Cytology FISH Accessory Kit Codice n. K 5499 2 a edizione Per ibridazione in situ in fluorescenza (FISH, Fluorescence In Situ Hybridization) su campioni citologici. Il kit contiene reagenti sufficienti per 20 test.
Indice Pagina Uso previsto...3 Introduzione...3 Reagenti...3 Materiali forniti...3 Materiali necessari ma non forniti...3 Precauzioni...4 Conservazione...4 ISTRUZIONI PER L USO A. Preparazione dei reagenti...5 A.1 Tampone di lavaggio...5 A.2 Formaldeide al 3,7%...5 A.3 Tampone di stringenza...5 A.4 Serie di etanolo...5 B. Procedura di colorazione...5 B.1 Note procedurali...5 B.2 Protocollo per la colorazione...6 Controllo di qualità...7 Interpretazione dei risultati...7 Bibliografia...7 Individuazione e risoluzione dei problemi...8 Appendice 1...10
Uso previsto Per uso diagnostico in vitro. L'uso del Cytology FISH Accessory Kit è previsto nella tecnica dell'ibridazione in situ in fluorescenza (FISH) su campioni citologici. Introduzione La procedura d'impiego del kit si articola in due giorni. Il primo giorno si esegue un pretrattamento dei campioni citologici (forniti dall'utilizzatore) utilizzando la formaldeide al 3,7% per 2 minuti, prima di procedere alla disidratazione con etanolo. In seguito al pretrattamento si applicano le sonde FISH fornite dall'utilizzatore e si sigillano i campioni con il Sigillante per coprioggetti, prima della denaturazione e dell'ibridazione overnight. Il secondo giorno si effettua un lavaggio di stringenza, che assicura la rimozione della sonda FISH non legata o legata in modo aspecifico, prima della disidratazione con etanolo. Infine si esegue il montaggio dei campioni con il Mezzo di montaggio a fluorescenza che contiene una controcolorazione fluorescente blu e li si ricopre con dei coprioggetti. L'interpretazione dei risultati si effettua con un microscopio a fluorescenza dotato di un filtro adatto (vedere l'appendice 1). Reagenti Materiali forniti I materiali elencati qui sotto sono sufficienti per 20 test (un test è definito come un'area bersaglio di 18 mm x 18 mm). Flacone 1 Tampone di lavaggio (20x) 500 ml di tampone Tris/HCl concentrato 20x. Flacone 2 Tampone di stringenza (20x) 150 ml di tampone SSC (soluzione salina - citrato di sodio) con detergente, concentrato 20x. Flacone 3 Elemento 4 Mezzo di montaggio a fluorescenza 300 µl di mezzo di montaggio a fluorescenza pronto per l'uso con una controcolorazione blu. Sigillante per coprioggetti 1 tubo di soluzione pronta all'uso per sigillare il coprioggetto in modo reversibile. NOTA: Tutti i reagenti sono formulati specificamente per essere utilizzati con questo kit. Materiali necessari ma non forniti Reagenti di laboratorio Acqua distillata o deionizzata Etanolo al 96% Formaldeide al 37% Attrezzatura di laboratorio Pipette regolabili Termometro calibrato a immersione parziale (intervallo 37-100 C) Termometro calibrato da superficie (intervallo 37-100 C)
Coprioggetti (18 mm x 18 mm) Forcipi Cappa Blocco riscaldante o forno per l ibridazione per la denaturazione (82 (±2) C) Camera umida per l ibridazione Forno per l ibridazione o incubatrice per l'ibridazione overnight (45 (±2) C) Vetrini, Dako Silanized Slides, codice n. S 3003, vetrini rivestiti di poli-l-lisina o vetrini superfrost Vaschette o bagni per la colorazione Contaminuti (per intervalli di 2-15 minuti) Bagnomaria con coperchio (in grado di mantenere una temperatura compresa tra 65 (±2) C e 99 C) Attrezzatura e accessori per il microscopio Filtri per il microscopio a fluorescenza: filtro DAPI e filtri adatti al fluorocromo utilizzato, per esempio filtro doppio per il FITC/Rosso Texas, o monofiltri per il FITC e per il Rosso Texas per le sonde FISH Dako - per i particolari vedere l'appendice 1. Per le sonde FISH Dako si consiglia un microscopio a fluorescenza con lampada al mercurio da 100 watt. Raccoglitore per vetrini da microscopio (vassoio in cartoncino per 20 vetrini con coperchio a cerniera o simile). Precauzioni 1. Per operatori specializzati. 