DIREZIONE GENERALE DELLA RICERCA SANITARIA E BIOMEDICA E DELLA VIGILANZA SUGLI ENTI

DIREZIONE GENERALE DELLA RICERCA SANITARIA E BIOMEDICA E DELLA VIGILANZA SUGLI ENTI Convenzione tra il Ministero della Salute, la Regione Puglia, la dott.ssa Nicoletta Resta, per la regolamentazione dello svolgimento dei programmi della Ricerca Sanitaria relativi al biennio 2011-2012, afferenti l Area - Ricerca Finalizzata (RF) Biomedical Convenzione n.63/rf-2011-02352088 Premesso che a seguito di quanto disposto dall art. 12 e dall art. 12 bis del D. Lgs. 30 dicembre 1992 n.502, come modificato e integrato dal D. Lgs. 229/99, concernenti il finanziamento a carico del Ministero della Salute dei progetti di ricerca presentati dai Destinatari Istituzionali, individuati dalla normativa stessa, si rende necessario, ai fini dello svolgimento dei programmi di ricerca finalizzata per il biennio 2011-2012, approvati dalla Commissione Nazionale per la Ricerca Sanitaria nella seduta del 23 gennaio 2014, disciplinare i conseguenti rapporti di collaborazione e finanziari; il Ministro della Salute di concerto con il Ministro dell Istruzione dell Università e della Ricerca, su proposta della Commissione Nazionale per la Ricerca Sanitaria e sentita la Conferenza Stato Regioni, nell ambito del Programma per la Ricerca Sanitaria, ha emanato in data 7 novembre 2012 il Bando della Ricerca Finalizzata 2011-2012; con il Decreto Direttoriale del 28 dicembre 2012, registrato dall Ufficio Centrale di Bilancio presso questo Ministero -decreti nn. 9335 e 9336 del 21 gennaio 2013-, è stata autorizzata la spesa della somma complessiva di =132.931.095,00= (centotrentaduemilioninovecentotrentunomilanovantacinque/00) sul capitolo n.3398 p. g.1 Spese per la ricerca finalizzata in attuazione degli obiettivi prioritari, biomedici e sanitari del Piano Sanitario Nazionale per la ricerca finalizzata 2011-2012; con Decreto Direttoriale del 5 marzo 2014, registrato dall Ufficio Centrale di Bilancio con visto n. 508 del 12 marzo 2014, sono state approvate le graduatorie relative alle specifiche aree di finanziamento con contestuale ripartizione dei fondi assegnati ai progetti di ricerca finalizzata per il biennio 2011-2012 per complessivi di =125.833.595,00= (centoventicinquemilioniottocentotrentatremilacinquecentonovantacinque/00), così come approvati dalla Commissione Nazionale per la Ricerca Sanitaria nella seduta del 23 gennaio 2014, tra cui è previsto lo svolgimento del Progetto dal titolo Meeting senior members in the search for new associates of the exclusive hamartromatous gene club - codice WFR RF-2011-02352088, presentato dal Destinatario Istituzionale, Regione Puglia. Per il predetto progetto è stato autorizzato un finanziamento da parte del Ministero della Salute pari a =.=405.109,16= (quattrocentocinquemilacentonove/16); con specifica nota è stato comunicato a tutti i Destinatari Istituzionali la necessità di utilizzare prioritariamente le risorse impegnate a valere sui fondi 2012, non ancora in regime di perenzione, quale anticipo per l avvio di tutti i progetti utilmente collocati nelle varie graduatorie, con la sola esclusione di quelli rientranti nei programmi Network; IL MINISTERO DELLA SALUTE rappresentato dalla Dr.ssa M. Novella Luciani Direttore dell Ufficio IV ex Dgrst La Regione Puglia (nel prosieguo denominato Destinatario Istituzionale) Rappresentato da - On. Nicola Vendola - Legale Rappresentante La dott.ssa Nicoletta Resta (nel prosieguo denominato Principal Investigator) stipulano e convengono quanto segue: 1

Articolo 1 La presente convenzione regola l affidamento da parte del Ministero della Salute Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti - al Destinatario Istituzionale del Progetto di ricerca finalizzata dal titolo Meeting senior members in the search for new associates of the exclusive hamartromatous gene club che viene finanziato dal Ministero della Salute per un importo di =.=405.109,16= (quattrocentocinquemilacentonove/16) con imputazione all u.p.b. 3.1.2.10. ricerca scientifica capitolo 3398 P.G.1. Articolo 2 Il Destinatario Istituzionale ed il Principal Investigator svolgeranno il progetto secondo quanto riportato nel piano esecutivo presentato e approvato da questo Ministero ed in ottemperanza a quanto previsto dal Bando per la ricerca sanitaria 2011-2012 di cui in premessa. Sono allegati alla presente convenzione e ne costituiscono parte integrante: il predetto piano esecutivo, le dichiarazioni indicanti le Unità Operative coinvolte nel progetto, la dichiarazione del Destinatario Istituzionale in cui si precisa che il Responsabile Scientifico svolgerà in via esclusiva la propria attività