Concorso Migliori Tesi di Laurea - BioEnergy 2013 Cremona 28 febbraio 2013 Tesi di Laurea Magistrale Biotecnologie Vegetali e Microbiche Tesista Elisa Corneli Relatore Prof. Enrico Bonari Correlatore Dott.ssa Lucia Guidi Univerisità degli Studi di Pisa Dipartimento di Scienze Agrarie, Alimentari e Agro-Ambientali - Anno Accademico 2011-2012
Biogas Introduzione Miscela di gas ottenuta attraverso un processo biochimico noto come digestione anaerobica di biomasse vegetali e animali (residui agricoli e colture dedicate) e della parte biodegradabile dei rifiuti. Il biometano può essere utilizzato al posto dei combustibili fossili; può essere impiegato come bio-carburante nel settore dei trasporti e per produrre energia e/o calore. Produzione di biogas processo biotecnologico per la valorizzazione energetica delle biomasse Bonari et al., 2009; Weiland, 2010, Piccinini e Fabbri, 2011
Digestione anaerobica Introduzione IDROLISI Batteri anaerobi obbligati e facoltativi idrolisi dei carboidrati, proteine e lipidi ACIDOGENESI Batteri anaerobi obbligati e facoltativi biosintesi degli acidi organici METANOGENESI Archea metanigeni metano ACETOGENESI Batteri acetogenici biosintesi dell acido acetico, H 2 e CO 2 Deublein et al., 2008; Weiland, 2010
Introduzione Archea metanigeni e metanogenesi ACETOCLASTICI CH 3 COOH CO 2 e CH 4 IDROGENOTROFI H 2 e CO 2 CH 4 70% 30% Dominio: Archaea Phylum: Euryarcheota Ordini: Methanobacteriales, Methanococcales, Methanomicrobiales, Methanosarcinales e Methanopyrales. Deublein et al., 2008; Nettmann et al., 2010; Lim et al., 2011
Digestato Introduzione Residuo del processo di DA: miscela di sostanza organica parzialmente degradata, biomassa microbica e composti inorganici (10-98% di H 2 O). Impiego in campo come fertilizzante/ammendante: Tal quale; Separazione solido-liquida; Strippaggio dell azoto. Vantaggi: Non dover smaltire il refluo; Risparmio economico per la riduzione dell uso dei fertilizzanti azotati. Alburquerque et al., 2012; Möller et al., 2012
Obiettivo del lavoro Obiettivo Studio della produzione di biogas attraverso la digestione anaerobica di una coltura erbacea alternativa, la canna comune (Arundo donax L.) Sperimentazione della canna comune in campo: Effetto dell epoca di taglio sulle rese. Produzione di biogas della canna comune a confronto col mais: Potenziale metanigeno; Caratterizzazione chimica del digestato; Caratterizzazione molecolare della comunità degli archea metanigeni nel digestato.
Canna comune (Arundo donax L.) Pianta erbacea rizomatosa perenne: - Classe: monocotiledoni (Liliopsida) - Ordine: Poales - Famiglia: Graminaceae (Poaceae) - Tribù: Arundineae - Genere: Arundo Materiali e Metodi PUNTI DI FORZA Produttività costante ed elevata Grande adattabilità (tipo di terreno, condizioni udometriche) Ridotte esigenze nutrizionali Elevata resistenza a crittogame e insetti, competitiva contro piante infestanti Specie poliennale Coltura non alimetare (no-food) Coltura erbacea alternativa per la produzione di biogas. Bonari et al., 2004; Ceotto, 2006; Nassi o Di Nasso, 2008
Sperimentazione della canna comune in campo Materiali e Metodi Cinque epoche di raccolta durante la stagione vegetativa 2011, da metà giugno a fine settembre, anche in ipotesi di un insilamento a livello aziendale: A1 (I taglio): raccolta il 20/06; A2 (II taglio): raccolta il 15/07; A3 (III taglio): raccolta il 02/08; A4 (IV taglio): raccolta il 22/08; A5 (V taglio): raccolta il 20/09. Impianto della coltura (2 piante m -2 ) messo a punto nel 2006 presso il CRIBE (Centro E.Avanzi, San Piero a Grado, PI) con lo scopo di valutare la produttività potenziale della canna comune. Parcelle di 50 m 2 x 3 repliche.
Risultati Effetto dell epoca di taglio sulle rese areiche in s.s. % di H 2 0 53% 49% Min: A1 = 23 tss ha -1 Max: A5 = 38 tss ha -1 69% 62% 62% Effetto significativo dell epoca di taglio sulle produzioni quantitative della canna comune. Con l avanzare dell età della coltura la resa è aumentata.