2. Il flacone 1, Wash Buffer (20x), contiene 10-<25% sodium chloride e 10-<20% trometamolo. Il flacone 1 è etichettata: Pericolo H319 H315 P280 P264 P302 + P352 + P362-2 + P363 P332 + P313 P305 + P351 + P338 P337 + P313 Provoca grave irritazione oculare. Provoca irritazione cutanea. Fare uso di un dispositivo di protezione degli occhi o del viso. Lavarsi accuratamente le mani dopo l uso. IN CASO DI CONTATTO CON LA PELLE: Lavare abbondantemente con acqua e sapone. Togliere gli indumenti contaminati. Lavare gli indumenti contaminati prima di indossarli nuovamente. In caso di irritazione della pelle: consultare un medico. IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: Sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. Se l irritazione degli occhi persiste, consultare un medico. 3. Il flacone 2, Stringent Wash Buffer (20x), contiene 10-<25% sodium chloride, e 10-<20% 2-amino-2-(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Il flacone è etichettata: Pericolo H319 H315 P280 P264 P302 + P352 + P362-2 Provoca grave irritazione oculare. Provoca irritazione cutanea. Fare uso di un dispositivo di protezione degli occhi o del viso. Lavarsi accuratamente le mani dopo l uso. IN CASO DI CONTATTO CON LA PELLE: Lavare
+ P363 abbondantemente con acqua e sapone. Togliere gli indumenti contaminati. Lavare gli indumenti contaminati prima di indossarli nuovamente. P332 + P313 P305 + P351 + P338 P337 + P313 In caso di irritazione della pelle: consultare un medico. IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: Sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. Se l irritazione degli occhi persiste, consultare un medico. 4. Elemento 4, Coverslip Sealant, contiene il 100% di nafta (petrolio), frazione leggera di hydrotreating e è etichettata: Pericolo H225 H304 H411 P280 P210 P241 P242 P243 P233 P273 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 P405 P403 P235 P501 Liquido e vapori facilmente infiammabili. Può essere letale in caso di ingestione e di penetrazione nelle vie respiratorie. Tossico per gli organismi acquatici con effetti di lunga durata. Indossare guanti protettivi. Proteggere gli occhi/il viso. Tenere lontano da fonti di calore, superfici calde, scintille, fiamme libere o altre fonti di accensione. Non fumare. Utilizzare impianti elettrici, di ventilazione, d illuminazione e per la movimentazione dei materiali a prova di esplosione. Utilizzare solo utensili antiscintillamento. Prendere precauzioni contro le scariche elettrostatiche. Tenere il recipiente ben chiuso.. Non disperdere nell ambiente. IN CASO DI INGESTIONE: Contattare immediatamente un CENTRO ANTIVELENI/un medico. NON provocare il vomito. IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: Sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. Conservare sotto chiave. Conservare in luogo ben ventilato.. Conservare in luogo fresco. Smaltire il prodotto e il recipiente in conformità a tutte le normative locali, regionali, nazionali e internazionali. 5 Tempi e temperature di incubazione, o metodiche, diversi da quelli specificati possono dare risultati erronei. 