presso la struttura del SSN individuata dal Destinatario Istituzionale medesimo, il cronoprogramma, unitamente alle schede finanziarie rimodulate. Articolo 3 La ricerca avrà la durata di tre anni e dovrà avere inizio entro trenta (30) giorni dalla ricezione da parte del Destinatario Istituzionale della nota con la quale il Ministero della Salute Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti - comunicherà l'avvenuta approvazione e registrazione della presente convenzione. Il Destinatario Istituzionale dovrà comunicare la data d inizio della ricerca, con nota sottoscritta dal Coordinatore Scientifico e dal Legale rappresentante del Destinatario Istituzionale medesimo. Gli adempimenti previsti ai commi 1 e 2 del presente articolo costituiscono presupposti indispensabili per avviare la procedura di cui al successivo art. 4. Il monitoraggio e la verifica del raggiungimento degli obiettivi del progetto di ricerca di cui alla presente convenzione sono affidati alla Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti. Le parti convengono che, nel caso il Destinatario Istituzionale sia accreditato ad operare sulla rete del Workflow della Ricerca, le comunicazioni, relative a tale convenzione, saranno effettuate unicamente attraverso il sistema di monitoraggio delle ricerche presente su tale rete. Articolo 4 La prima rata sarà pari a =165.564,06= (centosessantacinquemilacinquecentosessantaquattro/06); la procedura per il pagamento di tale rata sarà avviata dopo la comunicazione da parte del Destinatario Istituzionale della data di inizio attività della ricerca, di cui al comma 2 dell art.3, con contestuale richiesta del pagamento. La successiva rata pari a =158.523,27= (centocinquantottomilacinquecentoventitre/27) verrà erogata dopo la presentazione ed approvazione della relazione, di cui al successivo art. 5. Il rimanente saldo pari al 20% del finanziamento totale, di cui all art.1 della presente convenzione, verrà corrisposto dopo l approvazione della conclusione del progetto, secondo le modalità stabilite dal successivo art. 7 della presente convenzione. A garanzia della coerenza con l inizio dell attività dichiarata, il Destinatario Istituzionale si impegna ad anticipare le risorse economiche necessarie, nell eventualità in cui le somme da corrispondersi ricadano in regime di perenzione. Articolo 5 Il Destinatario Istituzionale dovrà trasmettere, anche per quanto previsto dall articolo 4, al Ministero della Salute, Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti, allo scadere dei 18 mesi dall inizio della ricerca e comunque non oltre i sessanta (60) giorni da tale termine, una relazione sullo stato d attuazione complessivo della ricerca, sottoscritta dal Responsabile Scientifico e dal Legale Rappresentante. La predetta relazione, oltre a contenere la descrizione dell attività svolta dalle singole Unità Operative, dovrà anche essere preceduta da una sintesi, a cura del responsabile scientifico del progetto, che descriva nella globalità lo stato di avanzamento dei lavori di ricerca. Nel caso il Destinatario Istituzionale non adempia a quanto previsto dai precedenti commi, la Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti ha facoltà, previa comunicazione preventiva, di attivare le procedure per la sospensione del finanziamento ed il recupero delle somme erogate comprensive degli eventuali interessi legali maturati. Nel caso in cui la relazione non sia considerata dalla Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti idonea a dimostrare lo stato di avanzamento della ricerca, secondo quanto previsto nel piano esecutivo approvato, l Ufficio preposto provvederà a richiedere chiarimenti ed integrazioni al Destinatario Istituzionale che dovrà fornire risposta entro i successivi 30 giorni. 2

Nel caso i chiarimenti pervenuti non consentano all Ufficio di esprimere un motivato parere favorevole lo stesso trasmetterà la documentazione alla Commissione Nazionale per la Ricerca Sanitaria per le valutazioni di competenza, dandone comunicazione al Destinatario Istituzionale. E facoltà del Destinatario Istituzionale presentare le proprie controdeduzioni prima della seduta di valutazione della CNRS. Il Destinatario Istituzionale, s impegna fin d ora ad accettare quanto sarà deciso dalla Commissione stessa. Articolo 6 Durante lo svolgimento della ricerca potranno essere richieste modifiche al piano esecutivo. Tali modifiche, comunque, non dovranno stravolgere l impianto complessivo del documento originario allegato al presente accordo. Le proposte di variazioni, corredate dalle motivazioni fornite dal responsabile della ricerca dovranno comprovare che le modifiche stesse siano