www.fisiokinesiterapia.biz LA REGOLAZIONE GENICA DEGLI EUCARIOTI 2
Livelli di regolazione genica degli Eucarioti -Controllo co-traduzionale e post-traduzionale -Localizzazione finale della proteina -Modificazioni post-traduzionali della proteina -Stabilità del prodotto proteico e sua degradazione -Penetrazione della proteina negli organuli cellulari
Livelli di regolazione genica degli Eucarioti SEDE DI SINTESI -Il ribosoma può posizionarsi a livello delle membrane del RE per la presenza di una sequenza-segnale all estremità NH 2 della proteina -altre sequenze segnale regolano l eventuale inserzione nello spessore della membrana MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI -La proteina deve essere ripiegata correttamente e subire le opportune modificazioni post-traduzionali -alcune modificazioni possono avvenire solo all interno del RE o dell apparato del Golgi -La proteina può essere ancorata alla membrana LOCALIZZAZIONE FINALE -La localizzazione finale della proteina dipende da sequenze di indirizzo -La localizzazione può essere regolata DEGRADAZIONE -il sistema ubiquitina-proteasoma regola l emivita di molte proteine
SEDE DI SINTESI DELLE PROTEINE Localizzazione Citosol Reticolo endoplasmatico Mitocondri Cloroplasti classi di proteine sintetizzate solubili del citosol del citoscheletro legate con ancore lipidiche al versante citosolico delle membrane dei mitocondri e dei cloroplasti codificate dal genoma nucleare dei perossisomi e dei gliossisomi del nucleo integrali di membrana: membrana plasmatica reticolo endoplasmatico apparato del Golgi lisosomi di secrezione, tra cui quelle della matrice extracellulare solubili residenti nel reticolo endoplasmatico enzimi lisosomiali codificate dal genoma mitocondriale codificate dal genoma del cloroplasto
Le proteine integrali di membrana, gli enzimi residenti nei lisosomi e nel RE e le proteine di secrezione sono sintetizzate dai ribosomi posti sul reticolo rugoso
Modificazioni post-traduzionali comportanti legami covalenti 1 modificazione sede Proteolisi -Met N-terminale tutte -sequenza-segnale RER -peptidi interni o terminali citosol, RER, Golgi, extra -poliproteine citosol Modificazioni di amminoacidi -idrossilazione di Pro e Lys RER -metilazione His RER -carbossilazione Glu citosol -modificazione His in ipusina citosol Glicosilazioni -in O di Ser e Thr Golgi -in N di Asn I fase RER, II fase Golgi -aggiunta P al man di proteine N-glicosil. Golgi Formazione di ponti S-S -tra Cys RER -tra Cys e GSH citosol
Modificazioni post-traduzionali comportanti legami covalenti 2 modificazione sede Formazione della struttura quaternaria -aggiunta di gruppi prostetici tutte -formazione di complessi polipeptidici tutte Aggiunta di ancoraggi alla membrana -tramite miristato (-NH 2 ) citosol -tramite palmitato (sequenza interna) citosol -tramite prenile (-COOH) citosol -tramite glicosil-fosfatidil-inositolo (GPI)(-COOH) RER Legame reversibile con gruppi a funzione di regolazione -gruppi fosfato tutte -ADP-ribosio tutte -GTP-GDP tutte -ubiquitina tutte N.B. la struttura tridimensionale di una proteina dipende da tutte queste modificazioni e da un corretto ripiegamento, che può richiedere l intervento di chaperon e chaperonine
Alcuni siti riguardanti le modificazioni post-traduzionali delle proteine http://www.callisto.si.usherb.ca/~bcm514/3a.html http://web.indstate.edu/thcme/mwking/proteinmodifications.html http://biowww.net/browse-57.html
Chaperon, chaperonine e co-chaperon Sono proteine coinvolte in attività di base della cellula, quali o Assistenza nel ripiegamento di alcune proteine nel corso della loro sintesi o Guida nel trasporto di proteine attraverso le membrane di organuli, con azione su entrambi i lati della membrana o Disassemblaggio di strutture proteiche oligomeriche o Facilitazione della degradazione proteolitca di proteine instabili o Controllo dell attività biologica di alcune proteine
Inoltre alcune di esse vengono indotte in caso di stress cellulari in cui le proteine perderebbero il corretto avvolgimento; si ritiene che aiutino a ripristinarne la configurazione originaria. Gli stress in cui è documentata la sintesi di tali proteine sono in particolare o Stress ipertermico o Stress ossidativo Dall induzione in caso di stress ipertermico traggono la denominazione di HSP (Heat Shock Proteins, heat=calore). I geni delle HSP sono rappresentati anche nei procarioti e sono molto conservati; sono espressi a livello basale e sono inducibili in tutte le cellule. I geni delle HSP mancano di introni, probabilmente per agevolare la sintesi del prodotto genico anche nel caso in cui una determinata condizione di stress inibisca lo splicing.
