CORSO DI MICROBIOLOGIA GENERALE a.a. 2016-2017 Le endospore batteriche Dott.ssa Annalisa Serio Dott.ssa Clemencia Chaves-López
Cosa sono le endospore Come si formano Meccanismi di regolazione della sporificazione Microrganismi produttori Importanza degli sporigeni negli alimenti Visualizzazione al microscopio
Ferdinand Cohn (1821-1898) - Biologo tedesco, fondatore della microbiologia e batteriologia moderna. - Classificò i batteri secondo la forma in sferiche, cocchi, bacilli e spirali. - Dimostro che Bacillus può cambiare da forma vegetativa a stato di endospore quando le condizioni ambientali solo avverse.???
Cosa sono le endospore? Sono strutture dormienti nonriproduttive che si presentano in una tappa del ciclo vitale di alcuni generi batterici appartenenti al phylum Firmicutes. - sono differenziate dal resto di cellule vegetative per uno stato metabolico pressochè fermo (criptobiotico) nonchè per un elevata resistenza agli agenti aggressivi ambientali - sono caratterizzate da una struttura particolare.
La criptobiosi è uno stato di vita ametabolico (vita sospesa) nel quale entrano alcuni organismi semplici in risposta a condizioni ambientali avverse, quali essiccazione, congelamento, e mancanza di ossigeno. Nello stato criptobiotico, tutti i processi metabolici si fermano, impedendo la riproduzione, lo sviluppo e la riparazione.
A cosa servono le endospore? Sono resistenti a: 1. Alte temperature 2. Radiazioni UV, gamma, 3. Disinfettanti 4. Essiccamento La funzione primaria è quella di assicurare la sopravvivenza del batterio durante i periodi di stress ambientale.
Come si formano? 1. Ogni cellula ha un distinto programma di espressione di geni che sono governati da una serie di fattori di trascrizione che agiscono in modo specifico. 2. Le cellule comunicano tra loro per potere formare la spora
Ciclo vegetativo Principali passi nella formazione della spora sporulazione Divisione assimetrica Cellula madre prespora germinazione Incapsulamento della prespora
Fattori di trascrizione che dirigono il processo della sporulazione La formazione di spore implica la produzione di numerose nuove strutture, enzimi e metaboliti, assieme alla scomparsa di numerosi componenti della cellula vegetativa. Affinchè ciò si attui deve essere attivata una serie di geni, i cui prodotti determinano la formazione e la composizione finale della spora mentre un altra serie di geni, quelli necessari alle funzioni della cellula vegetativa, deve essere inattivata.
Fig. 2 Coupling of gene transcription and morphogenesis Fattori di trascrizione che dirigono il processo della sporulazione
Le endospore sono il risultato di una strategia evolutiva adattativa sporulazione Cambiamenti: - Genetici - Morfologici - Strutturali C, N, P scendono sotto una soglia Privazione di nutrienti La sporulazione è un processo molto raffinato che è comparso evolutivamente in una linea filogenetica di batteri Gram-positivi, e che ha consentito a questo gruppo di sopravvivere durante lunghi periodi di carenza
Quorum sensing E un sistema di regolazione trascrizionale in risposta alle fluttuazioni della densità cellulare dei batteri, ovvero un meccanismo che molte cellule batteriche della stessa specie utilizzano per comunicare tra di loro. Questo meccanismo comporta la produzione e rilascio di molecole segnalatrici chiamate autoinduttori che incrementano come funzione della densità cellulare.
Quorum sensing L induttore diffonde all'esterno della cellula originaria, e può così entrare nel citoplasma di altre cellule adiacenti. Se la concentrazione di molecola segnale all'interno di cellule della popolazione batterica è alta, questa molecola si legherà all'attivatore trascrizionale, che a sua volta attiverà o reprimerà una serie di geni, determinando l'attivazione o lo spegnimento di vie metaboliche o processi cellulari specifici.