richieste per assicurare il raggiungimento degli obiettivi e che risultino indispensabili per tale finalità. Le richieste in questione dovranno essere sottoposte all'approvazione del Ministero della Salute Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti - con nota firmata dal Responsabile Scientifico e dal Legale Rappresentante del Destinatario Istituzionale ed avranno effetto solo dopo l eventuale approvazione. Si precisa che le eventuali modifiche apportate non devono in ogni caso comportare un aumento del finanziamento a carico del ministero. Articolo 7 A conclusione del progetto di ricerca, per il pagamento del saldo, dovrà essere inoltrata, non oltre sessanta (60) giorni dalla data del termine della ricerca, al Ministero della Salute Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti - una relazione conclusiva che dimostri esaustivamente la coerenza dell attività svolta con il programma esecutivo approvato, gli obiettivi raggiunti e i documenti prodotti e le relative pubblicazioni realizzate, nonché il resoconto economico complessivo delle spese sostenute con i fondi ministeriali, unitamente ad una relazione dettagliata. La predetta relazione, oltre a contenere la descrizione dell attività svolta dalle singole unità operative, dovrà anche essere preceduta da una sintesi, a cura del responsabile scientifico del progetto, che descriva nella globalità il risultato della ricerca. Sia la relazione che il resoconto economico dovranno essere inviati seguendo l eventuale modulistica predisposta dalla Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti tramite il workflow della ricerca, al fine di consentire il monitoraggio da parte della Commissione Nazionale della Ricerca Sanitaria. L eventuale documentazione di supporto dovrà rimanere a disposizione della Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti presso il Destinatario Istituzionale che provvederà alla relativa custodia. Nel caso il Destinatario Istituzionale non adempia a quanto previsto dai commi 1, 2 e 3 del presente articolo, la Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti, previa comunicazione preventiva, attiverà le procedure per la sospensione del finanziamento, richiedendo contestualmente la rendicontazione delle spese sostenute, per le conseguenti valutazioni economiche. Nel caso in cui la relazione non sia considerata dalla Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti idonea a dimostrare lo stato di avanzamento della ricerca secondo quanto previsto nel piano esecutivo approvato, l Ufficio preposto, provvederà a richiedere chiarimenti ed integrazioni al Destinatario Istituzionale che dovrà fornire risposta entro i successivi 30 giorni. Nel caso i chiarimenti pervenuti non consentano all Ufficio di esprimere un motivato parere favorevole lo stesso trasmetterà la documentazione alla Commissione Nazionale per la Ricerca Sanitaria per le valutazioni di competenza, dandone comunicazione al Destinatario Istituzionale. E facoltà del Destinatario Istituzionale presentare le proprie controdeduzioni prima della seduta di valutazione della CNRS. Il Destinatario Istituzionale, s impegna fin d ora ad accettare quanto sarà deciso dalla Commissione stessa. Articolo 8 Il Ministero della Salute Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti - in via autonoma o sentita la Commissione Nazionale per la Ricerca Sanitaria, ha facoltà di chiedere chiarimenti e può disporre verifiche durante lo svolgimento della ricerca. Articolo 9 Il termine della ricerca potrà essere prorogato dal Ministero della Salute Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti -, per un periodo massimo di mesi 12 dalla data di scadenza iniziale, a seguito di formale, motivata e documentata richiesta del Destinatario Istituzionale inoltrata a firma del Responsabile Scientifico e del Rappresentante Legale, non oltre i novanta (90) giorni precedenti la data di scadenza della presente convenzione. 3

Articolo 10 La presente convenzione, vincolante all'atto della sottoscrizione per il Destinatario Istituzionale ed il Principal Investigator, sarà tale per il Ministero della Salute solo dopo la sua approvazione e registrazione da parte dei competenti organi di controllo. Articolo 11 La proprietà degli studi, dei prodotti e delle metodologie sviluppati nell ambito del progetto è regolamentata dalla normativa vigente in materia, salvo particolari accordi stipulati tra le parti firmatarie del presente atto, ferma restando la possibilità dei soggetti istituzionali del Servizio Sanitario Nazionale di fruirne, previa richiesta alle parti firmatarie. Nel caso il contraente intenda trasferire ad altri soggetti qualsiasi diritto, anche