6. I reagenti sono stati diluiti in modo ottimale. Ulteriori diluizioni possono portare a una perdita di performance. Conservazione Flacone 1, Tampone di lavaggio, conservare a 2-8 C. Flacone 2, Tampone di stringenza, conservare a 2-8 C. Flacone 3, Mezzo di montaggio a fluorescenza, conservare al buio a 2-8 C. Elemento 4, Sigillante per coprioggetti, conservare a 2-8 C. Livelli eccessivi di luce possono danneggiare il Mezzo di montaggio a fluorescenza (Flacone 3). Non conservare questo componente, né eseguire l analisi, in condizioni di luce intensa, come alla luce solare diretta. Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza stampata sulla confezione. Se i reagenti sono conservati in condizioni diverse da quelle specificate in questo inserto, l'utilizzatore deve validare la performance dei reagenti (1). Non esistono segni evidenti che indichino l instabilità del prodotto, per cui è importante valutare le cellule normali nel campione analizzato. Se si dovesse osservare uno schema di fluorescenza
inatteso non attribuibile a modifiche delle procedure di laboratorio e si sospettasse un problema relativo al Cytology FISH Accessory Kit, contattare il Servizio Tecnico. ISTRUZIONI PER L USO A. Preparazione dei reagenti È opportuno preparare i seguenti reagenti prima della colorazione: A.1 Tampone di lavaggio Diluire una quantità sufficiente del flacone 1 (Tampone di lavaggio 20x) diluendo il concentrato 1:20 in acqua distillata o deionizzata. Il tampone diluito non utilizzato può essere conservato a 2-8 C per un mese. Eliminare il tampone diluito se appare torbido. A.2 Formaldeide al 3,7% Preparare una quantità sufficiente di formaldeide al 3,7% diluendo 1:10 la formaldeide al 37% nel Tampone di lavaggio diluito (vedere le ISTRUZIONI PER L'USO, sezione A.1). Conservare le vaschette coperte a temperatura ambiente e utilizzarle per non più di 100 vetrini. Eliminare la soluzione diluita se appare torbida. A.3 Serie di etanolo Da una soluzione di etanolo al 96% preparare tre vaschette con etanolo rispettivamente al 70%, all'85% e al 96%. Conservare le vaschette coperte a temperatura ambiente o a 2-8 C e utilizzarle per non più di 200 vetrini. Eliminare le soluzioni se appaiono torbide. A.4 Tampone di stringenza Diluire una quantità sufficiente del flacone 2 (Tampone di stringenza 20x) diluendo il concentrato 1:20 in acqua distillata o deionizzata. Il tampone diluito non utilizzato può essere conservato a 2-8 C per un mese. Eliminare il tampone diluito se appare torbido. B. Procedura di colorazione B.1 Note procedurali Prima dell uso, l utilizzatore deve leggere attentamente le seguenti istruzioni e familiarizzare con tutti i componenti (vedi la sezione Precauzioni). Prima dell'uso è necessario riequilibrare tutti i reagenti alla temperatura adeguata. Flacone 1: riequilibrare il Tampone di lavaggio diluito a temperatura ambiente (20-25 C). Flacone 2: Tampone di stringenza diluito; prima dell'uso riequilibrare una vaschetta a temperatura ambiente e l'altra a 65 (±2) C. Flacone 3: il Mezzo di montaggio a fluorescenza può essere applicato a qualunque temperatura compresa tra 2 e 25 C. Elemento 4: il Sigillante per coprioggetti può essere applicato a temperatura ambiente. Eseguire tutti i passaggi alla temperatura indicata. La procedura prevede delle disidratazioni seguite dall'essiccamento dei campioni. Assicurarsi che i campioni siano completamente asciutti prima di procedere al passaggio successivo. Non lasciare asciugare i campioni durante gli altri passaggi della procedura. B.2 Protocollo di colorazione GIORNO 1 1 passaggio: preparazione dei vetrini Riequilibrare i vetrini dei campioni citologici alla temperatura ambiente.
