organico è stato quindi aumentato a 10,5-12,5 gcod/ld, diminuendo il tempo di ritenzione a 16-17h

50 TRATTAMENTO DEGLI EFFLUENTI DI CANTINA VINICOLA La digestione anaerobica delle acque provenienti dalla vinificazione in rosso è risultata meno efficiente rispetto a quella in bianco: minore rimozione di COD inferiore produzione di metano maggior contenuto di AGV nell effluente (segnale di un inibizione dei processi di acetogenesi e metanogenesi) le cariche dei metanogeni presenti nella fase circolante sono inferiori, mentre i batteri eterotrofi e glucosio-fermentanti sono superiori

51 TRATTAMENTO DEGLI EFFLUENTI DI CANTINA VINICOLA Il reattore è in grado di recuperare rapidamente (circa 10 giorni) shocks da carico organico pari ad un aumento improvviso di tre volte del carico organico specifico volumetrico

52 METANOGENESI A BASSA TEMPERATURA Start-up and operation of an anaerobic high-rate staged expanded granular sludge bed (EGSB) system for the treatment of cold (3 to 8 C), dilute wastewater (0.5 to 0.9 g of COD liter -1 ), containing 12 mg of O 2 liter -1

53 METANOGENESI A BASSA TEMPERATURA

54 POTENZIALITA DELLA PRODUZIONE DI METANO - Trattamento termofilo reflui acidificati - Reattori UASB multipli - Carico organico fino a 100 kg COD m -3 day -1

55 POTENZIALITA DELLA PRODUZIONE DI METANO - Rimozione del COD > 90% - Tempo di ritenzione idraulico = h - Produzione di biogas m 3 m -3 reattore day-1

56 LA METANOGENESI Produzione di idrogeno scorporando le fasi di acidogenesi da quella di metanazione per favorire la produzione fermentativa di idrogeno POLIMERI MONOMERI 1 1 Acidogenesi COMP. C 1 H 2 ALCOLI SUCCINATO LATTATO ACIDI GRASSI C2 C3 3 ACETATO 4 5 CH 4 CO 2 2 Acetogenesi Metanazione

57 PRODUZIONE DI IDROGENO

58 Produzione di idrogeno da reflui solidi scorporando acidogenesi da metanazione in due reattori con diverso tempo di ritenzione PRODUZIONE DI IDROGENO

59 PRODUZIONE DI IDROGENO Aumento dell accumulo di idrogeno attraverso sparging di gas nel reattore Aumento delle rese di metano nel rattore metanogenico