QuickTox TM Kit for QuickScan

QuickTox TM Kit for QuickScan Aflatoxin FREE (AQ-209-BG) Cat. # GX11178 Manuale d uso Leggere attentamente il manuale prima di procedere all uso del kit Via San Geminiano, 4 41030 San Prospero (MO)- Italy (: +39 059 8637161 : +39 059 7353024 *: laboratorio@generon.it : www.generon.it [1] Manuale d uso - QuickToxTM Kit for QuickScan Aflatoxin FREE - Rev. 7-29/07/2016

1 Calibrazione Dello Scanner Il nuovo kit AflatoxinFREE consente di testare molte nuove matrici oltre a quelle tradizionalmente disponibili (mais verde e secco e frumento) rilevando la presenza di Aflatossine a partire da 1.5 ppb fino a 300 ppb a seconda delle matrici secondo la seguente tabella: Tabella 1 Gruppo Limite di rilevabilità (LOD) Limite alto senza diluizione Limite alto con diluizione On-Strip, MG2 MG8 2.5-3 ppb (vd Tab.2) 30 ppb 100 ppb MG9 (mais alta sensibilità) 1.5 ppb 20 ppb 100 ppb MG10-12 - arachidi 7.5 ppb 99 ppb 300 ppb MG13-16 2.7 ppb 30 ppb 100 ppb Per poter sfruttare questa nuova possibilità bisogna prima di tutto andare a calibrare lo strumento utilizzando il foglio con i codici a barre inserito nella scatola. Note importanti: Il barcode è necessario solo per le matrici comprese nei Matrix Group dal 2 al 16. NON è richiesto per testare mais, riso integrale e grano. Dopo aver eseguito la prima volta la scansione del codice a barre, questa resta in memoria per tutto il lotto di strip in uso il foglio con i codici a barre è lotto specifico pertanto all arrivo di ogni nuova scatola è conveniente ricalibrare lo strumento con il foglio in essa contenuto. anche gli altri kit Quicktox possono contenere codici a barre extra per calibrare lo strumento su quelle specifiche tossine; il software Quickscan memorizza e gestisce le calibrazioni in modo indipendente distinguendo le varie tossine. si raccomanda inoltre di mantenere costantemente aggiornato il software all ultima versione; sarebbe preferibile pertanto che il PC a cui lo scanner è collegato fosse on-line in modo che gli aggiornamenti vengano «visti» automaticamente. Per calibrare lo scanner dopo averlo acceso e lanciato il software Quickscan: 1. Aprire il coperchio dello scanner e mettere il foglio con i codici a barre sul vetro con i codici rivolti in basso. 2. Chiudere il coperchio e cliccare il tasto Read Test (lo stesso che si usa per fare le analisi) in alto a destra nella schermata principale 3. Un messaggio di avvenuta calibrazione, con l elenco dei nuovi gruppi di matrici riconosciuti, apparirà sullo schermo (vedi a sinistra). Cliccate su OK e proseguite con il vostro esperimento. Le matrici validate finora sono quelle elencate nella tabella 2. [2] Manuale d uso - QuickToxTM Kit for QuickScan Aflatoxin FREE - Rev. 7-29/07/2016