Il processo dura 8 ore Gli stadi della sporulazione
Endospore Cycle, Step 1 Cellula batterica vegetativa
Endospore Cycle, Step 2 Replicazione del patrimonio genetico
Nelle prime fasi del processo di sporulazione è frequente la produzione da parte dello sporangio di piccoli peptidi ad attività antibatterica 17
Inizio della sporulazione EDF-1: è un fattore di differenziamento extracellulare. Si lega al batterio e segnala ad esso di iniziare il processo di sporulazione. La ridotta concentrazione di GTP (fattore di differenziamento intracellulare) rappresenta il segnale biochimico intracellulare che dà l avvio alla sporulazione.
Endospore Cycle, Step 3 - Divisione del DNA - Attivazione di SpoOA - Sintesi del fattore sh (specifico per il primo gruppo di geni della sporulazione) - Formazione del setto di divisione asimmetrico, primo evento irreversibile Il setto presumibilmente contiene peptidoglicano il quale è idrolizzato prima dello stadio 4
Endospore Cycle, Step 4 Spora Cellula madre Ciascun nucleoide è circondato da una propria membrana
Endospore Cycle, Step 5 - Formazione della PRESPORA e della CELLULA MADRE - Sintesi di SpoIIID (proteina binding del DNA) - Localizzazione di σe nella cellula madre - Localizzazione di σ F nella prespora
Endospore Cycle, Step 6 -La prespora è inglobata da una doppia membrana citoplasmatica - Sintesi delle piccole proteine acido solubili (SASP) nella prespora. - La prespora sintetizza i componenti della PARETE SPORALE - La cellula madre sintetizza i componenti della CORTEX (peptidoglicano modificato e acido dipicolinico). - La molecola del DNA della cellula madre viene degradato.
Endospore Cycle, Step 7 - Sintesi di GerE (proteina bindig del DNA). -La cellula madre completa la sintesi dei componenti della corteccia e sintetizza i componenti delle tuniche sporali. -- la corteccia delle spore è composta principalmnete di peptidoglicano che è diverso da quello della cellula vegetativa
Endospore Cycle, Step 9 A volte può essere presente uno strato ancora più esterno detto esosporio. La porzione vegetativa della cellula madre viene degradata e la spora rilasciata.
Endospore Cycle, Step 8 All esterno della membrana più esterna vengono sintetizzate le tuniche
GERMINAZIONE In presenza di appropriate condizioni ambientali è possibile il passaggio inverso da spora a cellula vegetativa
A) Attivazione GERMINAZIONE Stadio caratterizzato dalla distruzione degli involucri esterni. E un processo reversibile. - Calore (60-65 C per 10') - ph basso - Sostanze riducenti (mercaptoetanolo). B) Germinazione Si ha perdita della rifrangenza, della resistenza al calore ed agli agenti fisici e chimici. C) Esocrescita Caratterizzata dalla sintesi degli RNA (trna, RNA ribosomiale, mrna) e delle proteine. La sintesi dei DNA inizia verso la fine dell'esocrescita.
Sporulazione Germinazione -Termine della crescita vegetativa -Formazione del filamento di cromatina -Formazione del setto sporale -Sintesi della corteccia -Aumento della rifrangenza -Sintesi di acido dipicolinico e ioni Ca 2 + -Sintesi dei coats -Resistenza agli agenti fisici e chimici -Resistenza al calore -Diminuzione delle affinità tintoriali -Lisi della cellula madre e liberazione della spora matura -Perdita della resistenza al calore -Perdita di acido dipicolinico ed ioni Ca++ -Diminuzione della rifrangenza -Aumento della cromatofilia -Diminuzione della resistenza agli agenti fisici e chimici -Inizio del metabolismo
Gli involucri della spora batterica Dall esterno verso l interno: Esosporio: rivestimento superficiale sottile e delicato di natura fosfolipidica, simile alla membrana citoplasmatica. Contiene basse concentrazioni di acidi teicoici, acido diaminopimelico e glucosammina. Quando presente determina massima rifrangenza e completa impermeabilità ai coloranti. Tunica sporale esterna e Tunica sporale interna: spesso strato proteico (impermeabile, resistente agli agenti chimici). 29
Dall esterno verso l interno: Corteccia: formata da peptidoglicano lasso (occupa anche ½ volume spora e conferisce resistenza fisica). - A differenza della parete delle cellule vegetative, circa il 50% di residui di acido N-acetilmuramico sono sostituiti da anelli di acido d lattamico (lattami muramici) siti di attacco degli enzimi della germinazione. Formazione di legami crociati tra il peptidoglicano e il dipicolinato di calcio. Ciò determina contrazione del peptidoglicano ed eliminazione di acqua per strizzamento. -E una struttura flessibile poiché il peptidoglicano sporale contiene un basso numero di legami trasversi, rispetto a quello della cellula vegetativa. Ciò è fondamentale per mantenere la disidratazione sporale - Non sono presenti acidi teicocici. Parete del Core Core (protoplasto): costituito da costituenti cellulari essenziali come nucleoide, ribosomi, citoplasma.contiene acido dipicolinico che stabilizza il DNA
Generi che producono spore? *Alicyclobacillus Amphibacillus *Bacillus *Clostridium **Delsulfotomaculum Oscillospira Pasteuria Sporohalobacter Sporolactobacillus Sporosarcina Sulfobacillus Syntrosphora **Thermoactinomyces
Generi che producono spore?