parziale, relativo alla ricerca in questione, ai risultati della stessa o ad eventuali brevetti derivati deve farne esplicita richiesta al Ministero della Salute Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti -. Qualsiasi documento o prodotto, ivi comprese le pubblicazioni scientifiche, inerenti al progetto deve contenere l indicazione che gli stessi sono stati ottenuti con il finanziamento del Ministero della Salute. Il Ministero della Salute applicherà una decurtazione pari al 5% (cinque per cento) del finanziamento complessivo, qualora dalle verifiche effettuate risultasse non attuata la precedente disposizione. Le parti convengono che il Ministero della Salute potrà dare direttamente diffusione pubblica, anche attraverso il proprio sito web, dei risultati della ricerca sia in forma completa che sintetica e delle pubblicazioni scientifiche da essa derivate. Articolo 12 I beni e gli strumenti necessari per l esecuzione del presente progetto, possono essere posti a carico dei fondi ministeriali qualora acquisiti a mezzo leasing, noleggio ovvero in comodato d uso, per un periodo pari alla durata originale del progetto. E fatto divieto di utilizzare i fondi del Ministero della Salute per l acquisto diretto di apparecchiature e materiale inventariabile e per il pagamento di quote parte stipendiali a favore del personale dipendente. Per il tempo strettamente necessario all esecuzione del progetto, sono ammessi unicamente contratti di lavoro subordinati o parasubordinati. Ogni diversa regolamentazione al riguardo, deve essere adottata con apposito atto scritto fra le parti firmatarie della presente convenzione, da recepire con motivato decreto da sottoporre al visto di competenza degli Organi di Controllo. Articolo 13 Le parti contraenti prendono atto che il finanziamento del presente progetto ricade nella gestione dei fondi per il finanziamento delle attività di ricerca o sperimentazione, delle unità previsionali di base 3.1.2.10. Ricerca Scientifica capitolo 3398, di pertinenza del centro di responsabilità Dipartimento della Sanità pubblica e dell Innovazione Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti dello stato di previsione del Ministero della Salute, in relazione a quanto disposto dal D.lgs. 502/92 e successive modifiche ed integrazioni. Articolo 14 Le parti si impegnano all osservanza, per quanto di rispettiva competenza, delle disposizioni inerenti la tracciabilità dei flussi finanziari contenute nell art.3 legge 13 agosto 2010 n.136, e successive modifiche ed integrazioni. Si richiama particolare attenzione, al disposto del comma 5 ove si fa esplicito riferimento al Codice Unico di Progetto (CUP), di cui alla legge 16/01/2003 n.3. A tal fine il Destinatario Istituzionale si impegna a comunicare al Ministero della Salute Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti, il numero di Codice Unico di Progetto (CUP) al momento della comunicazione di cui all articolo 3 comma 2 della presente convenzione. PER IL DESTINATARIO ISTITUZIONALE Regione Puglia On. Nicola Vendola - Legale Rappresentante c.f. VNDNCL58M26A662L IL PRINCIPAL INVESTIGATOR Dott. Nicoletta Resta c.f. RSTNLT65H65E038D PER IL MINISTERO DELLA SALUTE Il Direttore dell Ufficio IV ex Dgrst Dr.ssa M. Novella Luciani Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti Documento sottoscritto dalle parti con firma digitale, ai sensi dell art. 21 del d. lgs. 7 marzo 2005, n.82. 4

Identification of new genes and mutation screening in known genes in patients with hamartoma syndromes by NGS Assessment of the genotype-phenotype correlations, assessment of relative and cumulative cancer risks Molecular characterization of lesions in patients with PTEN Tumor Hamartoma Syndrome (PTHS) and evaluation of response to tumorigenic stimuli such as ionizing radiation Functional characterization of LKB1 mutants in vitro (MEFs, DLD1, DU145 cells) and in vivo (xenografted nude mice) models

Ministero della Salute BANDO PROGETTI DI RICERCA GIOVANI RICERCATORI - RICERCA FINALIZZATA 2011-212 Codice Progetto: RF-2011-02352088 Progetto: MEETING SENIOR MEMBERS IN THE SEARCH FOR NEW ASSOCIATES OF THE EXCLUSIVE HAMARTOMATOUS GENE CLUB Destinatario Istituzionale: Regione Puglia DATI DEL PRINCIPAL INVESTIGATOR E DEI COORDINATORI DELLE UNITA OPERATIVE Nome Cognome Data di Nascita Codice Fiscale Nicoletta Resta 25/06/65 RSTNLT65H65E038D RIFERIMENTI PROFESSIONALI Sede Lavoro Posizione Attuale Indirizzo Lavoro Sede di svolgimento del Progetto U.O.1-Istituzione Divisione Responsabile U.O. Indirizzo Lavoro U.O.2-Istituzione Divisione Responsabile U.O. Indirizzo Lavoro U.O.3-Istituzione Divisione Responsabile U.O. Indirizzo Lavoro Professore Associato di Genetica Medica- Direttore Telefono Fax E-mail Cellulare 080/5593619-3621 080/5593618 nicoletta.resta@uniba.it 3288481555 UNITA OPERATIVE AZIENDA OSPEDALIERO-UNIVERSITARIA CONSORZIALE POLICLINICO DI BARI Nicoletta Resta Telefono Fax E-mail 080/5593619-3621 080/5593618 nicoletta.resta@uniba.it Emilia-Romagna, AOU di Bologna Policlinico S. Orsola-Malpighi Unità Operativa di Genetica Medica Daniela Turchetti Via Massarenti 9, 40138 BOLOGNA Telefono Telefono Telefono 051 2088436 051 2088436 051 2088436 AZIENDA OSPEDALIERO-UNIVERSITARIA CONSORZIALE POLICLINICO DI BARI Cristiano Simone Telefono Fax E-mail 080/5478270 080/5593618 cristiano.simone@uniba.it