Tabella 2 Definizione Inglese Definizione Italiana Gruppo LOD (ppb) Soluzione Estraente Peanut hull Arachidi - Gusci AF-MG12 7,5-99 Soluzione NaCl (30%)* + 80% Etanolo Peanut seeds Arachidi - Semi AF-MG10 7,5-99 Soluzione NaCl (30%)* + 80% Etanolo Whole Peanut Arachidi grezze AF-MG11 7,5-99 Soluzione NaCl (30%)* + 80% Etanolo Oats Avena AF-MG7 2,7-30 50% Etanolo Copra coconut meal Cocco - Panello AF-MG3 2,7-30 50% Etanolo Cotton seed meal Cotone - Panello AF-MG4 2,5-30 Acetonitrile 50% Cotton seed delinted Cotone - Semi defibrati AF-MG2 2,5-30 50% Etanolo Wheat Frumento On-strip 2,7-30 Bustina Buffer EB17 e acqua Corn Mais (Estratto ad acqua) On-strip 2,7-30 Bustina Buffer EB17 e acqua Corn Mais (Estratto ad alcol) AF-MG3 2,7-30 50% Etanolo Corn flour Mais - Farina AF-MG8 2,7-30 50% Etanolo Hominy Feed Mais - Farina Tostata AF-MG3 2,7-30 50% Etanolo Corn germ Mais - Germe AF-MG2 2,5-30 50% Etanolo Corn germ meal Mais - Panello di germe AF-MG6 2,7-30 80% Etanolo Corn gluten meal Mais - Panello di glutine AF-MG3 2,7-30 50% Etanolo Corn gluten feed Mais - Semola glutinata AF-MG5 2,5-30 Acetonitrile 84% Corn Silage Mais - Trinciato** AF-MG3 2,7-30 80% Etanolo Corn (High Sensitivity) Mais (alta sensibilità) AF-MG9 1,5-20 50% Etanolo Barley Orzo AF-MG8 2,7-30 50% Etanolo DDGS Residuo secco di distilleria AF-MG2 2,5-30 50% Etanolo Rice Bran Riso - Crusca AF-MG2 2,5-30 50% Etanolo Rice Hulls Riso - Lolla AF-MG16 2,7-30 50% Etanolo Rice, White Riso Bianco AF-MG15 2,7-30 50% Etanolo Rice, White Glutinous Riso bianco glutinoso AF-MG14 2,7-30 50% Etanolo Rough rice Riso grezzo AF-MG7 2,7-30 50% Etanolo Brown Rice Riso Integrale On-strip 2,7-30 Bustina Buffer EB17 e acqua Rice, Black Glutinous Riso nero glutinoso AF-MG13 2,7-30 50% Etanolo Whole Rye Segale - Semi grezzi AF-MG6 2,7-30 50% Etanolo Soybean Meal Soia - Panello AF-MG8 2,7-30 50% Etanolo Sorghum Sorgo AF-MG7 2,7-30 50% Etanolo (*) Soluzione NaCl (30%) va preparata sciogliendo completamente 29,4 grammi di sale da cucina in 100 ml d acqua (**) Validazione effettuata su trinciati di mais insilati al termine del processo di maturazione con umidità compresa tra il 50-70% [3] Manuale d uso - QuickToxTM Kit for QuickScan Aflatoxin FREE - Rev. 7-29/07/2016

2 Componenti del Kit Ogni kit contiene: 50 strip QuickTOX (Tubo bianco), 50 bustine di Buffer EB17 (bustine in alluminio), una bottiglietta di Buffer DB5, 100 puntali per pipetta (sacchetto trasparente), 50 bicchierini per correre il test (sacchetto blu). Nel caso si renda necessario ulteriore buffer DB5 e possibile acquistarlo (Cat. # GX11665) ricordando che il lotto di buffer è legato al lotto di strip pertanto nell ordine va indicato il numero di lotto di strip da abbinarvi. Generon può fornire anche tutti i materiali necessari ad eseguire l analisi non forniti con il kit: Bilance (Cat. # ACC3039) e barattoli per la pesata (Cat. # ACC3525); Pipette a volume variabile da 200 microlitri (Cat. # ACC3015) e 1000 microlitri (Cat. # ACC3014); Microcentrifughe (Cat. # ACC3064) o filtri (Cat. # ACC3504) per chiarificare gli estratti; Puntali da 1 ml (Cat. # ACC3514) e microtubi (Cat. # ACC3902) per utilizzare la microcentrifuga. 3 Precauzioni Il buffer EB17 è infiammabile ed irritante per pelle, occhi e vie aeree, evitarne pertanto il contatto. Evitare che il buffer venga a contatto con sostanze ossidanti come la varechina in quanto potrebbe reagire violentemente. Etanolo ed acetonitrile sono sostanze infiammabili da maneggiare con prudenza. L acetonitrile è una sostanza tossica da maneggiare sotto cappa chimica. Le strip sono sensibili all umidità pertanto si consiglia di conservarle all interno del tubo ben tappate. Il tappo contiene silice disseccante che le proteggerà. Evitare di piegare le strip in quanto questo ne comprometterebbe il normale flusso. Prima di utilizzare le strip portarle a temperatura ambiente (20-25 C) in quanto esse sono state tarate a queste temperature. Estrarre dal frigo almeno mezzora prima delle analisi: le strip necessarie e il tampone DB5 BUFFER. Riporre le altre strip in frigo. 4 Preparazione dei reagenti ATTENZIONE: L analisi deve essere eseguita a temperatura ambiente, a 20-25 C. Se eseguito a temperature inferiori o superiori, il test può dare risultati errati. Preparate anche la soluzione estrattiva necessaria in modo che sia a temperatura ambiente. Nella preparazione delle soluzioni utilizzare acqua demineralizzata o acqua minerale non gasata. [4] Manuale d uso - QuickToxTM Kit for QuickScan Aflatoxin FREE - Rev. 7-29/07/2016

