ALUNNO: Stefano Vicino CLASSE: 2 G DATA: 11/11/2011 ESPERIMENTO N : 1 TITOLO: Verifica della fermentazione alcolica SCOPO: > Verificare lo svolgimento della fermentazione alcolica da parte del Saccharomyces cerevisiae in ambiente anaerobico. > Constatare i parametri necessari e quelli che condizionano lo svolgimento della fermentazione STRUMENTI: > 6 Provette, > 1 Becker (800 ml),, > 1 Portaprovette, > 1 cilindro graduato > Fornello elettrico,> Termometro, > Bilancia analitica, > Capillari in gomma > 4 Beute, > Spruzzetta. SOSTANZE: > Acqua distillata (H 2 O) > Blu di bromotimolo (C 27 H 28 Br 2 O 5 S) > Saccarosio (C 12 H 22 O 11 ) > Lievito di birra (Saccharomyces cerevisiae) PRINCIPI TEORICI: > La fermentazione è un processo di respirazione anaerobico caratteristico dei lieviti svolto in alternativa alla respirazione vera e propria per ricavare energia. Possiamo distinguere due momenti nel processo della fermentazione: 1)La glicolisi, svolta anche durante la normale respirazione cellulare, è un processo che avviene nel citoplasma in cui una molecola di glucosio viene scissa in 2 di acido piruvico in seguito a diverse trasformazioni e comporta l utilizzo di 2 molecole di ATP (macromolecola con contenuto energetico in quantità utile alla cellula) ed il ricavo di 4 per un guadagno finale di 2 molecole. 2)La rigenerazione del NAD + ridotto. Il NAD + è un coenzima che ha il compito di trasportare elettroni durante la respirazione cellulare all interno dei mitocondri. La sua forma ridotta è NADH che ha un alto contenuto energetico (circa 2,5 ATP) ma per essere utilizzata ha bisogno della presenza dell ossigeno, che non è presente nella fermentazione in quanto processo anaerobico. Perciò quest ultimo viene nuovamente ossidato seguendo diversi procedimenti in base al tipo di fermentazione. > La fermentazione analizzata è quella Alcolica, fermentazione svolta dai lieviti come il Saccharomyces cerevisiae e utilizzata per la lievitazione del pane o la produzione di aceto.
Questa dopo la glicolisi vede la sottrazione di una molecola di anidride carbonica dall acido piruvico che verrà poi liberata nello spazio extracellulare. Spezzando il gruppo -COOH viene a formarsi come prodotto intermedio l'aldeide acetica, estremamente velenosa. Questa viene infine arricchita di due ioni idrogeno, la cellula ricarica così le molecole di NAD e forma, in qualità di sottoprodotto, l'etanolo. Tutto il processo è riassumibile nella reazione generale descritta da Gay-Lussac: C 6 H 12 O 6 2 C 2 H 5 OH + 2 CO 2 > I lieviti sono aggregati di monocellulari eucarioti, generalmente a forma ellittica o sferica, indipendenti tra loro. Appartengono al regno dei funghi e attualmente si contano più di mille categorie diverse. Il lievito utilizzato in questa esperienza è il Saccharomyces cerevisiae, comunemente definito lievito di birra, perché un tempo veniva ricavato dai residui della fermentazione della birra. Quest ultimo produce l enzima zimasi, catalizzatore della reazione di fermentazione degli zuccheri in alcol etilico e anidride carbonica. > Da ciò possiamo dedurre che, se il lievito sviluppasse la fermentazione alcolica, dovrebbe liberare nell aria CO 2. Ma come constatare ciò, e soprattutto come distinguerlo da altri gas? Una volta sviluppatasi la CO 2 dovrebbe viaggiare attraverso i capillari e finire nella provetta. Una volta in soluzione dovrebbe dunque reagire con l acqua presente in essa e dunque sviluppare la seguente reazione: CO 2 + H 2 O H 2 CO 3 Questa reazione vede lo svilupparsi dell acido carbonico che andrà dunque a modificare il ph della soluzione nella provetta. Basterà dunque utilizzare un indicatore per rilevare le variazioni di ph, in caso di variazioni verso l acido constateremo lo sviluppo della reazione e, di conseguenza la presenza della CO 2 sviluppata dalla fermentazione. > Le variazioni di ph sono molto piccole in quanto l acido sviluppato è un acido debole. Perciò occorre l utilizzo di un indicatore molto sensibile come il blu di bromotimolo. Le variazioni di tonalità di questo indicatore vanno dal blu (ph basico) al verdastro (ph leggermente neutro) fino al giallo (ph acido).