BANDO PROGETTI DI RICERCA GIOVANI RICERCATORI - RICERCA FINALIZZATA 2011-212 Codice Progetto: RF-2011-02352088 Progetto: MEETING SENIOR MEMBERS IN THE SEARCH FOR NEW ASSOCIATES OF THE EXCLUSIVE HAMARTOMATOUS GENE CLUB Destinatario Istituzionale: Testo Italiano Nuovi membri incontrano i soci fondatori dell esclusivo gene club delle sindromi amartomatose Riassunto Le Sindromi Amartomatose (SA) sono un gruppo eterogeneo di malattie ereditarie, con manifestazioni cliniche sovrapponibili e associate spesso a un ampio spettro di tumori extraintestinali. Questo rende molto difficile la diagnosi differenziale e allo stato attuale non esistono linee guida universalmente accettate. La mutation detection rate registrata negli ultimi anni è del 10-30%, quindi per molti pazienti il test genetico non ha permesso di identificare le mutazioni causative. L'implementazione e l'espansione degli approcci di Next Generation Sequencing (NGS) miglioreranno notevolmente la sensibilità e la specificità dell analisi mutazionale, cosi da fornire ai familiari a rischio un adeguata consulenza genetica e una migliore predizione del rischio e delle manifestazioni cliniche. Inoltre, la caratterizzazione funzionale delle mutazioni nei geni LKB1 e PTEN potrà chiarire nuove correlazioni genotipo-fenotipo. Stato dell Arte Il gruppo delle SA comprende diverse patologie ereditarie (Sindrome di Peutz-Jeghers, Poliposi Giovanile, Sindrome tumorale amartomatosa legata a mutazioni del gene PTEN, ecc) caratterizzate dalla crescita di polipi amartomatosi in diversi organi e da un rischio aumentato di sviluppare neoplasie. L identificazione di pazienti affetti da SA è fondamentale per l attuazione di protocolli specifici di sorveglianza clinica e strumentale, tuttavia, le SA spesso non sono diagnosticate e molti aspetti non sono ancora chiari. In primo luogo, il rischio di cancro nei pazienti italiani con SA non è noto. In secondo luogo, il test genetico è spesso non conclusivo, a causa dell eterogeneità genetica delle SA, ma anche per la presenza di una frazione di geni ancora sconosciuti. I fenotipi sovrapponibili delle differenti SA suggeriscono che i geni responsabili di una sindrome, così come altri geni dello stesso pathway potrebbero avere un ruolo causativo o modificatore in altre SA. Infine, i meccanismi mediante i quali le mutazioni in geni SA causano amartomi e neoplasie devono essere chiariti. Infatti, sebbene PTEN sia considerato un gene "aploinsufficiente" e le cellule di tutti i pazienti sono portatrici di una mutazione, solo una minoranza mostra una proliferazione anomala. IPOTESI E OBIETTIVI SPECIFICI Ipotesi e significato: Verificare l appropriatezza e la specificità dei criteri clinici delle sindromi amartomatose in relazione a un determinato genotipo, fornire una stima del rischio tumorale in base alla sede dell organo e all'età dei pazienti nella popolazione italiana per migliorare la diagnosi e il management dei pazienti stessi. Tutti gli studi riportati in letteratura sono condotti su un piccolo numero di pazienti/famiglie mentre, gli unici studi pubblicati finora condotti su larga scala,sono tutti riferiti alla popolazione statunitense (Sindromi PTEN

relate). Le mutazioni nel gene LKB1,riportate finora,inficiano la sua localizzazione subcellulare e/o l'attività chinasica alterando la polarizzazione cellulare e il controllo del ciclo cellulare. Non sono disponibili in letteratura dati in termini di prognosi e di risposta alla terapia. Si specifica inoltre che, in caso d identificazione di mutazioni nuove e inattese, noi le caratterizzeremo mediante saggi biochimici, molecolari e cellulari. Obiettivi Specifici: Identificazione di nuovi geni e screening di geni noti in pazienti con Sindromi Amartomatose utilizzando la tecnologia del Next Generation Sequencing (NGS). Un nuovo pannello (SA) per risequenziamento mirato di geni associati a forme di predisposizione allo sviluppo di neoplasie sarà realizzato. Il pannello (SA) comprenderà geni