Incubare i vetrini con la formaldeide al 3,7% (vedere le ISTRUZIONI PER L'USO, sezione A.2) per 2 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere i vetrini dalla formaldeide al 3,7% e immergerli nel Tampone di lavaggio diluito (vedere le ISTRUZIONI PER L'USO, sezione A.1) per 5 minuti a temperatura ambiente. Sostituire il Tampone di lavaggio diluito e immergervi i vetrini per altri 5 minuti. Disidratare i vetrini dei campioni citologici attraverso una serie progressiva di etanolo: 2 minuti in etanolo al 70%, 2 minuti in etanolo all'85% e 2 minuti in etanolo al 96% (vedere le ISTRUZIONI PER L'USO, sezione A.3). Lasciare asciugare completamente i vetrini all'aria. 2 passaggio: sonda FISH (fornita dall'utilizzatore ) Il seguente passaggio deve essere eseguito in cappa. Applicare la giusta quantità di sonda marcata con il fluorocromo, per esempio 10 µl di una sonda FISH Dako, al centro del campione. Porre immediatamente un coprioggetto di vetro da 18 mm x 18 mm sopra la sonda e lasciare che diffonda in modo omogeneo sotto il coprioggetto. Evitare la formazione di bolle d'aria. Qualora fossero presenti, eliminarle picchiettandole delicatamente con i forcipi. Sigillare il coprioggetto con il Sigillante per coprioggetti facendolo fuoriuscire dal tubo attorno ai margini del coprioggetto. Fare in modo che il Sigillante per coprioggetti si sovrapponga al coprioggetto e al vetrino, formando così un sigillo intorno al coprioggetto. Assicurarsi che il Sigillante per coprioggetti ricopra interamente il bordo del coprioggetto. Porre il vetrino su una superficie piana metallica o di pietra (un blocco riscaldante o un blocco in un forno per l ibridazione) preriscaldata a 82 (±2) C. Denaturare per 5 minuti assicurandosi che la temperatura del blocco non scenda mai al di sotto di 80 C. Porre i vetrini in una camera umida per l ibridazione preriscaldata. Quando si utilizzano le sonde FISH Dako, coprire la camera con un coperchio e incubare overnight (14-20 ore) a 45 (±2) C. Per la denaturazione e l'ibridazione è possibile utilizzare una strumentazione, come il Dako Hybridizer (codici n. S 2450 e n. S 2451), che realizzano condizioni simili a quelle sopra descritte. GIORNO 2 3 passaggio: lavaggio di stringenza Riempire due vaschette per la colorazione, per esempio vaschette di Coplin, con il Tampone di stringenza diluito (vedere le ISTRUZIONI PER L USO, sezione A.4). Per 1-6 vetrini in una vaschetta è necessario un volume minimo di 100 ml di Tampone di stringenza diluito. Per più di 6 vetrini utilizzare almeno 15 ml di tampone per vetrino. Porre una delle vaschette di colorazione con il Tampone di stringenza diluito a temperatura ambiente in una cappa e l'altra in un bagnomaria. Scaldare a 65 (±2) C il bagnomaria e il Tampone di stringenza diluito e assicurarsi che la temperatura si sia stabilizzata. Coprire con un coperchio ciascuna vaschetta per stabilizzare la temperatura ed evitare l'evaporazione. Con un termometro calibrato misurare la temperatura nella vaschetta a bagnomaria per assicurarsi che sia corretta. Utilizzando i forcipi o i guanti, estrarre i vetrini dalla camera per ibridazione, rimuovere delicatamente il Sigillante per coprioggetti e i coprioggetti e porre i vetrini, uno alla volta, nella vaschetta di prelavaggio a temperatura ambiente. Appena rimossi tutti i coprioggetti, trasferire i vetrini dalla vaschetta di prelavaggio a temperatura ambiente alla vaschetta a bagnomaria a 65 (±2) C. Eseguire un lavaggio di stringenza per 10 minuti esatti a 65 (±2) C. Rimuovere i vetrini dal Tampone di stringenza diluito e immergere le sezioni nel Tampone di lavaggio diluito per 3 minuti a temperatura ambiente (20-25 C). Sostituire il Tampone di lavaggio diluito e immergervi le sezioni per altri 3 minuti. Disidratare i vetrini attraverso una serie di etanolo: 2 minuti in etanolo al 70%, 2 minuti in etanolo all'85% e 2 minuti in etanolo al 96% (vedere le ISTRUZIONI PER L'USO, sezione A.3). Lasciare asciugare completamente i vetrini all'aria.