L apparato del Golgi è sede di glicosilazione delle proteine e di smistamento (sorting e targeting) verso la membrana o verso i lisosomi
Il passaggio delle vescicole dal RER e dal REL al Golgi e dal Golgi alla membrana
La N-glicosilazione di residui di Asn inizia nel RER con il trasferimento di un oligosaccaride dal dolicolo e si completa nel Golgi GLICOSILAZIONE La O-glicosilazione di residui di Ser e Thr ha luogo nel Golgi Nel Golgi il mannosio di un residuo di Asn può essere fosforilato, la glicosilazione completata diversamente e la proteina avviata verso il lisosoma
La biosintesi del collagene di tipo I come esempio di modificazioni posttraduzionali A sin la tripla elica del collagene I e a destra le 3 eliche separate
1- Sintesi delle catene di collagene da parte dei ribosomi associati al RER e taglio del peptide segnale I geni del collagene sono 23; sono note più di 1000 mutazioni, che portano a vari tipi di difetti dei connettivi http://www.le.ac.uk/ genetics/collagen/ http://herkules.oulu.f i/isbn9514265858/ht ml/x1014.html
2- Modificazioni di amminoacidi Le caratteristiche dell elica del collagene richiedono che alcuni residui di prolina e di lisina siano idrossilati. L acido ascorbico funge da catalizzatore in questa reazione.
3- Aggiunta di oligosaccaridi N-linked 4- Aggiunta di galattosio ai residui di idrossilisina
5- Allineamento delle eliche, formazione dei legami disolfuro e di legami tra catene laterali catalizzati dalla deaminazione di alcuni residui di lisina ad opera della LOX; formazione della tripla elica a partire dall estremità carbossilica.
6- Completamento della glicosilazione nell apparato del Golgi con aggiunta di glucosio O-linked ai residui di Lys. 7- Solfatazione 8- Trasporto del procollagene dal Golgi alla membrana via vescicole rivestite da COP 1 9- Esocitosi
Nello spazio extracellulare: 10- Rimozione dei propeptidi N- e C-terminali ad opera di proteasi e in presenza di Ca 2+ 11- Associazione laterale delle molecole di collagene, con sfasamento di ¼ della loro lunghezza 12- Formazione di legami trasversali covalenti 13- Aggregazione delle fibrille polimeriche, in modo differente da tessuto a tessuto
SEGNALI DI INDIRIZZO E SMISTAMENTO SEGNALE LOCALIZZAZIONE Sequenza interna, eventualmente bipartita SKL all estremità carbossilica aa carichi positivamente inseriti tra aa idrofobici all estremità amminica (più sequenze in successione Indirizzano ai vari sottocompartimenti) Peptide segnale amminoterminale idrofobico Peptide segnale interno idrofobico preceduto da sequenza basica KDEL, HDEL fosfo.-mannosio segnale ignoto segnale ignoto nucleo perossisomi mitocondri, cloroplasti lume del RER membrana del RER ritenzione nel RER lisosoma ritenzione nel Golgi secrezione continua o regolata
SEGNALI DI INDIRIZZO DELLE PROTEINE DAL CITOSOL AGLI ORGANULI
Le diverse localizzazioni finali delle proteine
sorting dall apparato del Golgi
La proteolisi regolata dalla localizzazione di membrana: un altro modo di regolare la localizzazione finale di una proteina
L inserzione di proteine nel reticolo endoplasmatico richiede un peptide segnale Ricostruzione 3D di sec61 (in rosso), il poro che mette in comunicazione la subunità 80S del ribosoma (in azzurro) con la cavità del reticolo endoplasmatico
Inserzione di una proteina nello spessore della membrana del RE
L organizzazione della membrana plasmatica
Rapporti tra SRP, recettore e traslocone
Liberazione di una proteina solubile nel lume del RER
Inserzione nel RER dell estremità carbossilica di una proteina di membrana monopasso; il peptide segnale (rosso) non viene rimosso
Traffico di membrane : non sono coinvolte le membrane di mitocondri, perossisomi e cloroplasti
I rivestimenti delle vescicole sono in relazione con la loro destinazione
dettaglio
Come le singole proteine vengono inserite nelle vescicole di trasporto destinate ad un determinato organulo, come le vescicole si formano e come si distaccano
Dopo il distacco della vescicola, la clatrina o le altre proteine di rivestimento si dissociano e tornano come monomeri liberi nel citoplasma
Trasporto delle vescicole sulla membrana di destinazione e riconoscimento della vescicola target Il trasporto avviene su specifichi vagoni che viaggiano su binari di microtubuli
Il trasporto anterogrado e retrogrado delle vescicole è mediato dalle proteine motrici associate ai microtubuli + -