associati a fenotipi SA e altri geni noti di predisposizione al cancro. Il pannello sarà utilizzato per eseguire NGS in pazienti privi di mutazioni patogenetiche arruolati dalle Unità di Ricerca di Bari e Bologna; valutazione delle correlazioni genotipo-fenotipo e stima dei rischi cumulativi e relativi di tumore in un'ampia coorte omogenea di pazienti con Sindromi Amartomatose Caratterizzazione funzionale di mutanti LKB1 in modelli in vitro (MEFs, DLD1, DU145) e in vivo (xenotrapianto topi nudi); Caratterizzazione molecolare delle lesioni di pazienti con Sindromi tumorale Amartomatosa legata a PTEN (PTHS) e risposta delle cellule eterozigoti per mutazioni PTEN a stimoli cancerogeni, quali le radiazioni ionizzanti. Disegno Sperimentale Obiettivo 1: Sarà realizzato un pannello comprendente i seguenti geni: APC, BMPR1A, ENG, MUTYH, PTEN, SMAD4, STK11, PI3KCA, PIK3R1-3,AKT1-3, mtor e i targets a valle del pathway PI3K. Il sequenziamento massivo parallelo di tutti i geni nel pannello SA sarà effettuato utilizzando le tecnologie NGS. Le varianti potenzialmente causative della patologia e le regioni sotto rappresentate saranno identificate. Tutte le varianti identificate e le regioni sottorappresentate, saranno risequenziate utilizzando il sequenziamento tradizionale gold standard con la tecnica di Sanger, come metodo di conferma indipendente, su un sequenziatore ABI 310. Valutazione bioinformatica: le varianti potenzialmente patogenetiche saranno valutate con algoritmi webbased per prevedere i loro putativi effetti sulla proteina codificata o sul processamento del pre-mrna. Si procederà quindi a valutazione bioinformatica e clinica per definire in maniera conclusiva, ogni qualvolta possibile, il significato clinico delle varianti. Disegno Sperimentale Obiettivo 2: Una serie di 200 pazienti con SA reclutati da centri di riferimento sul territorio nazionale saranno valutati per stabilire correlazioni genotipo-fenotipo con particolare riferimento a rischio e morbidità per cancro. Negli ultimi 10 anni abbiamo collezionato dati molecolari e fenotipici di un cospicuo numero di pazienti SA portatori di mutazioni germinali deleterie dei geni PTEN/LKB1. Il nostro intento è studiare la correlazione tra genotipi specifici, rischio tumorale per sedi specifiche e manifestazioni benigne di tali sindromi. Le mutazioni puntiformi verranno ricercate utilizzando tecniche di sequenziamento, mentre la ricerca per delezioni/duplicazioni genomiche verrà effettuata mediante MLPA e acgh. Le mutazioni saranno

classificate in base al tipo e alla posizione nei geni o in specifici domini funzionali delle proteine, e solo mutazioni sicuramente patogeni che verranno prese in considerazione. Per tutti i pazienti si raccoglieranno informazioni cliniche dettagliate; in particolare, si utilizzeranno questionari specifici riportanti le manifestazioni delle SA e la loro evoluzione per stimare la prevalenza e il valore predittivo di ogni criterio, oltre che per definire correlazioni genotipo-fenotipo. In particolare, saranno prese in considerazione le caratteristiche istologiche dei polipi intestinali e delle lesioni mammarie e tiroidee e saranno necessari i dettagli dei tumori e delle lesioni precancerose diagnosticati ai pazienti (numero di tumori, localizzazione, classificazione istologica, età alla diagnosi, evoluzione clinica). Per l analisi dei rischi assoluti e cumulativi di sviluppare un qualsiasi tumore e dei rischi per specifici tumori, si utilizzerà il rapporto tra il numero dei casi osservati per ogni sede o gruppo di sedi nella coorte di pazienti con SA diviso per il numero atteso dei rispettivi tumori nella popolazione generale utilizzando la formula 1- e(-incidenza cumulativa). Saranno calcolati gli intervalli di confidenza Mid-P al 95%, così come i rischi relativi per qualsiasi tumore e per gli specifici tumori usando i tassi di incidenza per età (con classi d età di 5 anni) tratti dai registri generali di incidenza italiani ed europei (www.tumori.net ed EUROCARE). Il rischio cumulativo sarà calcolato usando il metodo di Kaplan-Meier con il software statistico STATA. Le differenze tra maschi e femmine saranno valutate mediante long-rank test. Il test esatto di Fisher a due code verrà utilizzato per valutare la significatività di tutte le analisi (Resta et al., 2013). Disegno Sperimentale Obiettivo 3: I costrutti di LKB1 wt e mutante verranno trasfettati in linee cellulari MEF-LKB1-KO, trasformate per overespressione degli oncogeni myc/ras, o in un contesto wild type, oppure in cellule DLD1 (dove il gene di LKB1 è inattivato dalla metilazione del promotore), o ancora in cellule DU145 (linea che presenta mutazioni