4 passaggio: montaggio Applicare sull'area bersaglio del vetrino 15 µl di Mezzo di montaggio a fluorescenza contenente la controcolorazione fluorescente blu (flacone 3) e coprire con un coprioggetto di vetro. NOTA: è possibile leggere i vetrini dopo 15 minuti o entro 7 giorni dal montaggio. Tuttavia l'esposizione alla luce o a temperature elevate determina un affievolimento della colorazione dei vetrini. Per ridurre al minimo questo effetto conservare i vetrini al buio a 2-8 C. Controllo di qualità 1. I segnali devono essere brillanti, distinti e facilmente valutabili. 2. Le cellule di tessuto normale consentono il controllo interno dell'esecuzione del dosaggio. 3. Le cellule normali devono produrre segnali di fluorescenza chiaramente visibili, come indice della riuscita ibridazione da parte delle sonde FISH sulle regioni bersaglio. 4. La mancata individuazione dei segnali nelle cellule normali indica l'insuccesso del dosaggio e i risultati devono essere considerati non validi. 5. La morfologia nucleare, valutata con il filtro DAPI, deve essere intatta. La presenza di numerose cellule fantasma e una morfologia nucleare generalmente scadente indicano una eccessivadenaturazione del campione, che determina una perdita o una frammentazione dei segnali. Campioni di questo tipo devono essere considerati non validi. Interpretazione dei risultati Esaminare diverse aree di cellule per tenere conto della possibile eterogeneità. Selezionare un'area con una buona distribuzione nucleare. Iniziare l'analisi nel quadrante superiore sinistro dell'area selezionata e, esaminando da sinistra verso destra, per ogni nucleo valutato contare il numero di segnali all'interno dei confini del nucleo, in base alle linee guida riportate qui sotto. Regolare la messa a fuoco per individuare tutti i segnali in un singolo nucleo. Calcolare come un unico segnale, due segnali della stessa dimensione e distanti non più di due volte il diametro di un segnale. Non conteggiare i nuclei senza segnali. Deve essere l'utilizzatore a definire il numero di nuclei da contare per ciascuna sonda. Bibliografia 1. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 FR 7163, February 28, 1992.
Individuazione e risoluzione dei problemi Problema Probabile causa Azione suggerita 1. Assenza di segnali o segnali deboli 1a. Scorretto funzionamento del microscopio - serie di filtri inadeguata - lampada non idonea - lampada al mercurio troppo vecchia - lenti del collettore sporche e/o incrinate - olio da immersione inadatto 1b. Segnali sbiaditi 1c. Evaporazione della sonda durante l'ibridazione 1d. Condizioni di denaturazione scorrette 1e. Condizioni scorrette del lavaggio di stringenza 1a. Controllare il microscopio e assicurarsi che i filtri utilizzati siano adatti all uso con i fluorocromi e che la lampada al mercurio sia appropriata e non sia stata utilizzata oltre la durata prevista (vedere l Appendice 1). In caso di dubbio contattare il rivenditore locale del microscopio 1b. Evitare l esame microscopico prolungato e ridurre al minimo l'esposizione a fonti di luce intensa 1c. Garantire un'umidità sufficiente nella camera per l'ibridazione 1d. Assicurarsi che la temperatura di denaturazione sia di 82 (±2) C 1e. Assicurarsi che per il lavaggio di stringenza vengano utilizzati la temperatura e i tempi consigliati e che i coprioggetti vengano rimossi prima dell'esecuzione del lavaggio di stringenza 2. Aree senza segnale 3. Eccessiva colorazione di fondo 2a. Volume insufficiente della sonda 2b. Bolle d'aria intrappolate durante l'applicazione della sonda o durante il montaggio 3a. Temperatura del lavaggio di stringenza troppo bassa 3b. Esposizione prolungata delle sezioni ibridate alla luce intensa 2a. Assicurarsi che il volume della sonda sia sufficiente a coprire l'area sottostante il coprioggetto 2b. Evitare la formazione di bolle d'aria. Se presenti, eliminarle picchiettandole delicatamente con i forcipi 3a. Assicurarsi che la temperatura del lavaggio di stringenza sia di 65 (±2) C 3b. Evitare l esame microscopico prolungato e ridurre al minimo l'esposizione alla luce intensa
Problema Probabile causa Azione suggerita 4. Scadente morfologia o colorazione debole dei nuclei 4a. Temperatura di denaturazione troppo elevata 4a. Assicurarsi che la temperatura di denaturazione sia di 82 (±2) C NOTA: se il problema verificatosi non può essere attribuito ad alcuna delle cause riportate qui sopra oppure se l azione correttiva suggerita non consente la risoluzione del problema, contattare il Servizio Tecnico per ulteriore assistenza.