5 Estrazione dell aflatossina dal campione Raccogliere un campione rappresentativo del materiale da analizzare seguendo le indicazioni sul campionamento della UE e comunque possibilmente almeno 1-2 Kg. Macinare finemente tutto il campione arrivando ad una granulometria di almeno 20 Mesh (1 mm). Granulometrie più grossolane possono limitare l efficienza estrattiva portando a sottostime. a. Attenzione: è preferibile macinare le arachidi previo congelamento o insieme a ghiaccio secco; il riscaldamento conseguente la macinazione creerebbe una massa oleosa difficilmente gestibile b. Non eccedere nella macinazione del frumento in quanto una sfarinatura eccessiva causa problemi all esecuzione del test Prendere un barattolo pulito e rimuovere il coperchio. Posizionare il barattolo sulla bilancia e premere il pulsante TARA. Pesare 25g di campione macinato. Il barattolo deve essere grande a sufficienza da garantire un adeguata agitazione del campione. Aggiungere la soluzione estraente Per mais (se non si usa l alta sensibilità), grano, riso integrale: aggiungere una bustina di EB17, fornita all`interno del kit, e versare 75 ml di acqua distillata Per le arachidi, aggiungere 20 ml di soluzione NaCl (30%), mescolare bene ma lentamente e quindi aggiungere 75 ml di Etanolo 80%. Per tutte le altre matrici (cioè quelle che richiedono il codice a barre Multi-Matrix ) vedere la tabella guida (Tabella 3 pagina seguente) ed aggiungere la soluzione estraente indicata nell appropriato rapporto di diluizione. Agitare vigorosamente per due minuti assicurandosi che tutto il campione venga bagnato dalla soluzione estraente e che non si formino grumi nei quali l estrazione non sarebbe completa. Qualora si utilizzi un agitatore meccanico (Cat. # ACC3912) il tempo di estrazione può ridursi ad un minuto Chiarificare l estratto preferibilmente* per centrifugazione 30 a 7200 rpm di un aliquota dell estratto come segue: I. Tarare la pipetta da 1000 µl per prelevare 800 µl II. III. IV. Inserire un puntale da 1000 (Azzurri) e con una forbice tagliare la punta del puntale per evitare che si intasi con il pulviscolo Prelevare il supernatante e trasferirlo in un microtubo da centrifuga Centrifugare avendo cura di bilanciare correttamente il rotore (*) se sprovvisti di centrifuga chiarificare il campione per filtrazione (utilizzando appositi filtri di carta plissettata Cat. # ACC3504) [5] Manuale d uso - QuickToxTM Kit for QuickScan Aflatoxin FREE - Rev. 7-29/07/2016