Digestione anaerobica della biomassa Sistema statico in bacth (2L) Biomassa di canna comune x epoca di raccolta (n=3) Mais insilato (n=3) Inoculo tal quale (n=3) Inoculo + Biomassa VS inoc = 2 VS sub Materiali e Metodi T = 38-40 C; Tempo di ritenzione idraulica = 40 giorni. Produzione del biogas: trasduttore di pressione invio segnale ogni tre minuti a centralina Programmable Logic Controller (PLC). Composizione del biogas: mini-gascromatografo.
Potenziale metanigeno Risultati MYP Min: A5 258 ml gvs -1 Max: A3 374 ml gvs -1 Rmax Min: A5 20 mlch 4 gvs -1 giorno -1 Max: M 45 mlch 4 gvs -1 giorno -1
Risultati Rese metanigene ed energetiche ad ettaro Arundo = 10% > M A5 = 27% > M
Caratterizzazione chimica del digestato Risultati Effetto significativo del fattore substrato sul K tot e il carbonio organico totale (TOC) dei digestati.
Risultati Caratterizzazione molecolare della comunità degli archea metanigeni nel digestato Primers ed enzimi di restrizione selezionati per caratterizzare la comunità attraverso clonaggio e sequenziamento del frammento del gene 16S rrna (829 bp): Arch16S-Forw2 5 -YGAYTAAGCCATGCRAGT-3 Univ16S-Rev5 5 -TGCTCCCCCGCCAATTCCT-3 HhaI = Hin6I sito di taglio: G CG C C GC G HaeIII = BsurI sito di taglio: GG CC CC GG Nettmann et al., 2008 Entropia del frammento 16S rrna analizzato
Identificazione di archea metanigeni nei diversi digestati Risultati Estrazione DNA genomico; Amplificazione e clonaggio del frammento genico 16S rrna; Sequenziamento 192 cloni positivi selezionati in base alle abbondanze relative dei profili di restrizione ottenuti da gel; Digestione in silico (8 profili RFLP) e analisi filogenetica (6 clade) delle sequenze ottenute da sequenziamento; Identificazione degli archea metanigeni (albero filogenetico Neighbour-Joining): Genere Methanosarcina - ordine Methanosarcinales Genere Methanoculleus - ordine Methanomicrobiales Genere Methanobrevibacter - ordine Methanobacteriales Genere Methanobacterium - ordine Methanobacteriales Clade 4_RFLP2
Ricchezza dei clade (n) Ricchezza dei clade nei digestati e abbondanze relative dei singoli clade Risultati Metanosarcina (clade 1): presenza ubiquitaria in tutti i digestati. Methanoculleus thermophilicus, Methanoculleus bourgense (clade 2 e 4): presenza specifica in Arundo. Methanoculleus spp, Methanobrevibacter thaueri e Methanobacterium subterraneum (clade 3, 5 e 6): presenza specifica nel mais.
Struttura delle comunità di archea metanigeni nei diversi digestati Risultati M comunità diversa dalla canna comune; A1 comunità diversa dagli altri tagli; A2, A3, A4, A5 comunità non distinguibili tra loro. Abbondanze relative del clade 3, 5, 6 correlate tra loro e caratteristiche del M; Abbondanze relative del clade 2 e 4 correlate tra loro e caratteristiche di A1.
Risultati Quale è la relazione tra le comunità di archea metanigeni ed i parametri che descrivono la produzione di metano? Specie più efficienti per la produzione di metano: Clade 1 Metanosarcina ubiquitario in ogni digestato Specie più efficienti per la velocità massima di produzione di metano: Clade 3, 5, 6 Methanoculleus spp, Methanobrevibacter thaueri e Methanobacterium subterraneum specifici nel mais
Conclusioni Conclusioni Produzione di biogas: -Efficienza della canna comune simile al mais, sia considerando il potenziale metanigeno che la resa metanigena ad ettaro. Analisi digestato: -Valori di azoto e fosforo confrontabili con quelli del mais; valori di potassio e carbonio organico inferiori rispetto al mais. -Sviluppo di specie di archea metanigeni ubiquitari (Methanosarcina) legati al potenziale metanigeno (MYP). -Selezione di archea metanigeni specifici della canna comune (Methanoculleus thermophilicus, Methanoculleus bourgense). -Selezione di archea metanigeni specifici del mais (Methanoculleus spp. Methanobrevibacter thaueri, Methanobacterium subterraneum) legati alla velocità massima di produzione del metano (Rmax).
Ringraziamenti Prof. Enrico Bonari Dott.ssa Lucia Guidi Dott. Giorgio Ragaglini Dott.ssa Elisa Pellegrino Dott. Cristiano Tozzini Prof. Michael Klocke Contatti Elisa Corneli - PhD student LandLab - Istitute of Life Sciences - Scuola Superiore Sant'Anna Via S. Cecilia 3 56127 Pisa Italy Tel +39 050 883181 Fax: +39 050 883526 Email: e.corneli@sssup.it elisacorneli@hotmail.it