costitutive nel gene di LKB1). Tutte le linee cellulari saranno testate per valutare l attivazione di pathway a valle, la proliferazione in vitro, il differenziamento, la progressione del ciclo cellulare ed i livelli metabolici. In aggiunta, verranno effettuati studi in vivo utilizzando modelli xenograft in topi nudi trattati con chemioterapici o farmaci a bersaglio molecolare. Inoltre, per identificare i meccanismi alla base della carcinogenesi in pazienti con mutazioni di PTEN, i fibroblasti dei pazienti verranno sottoposti a trattamento con radiazioni ionizzanti. Infine, si effettuerà una caratterizzazione molecolare di amartomi e tumori che si sono presentati in pazienti SA con lo scopo di comprendere quali siano gli eventi genetici coinvolti nella patogenesi di SA, con particolare attenzione per le sindromi legate a PTEN. Dati preliminari: Presso l'unità di Bologna, sono stati testati per mutazioni di PTEN 52 probandi, di cui 11 soddisfacevano i criteri clinici della sindrome di Cowden; in 10 di questi è stata evidenziata una mutazione patogenica di PTEN. La caratterizzazione molecolare del tessuto tumorale e amartomatoso in campioni di 3 pazienti ha suggerito un coinvolgimento di pathway diversi da quelli generalmente coinvolti nella genesi delle corrispettive lesioni sporadiche (es. polipi iperplastici). L'unità di Genetica Medica di Bari ha reclutato 119 pazienti PJS; 99 presentavano una mutazione identificabile di STK11/LKB1 ed erano disponibili per gli studi di correlazione genotipo-fenotipo e di valutazione del rischio di cancro. 71 pazienti appartenenti a 27 famiglie sono stati classificati come familiari, mentre 48 erano casi sporadici. I rischi relativi e cumulativi di cancro sono stati valutati in tutti questi pazienti. Inoltre, presso l unità di Bari sono stati identificati 83 pazienti con PTHS, e in 22 sono state

evidenziate mutazioni di PTEN, tra cui 6 grandi delezioni, 3 delle quali comprendenti il gene oncosoppressore contiguo BMPR1A. Infine, abbiamo già iniziato a caratterizzare due mutanti LKB1 nelle cellule mutanti DU145 in vitro. Perdita di attività della chinasi LKB1, anche quando la localizzazione nucleare viene mantenuta, influenza in modo significativo la progressione del ciclo cellulare e risposta cellulare a farmaci a bersaglio molecolare. Metodologie ed analisi statistica Next generation sequencing Si utilizzeranno TruSightExome, TruSightCancer ed un pannello disegnato ad hoc comprendente sonde oligo per il riconoscimento di geni e regioni genomiche tali da screenare approfonditamente le regioni codificanti selezionate utilizzando piattaforme miseq e HiSeq Illumina NGS. I campioni biologici in esame saranno i DNA isolati da campione di sangue dei pazienti affetti da SA. Verranno effettuate analisi mediante PCR e sequenziamento Sanger per confermare le mutazioni identificate mediante NGS. Analisi MLPA e acgh per l identificazione di grandi delezioni/duplicazioni genomiche dei geni PTEN e LKB1 completeranno lo screening di mutazioni. Analisi statistica La valutazione della significatività delle analisi di correlazioni delle associazioni genotipo-fenotipo verrà effettuata utilizzando il test Log-rank e il Two-tailed Fisher s. Il rischio cumulativo sarà calcolato utilizzando il metodo Kaplan-Meier con il software STATA (versione 11). Studi funzionali Il costrutto di LKB1 wt e del mutante verranno trasfettati in linee cellulari MEF LKB1 KO trasformate per overespressione degli oncogeni myc/ras o in un contesto wild type, oppure in cellule DLD1 (dove il gene di LKB1 è inattivato dalla metilazione del promotore), o ancora in cellule DU145 (linea che presenta mutazioni costitutive nel gene di LKB1), in analogia con quanto già descritto in Marignani et al, 2007. Gli studi verranno effettuati utilizzando le seguenti tecniche: Analisi Immunoblot con anticorpi fosfospecifici e saggio di attività chinasica dei target di LKB1 (AMPK, ACC, FoxO3A, p53); saggio di proliferazione in vitro WST-1 combinato al test con Trypan Blue, Colony formation assay, analisi al FACS della progressione del ciclo cellulare. Analisi molecolare mediante Real- Time PCR ed Immunoblot dell espressione dei marker proliferativi (cicline, CDK, CDKi, c-myc e target, b- catenina e target). Analisi del programma di differenziamento: Real-Time PCR e Immunoblot per valutare l espressione dei marker di differenziamento dei colonociti (Villina, SI, CDX-2) ed analisi ultrastrutturale al TEM per verificare la corretta formazione dell orletto a spazzola. Analisi Metabolica: misurazione di ATP, Lattato e Piruvato; valutazione della fosforilazione ossidativa mediante misurazione della respirazione mitocondriale.