Tabella 3 Definizione Italiana Gruppo Soluzione Estraente Rapporto di estrazione Arachidi - Gusci AF-MG12 Soluzione NaCl (30%)+80% Etanolo 20 ml su 25 g + 75 ml su 25 g Arachidi - Semi AF-MG10 Soluzione NaCl (30%)+80% Etanolo 20 ml su 25 g + 75 ml su 25 g Arachidi grezze AF-MG11 Soluzione NaCl (30%)+80% Etanolo 20 ml su 25 g + 75 ml su 25 g Avena AF-MG7 50% Etanolo 1:2 (50 ml su 25 g) Cocco - Panello AF-MG3 50% Etanolo 1:4 (100 ml su 25 g) Cotone - Panello AF-MG4 Acetonitrile 50% 1:2 (50 ml su 25 g) Cotone - Semi defibrati AF-MG2 50% Etanolo 1:4 (100 ml su 25 g) Frumento On-strip Bustina Buffer EB17 e acqua 1:3 (75 ml su 25 g) Mais (Estratto ad acqua) On-strip Bustina Buffer EB17 e acqua 1:3 (75 ml su 25 g) Mais (Estratto ad alcol) AF-MG3 50% Etanolo 1:2 (50 ml su 25 g) Mais - Farina AF-MG8 50% Etanolo 1:2 (50 ml su 25 g) Mais - Farina Tostata AF-MG3 50% Etanolo 1:4 (100 ml su 25 g) Mais - Germe AF-MG2 50% Etanolo 1:4 (100 ml su 25 g) Mais - Panello di germe AF-MG6 80% Etanolo 1:2 (50 ml su 25 g) Mais - Panello di glutine AF-MG3 50% Etanolo 1:4 (100 ml su 25 g) Mais - Semola glutinata AF-MG5 Acetonitrile 84% 1:1,6 (40 ml su 25 g) Mais - Trinciato AF-MG3 80% Etanolo 1:2 (50 ml su 25 g) Mais (alta sensibilità) AF-MG9 50% Etanolo 1:2 (50 ml su 25 g) Orzo AF-MG8 50% Etanolo 1:2 (50 ml su 25 g) Residuo secco di distilleria AF-MG2 50% Etanolo 1:4 (100 ml su 25 g) Riso - Crusca AF-MG2 50% Etanolo 1:4 (100 ml su 25 g) Riso - Lolla AF-MG16 50% Etanolo 1:4 (100 ml su 25 g) Riso bianco AF-MG15 50% Etanolo 1:4 (100 ml su 25 g) Riso bianco glutinoso AF-MG14 50% Etanolo 1:4 (100 ml su 25 g) Riso grezzo AF-MG7 50% Etanolo 1:2 (50 ml su 25 g) Riso Integrale On-strip Bustina Buffer EB17 e acqua 1:3 (75 ml su 25 g) Riso nero glutinoso AF-MG13 50% Etanolo 1:4 (100 ml su 25 g) Segale - Semi grezzi AF-MG6 50% Etanolo 1:2 (50 ml su 25 g) Soia - Panello AF-MG8 50% Etanolo 1:2 (50 ml su 25 g) Sorgo AF-MG7 50% Etanolo 1:2 (50 ml su 25 g) [6] Manuale d uso - QuickToxTM Kit for QuickScan Aflatoxin FREE - Rev. 7-29/07/2016

6 Corsa della strip 1. Preparare un bicchierino di quelli contenuti nel sacchetto blu del kit 2. Utilizzando la micropipetta calibrata con un puntale pulito trasferire all interno del bicchierino i volumi di buffer DB5 e campione secondo la tabella 4 e mescolare accuratamente con la pipetta (aspirare ed espellere delicatamente il liquido 2/3 volte). Evitare di fare schiuma in quanto le bolle provocano dei problemi di flusso nella strip che si traducono in bande non completamente sviluppate e quindi in errori di lettura o errori di quantificazione. NOTA: Qualora il volume complessivo sia superiore ai 300 µl (ad es. nella semola glutinata di mais) trasferire 200 µl della miscela in un secondo bicchierino pulito. 3. Inserire la strip nella coppetta. La parte da immergere nel liquido è quella colorata. 4. Attendere lo sviluppo della strip per i minuti indicati nella tabella qui di seguito. 5. Togliere la strip dalla coppetta e tagliare via con le forbici la parte finale colorata e procedere con la lettura della strip 7 Lettura della strip 1. Aprire il programma di lettura, facendo doppio clic sull`icona Quickscan (QS) sullo schermo. Apparirà il menu principale. 2. Estrarre dal Quickscan il supporto per le strip (fig.1 parte nera a punta) 3. Aprire lo sportellino e posizionare la strip sul numero 1. La strip deve avere la parte col codice a barre rivolta verso il basso. E` possibile posizionare fino a 4 strip contemporaneamente, sfruttando le 4 posizioni disponibili (Fig.2). 4. Chiudere lo sportellino. Tenendolo premuto con un dito, inserire di nuovo il supporto nello scanner (Fig.3). 5. Cliccare sul comando READ TEST sulla schermata principale del programma (Fig.4). Attendere che il Quickscan termini la scansione. 1 2 3 4 [7] Manuale d uso - QuickToxTM Kit for QuickScan Aflatoxin FREE - Rev. 7-29/07/2016