Importanza degli sporigeni negli alimenti Resistenza delle spore ai trattamenti termici L applicazione di un trattamento termico seleziona le spore Possono resistere fino a 150 C, anche se a 121 C (trattamento in autoclave) le endospore delle specie più comuni tendono ad essere rapidamente inattivate (ma con un rapporto t/t differente in funzione di numerosi fattori, come vedremo nel Corso di Microbiologia alimentare). Endospore di batteri termofili possono rimanere vitali in acqua bollente per 19 ore! IMPORTANTE EFFETTUARE I TRATTAMENTI DI STABILIZZAZIONE TERMICA IN AUTOCLAVE!!!
Composizione della spora e resistenza 10-15% del peso secco è costituito da acido dipicolinico (nel core) complessato con ioni calcio (sembra che stabilizzi il DNA). Resistenza al calore: non sembra causata dall ac. dipicolinico (mutanti termoresistenti privi di ac. dipicolinico). Sembra dovuta a piccole proteine specializzate acido-solubili che legano il DNA al core, stabilizzandolo in forma più compatta e proteggendolo da calore, essiccazione e raggi UV (SASP: small acid-soluble proteins). Le SASP forniscono anche carbonio ed energia per la germinazione.
Possibili cause della resistenza della spora Stabilizzazione del DNA (ac. dipicolinico e proteine acido-solubili). Disidratazione del protoplasto. Maggiore stabilità delle proteine legata a fenomeni adattativi.
Importanza degli sporigeni negli alimenti Resistenza delle spore a sostanza chimiche Tali agenti chimici possono includere sostanze chimiche presenti nell'ambiente radicali liberi prodotti da reazioni chimiche dentro la spora. Apparentemente il fattore maggiormente implicato nella resistenza a molte sostanze chimiche è la relativa impermeabilità della membrana che circonda il core della spora. Pertanto l ingresso degli agenti chimici nella spora è molto basso.
Ci sono alcune evidenze sperimentali che mostrano come la tunica sporale partecipi alla resistenza chimica (Russell, 1982). La disidratazione del nucleo della spora, potrebbe impedire la reazione degli agenti chimici con i suoi componenti con conseguente incremento della resistenza. La resistenza ai vari agenti chimici è acquisita in stadi ben precisi della sporulazione.
Importanza degli sporigeni negli alimenti Il perossido d'idrogeno distrugge le cellule tramite una varietà di meccanismi, il principale dei quali consiste nella produzione di radicali liberi (Imalay & Linn, 1988). Esistono due teorie riguardanti l'incremento di questo tipo di resistenza, 1. una sostiene che sia dovuta all'abbassamento della permeabilità al perossido d'idrogeno, 2. altra sottolinea la protezione del DNA delle spore dai radicali liberi da parte dei legami delle proteine SASP (Setlow & Setlow, 1993b).