Studi in vivo: linee cellulari trasfettate verranno inoculate sottocute in topi nudi trattati con chemioterapici (5-FU, CDDP, Irinotecano) o farmaci a bersaglio molecolare (inibitori di Akt, BRAF, MEK1, p38a, attivatori di AMPK). Dopo le appropriate misurazioni, i topi verranno sacrificati ed i tumori espiantati verranno analizzati mediante IHC per verificare i dati ottenuti in studi in vitro. La valutazione della senescenza, ma anche del danno e riparazione del DNA, sarà effettuata in fibroblasti di pazienti e di controlli prima e dopo il trattamento con radiazioni ionizzanti (radiazioni gamma 1-4 Gy). La senescenza sarà esaminata mediante analisi del fenotipo cellulare e mediante saggio dell attività della ß- galattosidasi. Inoltre, per valutare l attivazione di pathway molecolari coinvolti nella senescenza, sarà analizzata l espressione di p21-p53 e di Rb-p16INK4 mediante Western Blot. Il danno al DNA e la capacità di attivare i meccanismi di riparazione verranno analizzati mediantesaggi di immunofluorescenza specifici per l istone H2AX fosforilato. Nei tessuti tumorali di pazienti portatori di una mutazione in un gene SA (LKB1, PTEN, BMPR1, SMAD4, FLCN), saranno analizzate eventuali perdite negli altri geni mediante Real-Time PCR Copy NumberAssay applicando la tecnica Universal Probe Library (Roche Diagnostics); questo approccio si è rivelato ottimale nel rilevare la doppia eterozigosi FLCN/PTEN in tumori provenienti da pazienti che presentano mutazioni germinali di PTEN o FLCN (Pradella et al, 2013). Inoltre, in tessuti tumorali la prevalenza di mutazioni hot spot in BRAF, KRAS, PIK3CA, CTNNB1, HRAS, AKT, KIT sarà valutata utilizzando il sequenziamento tradizionale Sanger. Risultati attesi Ci si prefiggono i seguenti risultati: - Sviluppare uno strumento diagnostico che conduca ad una diagnosi molecolare conclusiva nella maggior parte dei pazienti con SA. Se, viceversa, questo approccio non risultasse efficace nell identificare la mutazione causativa in pazienti con fenotipi suggestivi, si effettuerà sequenziamento Whole Exome o Whole Genome di pazienti selezionati con l'obiettivo di scoprire nuovi difetti genetici causativi. - Ottenere le stime del rischio di cancro nei pazienti italiani con SA. Poiché un bias potrebbe essere introdotto da inesattezze nelle diagnosi di cancro riferite, si includeranno soltanto diagnosi di cancro confermate dai referti istologici. Se la mancanza di informazioni cliniche rischiasse di ridurre il potere statistico delle analisi, un unità di personale clinico specificamente addestrata sarà dedicata alla raccolta di ulteriore documentazione clinica. - Chiarire le interazioni dei diversi geni SA tra loro e con mutazioni somatiche in oncogeni noti nello sviluppo del fenotipo. - Fornire conoscenze sugli effetti biologici delle mutazioni in LKB1 e PTEN attraverso studi in vitro e in vivo. Attrezzature e risorse disponibili L Unità di Bologna consta di un ambulatorio di Genetica medica clinica per pazienti esterni,ogni anno all incirca 1000 famiglie si rivolgono ad essa e uno spazio di laboratorio di circa 350mq. Le attrezzature in dotazione sono: Sequenziatore automatico a 48 capillari mod.3730 ABI, Termociclatori 9700ABI, strumento per Realtime 7500 FAST Applied Biosystem, camere per colture cellulari dotate di cappe, incubatori e microscopi ottici e a fluorescenza. Strumento per DHPLC, microscopio Axiophot, e strumentazione di base per un laboratorio di biologia molecolare. Forno Agilent per ibridazione, scanner Agilent per a-cgh

L unità di Bari consta di una unità di Consulenza Genetica e di un laboratorio di Genetica Medica con un flusso di 1400 pazienti all anno. Camera per colture cellulari dotate di cappe, incubatori e microscopi ottici e a fluorescenza Leica DHRA2 e Zeiss Axioskop, 5 termociclatori, strumento per DHPLC, strumenti per Realtime icycler Biorad e Rotorgene utile anche per High Resolution Melting, 3 sequenziatori automatici ABI 310. Rilevanza Traslazionale e impatto per il Sistema Sanitario Nazionale Un risultato atteso del progetto è l incremento della detection rate dei test genetici disponibili per le SA. Il raggiungimento di una diagnosi genetica conclusiva nei pazienti renderà disponibile il test predittivo per i loro parenti: i portatori di mutazione saranno gestiti in maniera appropriata in relazione ai loro rischi specifici, mentre i non portatori eviteranno esami costosi e inutili. Inoltre, i dati ottenuti sui rischi di cancro nei pazienti italiani consentiranno di ottimizzazione la loro gestione indirizzando tipi e tempi di sorveglianza sulla base del loro genotipo. In questi pazienti è atteso un miglioramento del rapporto costi benefici nelle strategie di prevenzione del cancro.

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