3-NITROTIROSINA PLASMATICA IN UV/VIS - FAST Codice Z61010 BIOCHIMICA La 3-nitrotirosina è un prodotto della nitrazione della tirosina mediata attraverso specie azotate reattive come l anione perossinitrito e il diossido di azoto. Viene riscontrata in numerose condizioni patologiche ed è considerata come un marker di stress ossidativo dipendente da NO. La nitrotirosina viene trovata in molti tessuti affetti da patologie, come la cornea e il cheratocono. Molto probabilmente partecipa nel processo di patogenesi del diabete. Fig. 1 3-Nitrotirosina Viene quindi identificata come indicatore di danneggiamento e infiammazione cellulare, così come indice di produzione di NO. Si crede che misurare la concentrazione di nitrotirosina serva ad avere un marker per il danneggiamento causato dagli NO nella cella. Studi precedenti hanno dimostrato che la nitrotirosina è stata trovata in condizioni infiammatorie, come placche aterosclerotiche e artriti reumatoidi. EUREKA srl LAB DIVISION VAT N 01547310423 E-mail:info@eurekaone.com www.eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi 25 60033 Chiaravalle (AN) ITALY Tel. +39 071 7450790 Fax + 39 071 7496579 Release N 002 3-Nitrotirosina plasmatica - FAST Febbraio 2010 1
CARATTERISTICHE DEL KIT Principio del metodo : Il presente metodo consente di determinare le concentrazioni plasmatiche della 3-Nitrotirosina. Ad una aliquota di plasma viene aggiunto un Reagente di Precipitazione e, dopo aggiunta di un riducente, il campione viene trasferito in provetta e iniettato in HPLC. Recupero del Metodo : 100% Minima concentrazione analizzabile : 10 µg/l Range Dinamico : 10 10.000 µg/l Valori di riferimento : 10 1000 µg/l Contenuto della Confezione : Tutti i reagenti sono pronti all uso e stabili 3 anni a 2 8 C. Reagente A Soluzione deproteinizzante con Standard Interno, 1 x 30 ml Reagente B Soluzione Riducente, 1 x 25 ml Reagente C Soluzione Test/Standard Chimico, 1 x 10 ml Vedi Avvertenze Reagente M - Fase Mobile, 3 x 500 ml Dotazione strumentale minima richiesta : Strumento HPLC isocratico con loop da 50 µl Detector spettrofotometrico UV/VIS λ = 232 nm Registratore di cromatogrammi Dotazione opzionale : Preparatore automatico del campione Autocampionatore Computer gestionale Modalità di prelievo ematico : Aggiungere al campione un antiossidante, preferibilmente il BHT 4mM, in quantità 1:10. Fase pre-analitica : Se non si analizza subito, congelare il campione a -20 C. Stabile per circa 1 mese. Stabile 1 settimana a 2-8 C. Release N 002 3-Nitrotirosina plasmatica - FAST Febbraio 2010 2
PROCEDURA PREANALITICA In una provetta pipettare : 280 µl di Reagente A Deproteinizzante con Standard Interno 200 µl di Reagente B Soluzione Riducente 200 µl di Reagente C Sol. Test INIEZIONE : Iniettare 100 µl della soluzione nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma. Verificare che la Sol. Test abbia tempi di ritenzione simili a quelli riportati in fig. 1. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. Importante : Questa Soluzione così ottenuta non deve essere usata come calibratore. PROCEDURA ANALITICA FASE 1 : Preparazione dei campioni Dispensare in provetta: Calibratore Campione Reagente C Standard Chimico 200 µl Campione 200 µl Reagente A Sol. Deproteinizzante con Standard Interno 280 µl 280 µl Attenzione: si consiglia di deproteinizzare direttamente sul Vortex per almeno 30 secondi Centrifugare a 5000 rpm per 5 min FASE 2 : Prelevare tutto il surnatante ed aggiungere 200 µl di Reagente B Soluzione Riducente Agitare al Vortex per 20 secondi N.B.: il campione così preparato è stabile 1 settimana a 2-8 C INIEZIONE : Iniettare 100 µl nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma. Release N 002 3-Nitrotirosina plasmatica - FAST Febbraio 2010 3
3-NITROTIROSINA PLASMATICA - FAST Avvertenze REAGENTE C : SOLUZIONE TEST / STANDARD CHIMICO 3-Nitrotirosina 1300 µg/l PARAMETRI DEL DETECTOR SPETTROFOTOMETRICO λ GAIN TEMPO DI INTEGRAZIONE 232 nm 0,001 AUFS 10 secondi PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA Per salvaguardare la colonna analitica Reverse Phase Pursuit XRs C 18 4,6 x 50 mm, 3 µ, è tassativo l uso della Guard Column Cartridge Holder/CARTUCCIA PRECOLONNA, cod. ZUCC270 e dei PREFILTRI per CARTUCCIA PRECOLONNA (1 x 10 pz.) cod. ZUCC752. CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova Reverse Phase Pursuit XRs C 18 4,6 x 50 mm, 3 µ. Disconnettere il detector e far passare 30 ml di una soluzione di H 2 O : Metanolo (20 : 80 v/v) e successivamente 30 ml di H 2 O per HPLC, al flusso di 1,2 ml/minuto. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di 1,2 ml/minuto e scaricare i primi 30 ml. Condizionare ulteriormente per 30 minuti anche a ricircolo di fase. Se la T Amb del Laboratorio è > 20 C si consiglia di conservare a 2-8 C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l altra. NON è possibile lavorare a ricircolo di fase mobile. PULIZIA DELLA COLONNA PARAMETRI HPLC Disconnettere il detector. Flussare 30 ml di H 2 O e scaricare. LOOP 100 µl Flusso di lavoro consigliato 1,2 ml/minuto Pressione corrispondente Circa 110 bar PARAMETRI INTEGRATORE HP 3394 / 3395 / 3396 ATTENUAZIONE 8 PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE Z61020 Standard Chimico 3-Nitrotirosina 2 x 5 ml ZA6001050X046 Colonna Analitica Pursuit XRs C18 (50 x 4,6mm -3 um) 1 PZ ZUCC270 Guard Column Cartridge Holder / Cartuccia Precolonna 1 PZ ZUCC752 Prefiltri per cartuccia Precolonna 1 x 10 PZ 4
3-NITROTIROSINA PLASMATICA ( Cromatogrammi di riferimento ) Fig. 1 : Soluzione Test Fig. 2 : Standard Chimico alto R.T. 4.475 3-Nitrotirosina R.T. 4.565 3-Nitrotirosina 165 µg/l R.T. 6.202 Standard Interno R.T. 6.215 Standard Interno 5
3-NITROTIROSINA PLASMATICA ( Cromatogrammi di riferimento ) Fig. 3 : Standard Chimico basso R.T. 4.571 3-Nitrotirosina 80 µg/l R.T. 6.277 Standard Interno 7