Importanza degli sporigeni negli alimenti Resistenza delle spore alle radiazioni La tossicità chimica rappresenta solo uno dei diversi fattori che influiscono sulla sopravvivenza delle spore. Fra i diversi agenti le radiazioni UV e, alle quali i batteri, sia nelle acque che nei suoli, sono sottoposti esercita un ruolo molto importante. Diversamente dalle cellule in crescita, le spore non possono riparare i danni determinati dalle radiazioni perché non hanno ATP. Per la sopravvivenza alle radiazioni, le spore devono minimizzare il più possibile sia gli effetti letali che quelle mutageni della radiazione. Non è quindi sorprendente che le spore dormienti abbiano una maggiore resistenza alle radiazioni. Tale fenomeno suggerisce che nelle spore native il DNA si presenta saturo di proteine SASP tipo alfa/beta che lo proteggono dall attacco dei radicali idrolitici liberi.
Le fasi della germinazione ATTIVAZIONE: riscaldamento a temperatura subletale. Una delle ipotesi più accettabile per spiegare il fenomeno dell attivazione si riferisce alla rottura dei ponti S-S delle proteine dei coats, responsabili della maggiore permeabilità della spora attivata. Se non si aggiungono gli induttori del processo di germinazione, la spora non entra nella seconda fase. GERMINAZIONE: (in presenza di nutrienti, es. alanina) perdita di resistenza, rifrangenza, dipicolinato e SASP. Assunzione di H2O e aumento di volume. Perdita della termoresistenza e della resistenza all essiccamento, al lisozima e agli agenti chimici ESOCRESCITA: La cellula vegetativa fuoriesce completamente dagli involucri sporali e riprende la sua normale attività metabolica. Sintesi di ac. nucleici e proteine, 41 divisione cellulare.
Endospore Cellule vegetative - Resistenza. - Rifrangente al microscopio. - Scarsa attività enzimatica (metabolismo ridotto o assente). - Contenuto di acqua 5-10% - Insensibile al lisozima - Dipicolinato di calcio - Piccole proteine acide solubili(sasp) - Sono prive dei composti altamente energetici quali ATP e NADH. - Contengono quantità significative di 3-fosfoglicerato (3-PGA ) 0.1-0.3% del peso in secco. - Alta concentrazioni di ioni divalenti come Ca+2, Mg+2, Mn+2 - Non resiste a calore, UV etc - Non rifrangente. - Elevata attività enzimatica. - Contenuto di acqua 80-90%. - Sensibile al lisozima. - Non contiene dipicolinato ne SASP. - Presenti molecole altamente energetiche 42
CARATTERISTICHE DIFFERENZIALI TRA SPORA E CELLULA VEGETATIVA Presenza di acqua Spora - Cellula vegetativa + Affinità tintoriali - + Rifrangenza + - Presenza di acido dipicolinico + - Resistenza al calore + - Resistenza agli UV + - Resistenza agli agenti chimici + - 43
Visualizzazione al microscopio Posizione della spora nello sporangio a. equatoriale b. subterminale c. terminale d. terminale a bacchetta di tamburo
Morfologia degli sporigeni caratterizzata da: 1. forma della spora (sferica o ovale); 2. dimensione della spora (Ø > o = a quello della cellula); 3. posizione (equatoriale, subterminale o terminale) BATTRIDI: spora equatoriale o subterminale, Ø = a quello della cellula CLOSTRIDI: spora equatoriale o subterminale, Ø > di quello della cellula PLETTRIDI: spora terminale, Ø > di quello della cellula (bacchetta di tamburo) 45
Colorazione della spora Si utilizza il calore abbinato a particolari colorazioni: es. Colorazione di Shäffer e Fulton: - stesura, essiccamento e fissazione del preparato - colorazione con sol. acquosa di verde di malachite 5% per 30 sec, scaldando fino a sviluppo vapori - lavaggio con acqua - colorazione di contrasto con sol. acquosa di safranina 0,5% per 30 sec - lavaggio e asciugamento SPORE VERDE AZZURRO FORME VEGETATIVE ROSA-BRUNO 46
Da: textbookofbacteriology.net Da: faculty.lacitycollege.edu Da: inst.bact.wisc.edu
Da: microbeworld.com 48