Riconoscimento vescicola-target
Diverse proteine intervengono nella fusione tra vescicole
Dettaglio
Endocitosi mediata da recettore: il recettore per la transferrina, ancora legato alla transferrina, viene riciclato alla membrana plasmatica dopo che il ferro è stato staccato all interno del lisosoma (a causa dell abbassamento del ph). A ph neutro (superficie cellulare) la transferrina si lega a l suo recettore solo se porta il ferro (Fe2-Tf), altrimenti si dissocia (Apo-Tf)
Nel caso della particella di LDL (trasportatore del colesterolo), il recettore viene internalizzato per endocitosi e poi riciclato alla membrana, mentre tutto il trasportatore viene degradato e rilasciato nel citoplasma LDL
L assunzione di LDL-colesterolo per endocitosi e il riciclo dei recettori
Caveolae e zattere di lipidi LIPID RAFTS INSIDE AND OUT: In the outer leaflet (A), sphingolipids and cholesterol form less fluid microdomains (B) called lipid rafts, which are enriched for GPI-proteins. Microdomains may contain more rigid subdomains (C) enriched for the sphingolipid ganglioside GM1. The membrane inner leaflet contains microdomains (D) with unknown lipid composition enriched for prenylated proteins. In contrast, caveolin and proteins carrying the two saturated fatty acyl chains become concentrated in caveolae (F). (From G. van Meer, Science, 296: 855 7, 2002.)
http://www.bms.ed.ac.uk/research/others/smaciver/cyto- Topics/caveolae.htm
transcitosi
La fagocitosi
Trasporto di proteine dal citosol al nucleo Le proteine devono avere un segnale di localizzazione nucleare (NLS)
Trasporto di proteine dal nucleo al citosol Le proteine devono avere un segnale di esportazione nucleare (NES)
4 possibili localizzazioni finali delle proteine importate nel mitocondrio
Una sola sequenza segnale per la proteina destinata alla matrice mitocondriale. In evidenza il ruolo di due proteine chaperon, Hsc70 citosolica e Hsc70 mitocondriale
Due possibile modalità di trasporto di una proteina mitocondriale nello spazio intermembrana
Trasporto di una proteina nel cloroplasto
Trasporto di una proteina nello spazio tilacoide del cloroplasto
Trasporto di una proteina nel perossisoma
DEGRADAZIONE L emivita di una proteina varia da giorni a minuti Una modalità molto frequente di degradazione è quella mediata dal sistema ubiquitina-proteasoma La degradazione via lisosoma è riservata agli endosomi, ai fagosomi e agli autofagosomi (es. mitocondri invecchiati) L amminoacido N-terminale è indice della durata della proteina Sequenze di distruzione presenti in alcune proteine (es. ciclina B) Il proteasoma degrada la proteina legata ad almeno 4 molecole di ubiquitina (la mono-ubiquitinazione è invece una modalità di regolazione della proteina, analogamente ad altre modificazioni, es. fosforilazione) Almeno 3 enzimi sono coinvolti nel legame ubiquitina-substrato La degradazione proteasomica restituisce ubiquitina e peptidi I peptidi saranno ulteriormente degradati da proteasi citoplasmatiche ESEMPI RILEVANTI Degradazione delle cicline nella regolazione del ciclo cellulare Degradazione di IkB e conseguente attivazione di NFkB Presentazione di antigeni, che saranno associati a molecole MHC-1
Degradazione di una proteina mediata dal sistema ubiquitinaproteasoma Il proteasoma 26S
Nella progressione del ciclo cellulare, il complesso Cdk-ciclina (una kinasi) viene inattivato dalla degradazione della ciclina (via ubiquitinaproteasoma). Questa degradazione (passaggio irreversibile) fa passare il ciclo cellulare da uno stadio al successivo. La degradazione della ciclina B è attivata dal complesso Cdk1-Ciclina B (si autoregola) Enzimi che legano l ubiquitina alla ciclina
L attivazione del fattore di trascrizione NFκB è mediata dalla degradazione (via ubiquitina-proteasoma) del suo inibitore IκB. Si noti il segnale di localizzazione nucleare che si smaschera al distacco di IκB. http://www.emdbiosciences.com/popup/cbc/nfkb_interactive_pathway.htm
I peptidi virali possono essere degradati via ubiquitina-proteasoma per essere poi esposti sulla superficie cellulare, associati ad una proteina di membrana specifica (una molecola di classe I dell MHC); in questo modo un linfocita T citotossico (killer) può riconoscere la cellula infetta e ucciderla.
Via di degradazione mediata dal lisosoma
La degradazione di un mitocondrio ha inizio con il suo inglobamento in membrane del reticolo