MODALITA OPERATIVE: 1)PREPARAZIONE STRUMENTAZIONE: Innanzitutto abbiamo preparato gli ambienti in cui immergere pari quantità di lievito di birra: 1) Beuta 1: H 2 O 2) Beuta 2: H 2 O + Saccarosio 20% 3) Beuta 3 H 2 O + Saccarosio 50% Il quarto ambiente è stato riscaldato fino alla temperatura di 28/29 C a bagnomaria 4) Beuta 4: H 2 O + Saccarosio 50% 28/29 C Una volta sigillati i 4 ambienti mediante tappi di gomma abbiamo versato pari quantità di una soluzione di blu di bromotimolo misurate mediante il cilindro graduato in 6 provette ed infine collegato 4 di queste alle 4 beute mediante capillari di gomma. Provetta Provetta Provetta Provetta Provetta Provetta 1 2 3 4 5 6 Beuta 4 Beuta 1 Beuta 2 Beuta 3
2)PROCEDIMENTO: Abbiamo introdotto il lievito di birra nei 4 ambienti. Le 2 provette non collegate ad una beuta (la 5 e la 6) serviranno come campione di controllo: nella 5 abbiamo immesso solo bromotimolo + H 2 O in modo da dimostrare che aria e altri agenti esterni non interferiscono con l acidificazione della soluzione, mentre nella 6 abbiamo immesso bromotimolo con acido carbonico in modo da dimostrare che una sostanza acida non varia il suo ph al contatto con il bromotimolo o con agenti esterni. Dopodiché abbiamo atteso il manifestarsi della fermentazione. 2)OSSERVAZIONI: 1) Dopo pochi minuti era già visibile lo svolgersi della fermentazione nelle beute 2 e 3 da cui veniva emessa CO 2 riconoscibile nelle bollicine sviluppatesi nella provetta collegata. Inoltre era visibile una variazione di colorazione tendente al giallo sintomo dello sviluppo dell acido carbonico. I due campioni di confronto e la provetta 1 non hanno variato colorazione come ci aspettavamo. Provetta Provetta Provetta Provetta Provetta Provetta 1 2 3 4 5 6 Beuta 4 Beuta 1 Beuta 2 Beuta 3
2) A distanza di 2 giorni abbiamo effettuato una seconda osservazione: -La provetta numero 1 ha assunto una colorazione leggerissima tendente al verde nella parte superiore; -La provetta numero 2 si presenta con colorazione gialla eccetto la parte superiore di un verdino giallastro; -Le provette 3 e 4 sono rimaste di colore giallo; I campioni di riferimento 5 e 6 sono rimasti rispettivamente blu e giallo. Provetta Provetta Provetta Provetta Provetta Provetta 1 2 3 4 5 6 Beuta 4 Beuta 1 Beuta 2 Beuta 3
Per dare un idea più chiara delle sfumature ecco un immagine scattata al momento della seconda osservazione: In base ai dati raccolti dalle 2 osservazioni abbiamo tratto le nostre conclusioni. CONCLUSIONI: > Secondo i principi teorici la prima provetta non avrebbe dovuto variare colorazione in quanto collegata ad una beuta in cui non era presente saccarosio; il leggero variare del colore può essere attribuito solo alla presenza di residui di nutriente all interno della beuta o comunque nell ambiente circostante al lievito. > La seconda provetta ha avuto un iniziale variazione di colore verso il verde-giallo come ci aspettavamo ma, successivamente, è tornata verde. Da ciò si può dedurre che, dato che il saccarosio era presente in una minima quantità pari al 20%, se l acido sviluppato è di quantità minima e, di conseguenza la variazione di ph lo è altrettanto, la reazione diventa reversibile e l acido carbonico si ridivide in H 2 O e CO 2. > Come ci aspettavamo la beuta numero 3, in cui il saccarosio era presente al 50%, ha sviluppato una grande quantità di CO 2, conseguenza di una lunga fermentazione che ha reso la soluzione nella provetta 3 di un giallo vivo che non ha più variato di tonalità. > La beuta 4 avrebbe dovuto sviluppare la stessa quantità di CO 2 della beuta 3, cosa che è accaduta e che ha reso la provetta 4 di colore giallo, ma in molto meno tempo a causa dell energia prodotta dall alta temperatura. Ciò non è accaduto in quanto la beuta 4 era di dimensioni notevolmente più grandi delle altre 3 e dunque ha mantenuto più CO 2 al suo interno a differenza delle altre. > I campioni di controllo non hanno variato la loro colorazione: ciò vuol dire che nessun agente esterno interagisce con il nostro esperimento.