Appendice 1 Cytology FISH Accessory Kit, codice n. K 5499 Specifiche del microscopio a fluorescenza Quando si usano le sonde FISH Dako, la Dako consiglia di utilizzare con il Cytology FISH Accessory Kit la seguente attrezzatura: 1. Tipo di microscopio microscopio a epifluorescenza. 2. Lampada lampada al mercurio da 100 watt (prendere nota del tempo di funzionamento). 3. Obiettivi per lo screening del tessuto si possono utilizzare obiettivi per fluorescenza a secco 10x o per fluorescenza a immersione a olio 16x. per un elevato potere di ingrandimento e per il conteggio dei segnali, si consiglia l'uso esclusivo degli obiettivi per fluorescenza a immersione a olio, per esempio da 100x. 4. Filtri Ogni singolo filtro viene progettato per uno specifico fluorocromo e deve essere scelto di conseguenza. Quando si utilizzano le sonde di DNA FISH Dako, Dako consiglia l'uso di uno specifico filtro DAPI insieme a un filtro doppio di alta qualità rosso Texas/FITC. filtro DAPI, per esempio filtro Chroma # 31000. filtro doppio rosso Texas/FITC, per esempio filtro Chroma # 51006. i filtri singoli rosso Texas e FITC si possono usare come conferma. Fluorocromo Lunghezza d'onda di eccitazione Lunghezza d'onda di emissione FITC 495 nm 520 nm Rosso Texas 596 nm 615 nm I filtri sono specifici per ciascun tipo di microscopio e l'uso di filtri adatti è cruciale per l'interpretazione. Per informazioni dettagliate contattare il proprio fornitore di microscopi o il rappresentante Dako. 5. Olio Olio non fluorescente. Precauzioni Fluorocromi specifici richiedono attrezzature differenti e devono essere scelti di conseguenza. Per le sonde FISH Dako si sconsiglia l'utilizzo di una lampada a mercurio da 50 watt, non è possibile utilizzare i filtri Rodamina e sono sconsigliati i filtri tripli. Un microscopio non ottimizzato può causare problemi alla lettura dei segnali fluorescenti. È importante che la fonte di luce non sia scaduta e che sia correttamente allineata e a fuoco. Gli utilizzatori devono tenere sotto controllo la lampada al mercurio e seguire i consigli del fabbricante. Il microscopio deve essere in buone condizioni di manutenzione e la lampada al mercurio in allineamento prima di interpretare i risultati. È necessario cercare di ridurre al minimo l'esposizione del campione alla luce di eccitazione per limitare il più possibile l'affievolimento della fluorescenza. Prima di iniziare l'ibridazione in situ in fluorescenza si consiglia di analizzare con il fabbricante l'avviamento del proprio specifico microscopio o di consultare la letteratura.
Prodotto da: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Denmark Tel. +45 44 85 95 00 Fax +45 44 85 95 95 Spiegazione dei simboli Numero di catalogo Limiti di temperatura Codice del lotto Dispositivo medico-diagnostico in vitro Proteggere dal calore (consultare la sezione sulla conservazione) Utilizzare entro Consultare le istruzioni per l'uso Contenuto sufficiente per <n> saggi Fabbricante Pittogramma GHS (consultare la sezione sulle precauzioni) Pittogramma GHS (consultare la sezione sulle precauzioni) Pittogramma GHS (consultare la sezione sulle precauzioni) Pittogramma GHS (consultare la sezione sulle precauzioni)