Tabella 4 Definizione Italiana Rapporto Buffer DB5/campione Tempo di incubazione della strip Arachidi - Gusci 200 µl DB5 + 100 µl Estratto # 4 minuti Arachidi - Semi 400 µl DB5 + 100 µl Estratto # 4 minuti Arachidi grezze 400 µl DB5 + 100 µl Estratto # 4 minuti Avena 200 µl DB5 + 100 µl Estratto 5 minuti Cocco - Panello 100 µl DB5 + 100 µl Estratto 5 minuti Cotone - Panello 200 µl DB5 + 100 µl Estratto 5 minuti Cotone - Semi defibrati 100 µl DB5 + 100 µl Estratto 7 minuti Frumento 100 µl DB5 + 100 µl Estratto 5 minuti Mais (Estratto ad acqua) 100 µl DB5 + 100 µl Estratto 4 minuti Mais (Estratto ad alcol) 300 µl DB5 + 100 µl Estratto # 5 minuti Mais - Farina 200 µl DB5 + 100 µl Estratto 5 minuti Mais - Farina tostata 100 µl DB5 + 100 µl Estratto 5 minuti Mais - Germe 100 µl DB5 + 100 µl Estratto 5 minuti Mais - Panello di germe 200 µl DB5 + 100 µl Estratto 5 minuti Mais - Panello di glutine 100 µl DB5 + 100 µl Estratto 5 minuti Mais - Semola glutinata 500 µl DB5 + 100 µl Estratto # 5 minuti Mais - Trinciato** 200 µl DB5 + 100 µl Estratto 5 minuti Mais (alta sensibilità) 300 µl DB5 + 200 µl Estratto # 5 minuti Orzo 200 µl DB5 + 100 µl Estratto 5 minuti Residuo secco di distilleria 100 µl DB5 + 100 µl Estratto 5 minuti Riso - Crusca 100 µl DB5 + 100 µl Estratto 5 minuti Riso - Lolla 100 µl DB5 + 100 µl Estratto 5 minuti Riso Bianco 200 µl DB5 + 100 µl Estratto 5 minuti Riso bianco glutinoso 200 µl DB5 + 100 µl Estratto 5 minuti Riso grezzo 200 µl DB5 + 100 µl Estratto 5 minuti Riso Integrale 100 µl DB5 + 100 µl Estratto 4 minuti Riso nero glutinoso 100 µl DB5 + 100 µl Estratto 5 minuti Segale - Semi grezzi 200 µl DB5 + 100 µl Estratto 5 minuti Soia - Panello 200 µl DB5 + 100 µl Estratto 5 minuti Sorgo 200 µl DB5 + 100 µl Estratto 5 minuti (#) trasferire 200 µl della miscela in un secondo bicchierino pulito e inserire qui la strip. [8] Manuale d uso - QuickToxTM Kit for QuickScan Aflatoxin FREE - Rev. 7-29/07/2016

8 Analisi del risultato 1. Dopo che il software ha eseguito la lettura selezionare il «matrix group» di appartenenza per ogni strip analizzata selezionandolo dall apposito menù a tendina (Fig. 5) 2. A questo punto i risultati compariranno nella finestra in cui andare ad inserire i dettagli identificativi dell analisi (Fig. 6) Affinché l immagine delle strip venga salvata inserire almeno il nome del campione nello spazio Sample ID e premere Invio (Enter) sulla tastiera 3. Un eventuale risultato <LOD significa inferiore al limite di rilevazione, quindi Aflatossine totali inferiori a 3 ppb. 4. Un eventuale risultato >30 ppb significa che il campione supera i 30 ppb. Se si necessita di una misurazione precisa del valore, procedere al paragrafo Campioni che superano 30 ppb. 5. Se si desidera stampare immediatamente il report di analisi, premere il comando PRINT in basso a destra. 6. Premere CLOSE per chiudere la finestra di lettura. Per rivedere o stampare i risultati in un secondo momento, doppio clic sulla cartella REPORTS sul desktop 7. Per visualizzare il registro di tutte le analisi eseguite, cliccare sul comando DATA LOG nella schermata iniziale del programma [9] Manuale d uso - QuickToxTM Kit for QuickScan Aflatoxin FREE - Rev. 7-29/07/2016

9 Campioni che superano 30 ppb 1. Preparare la soluzione diluente: 1. Per mais, riso integrale, grano: versare 1 bustina di polvere EB17, fornita nel kit, in una bottiglia con 300 ml di acqua distillata. Questa soluzione si conserva a temperatura ambiente per 30 gg massimo. 2. Per gli altri Matrix Group utilizzare come soluzione diluente la stessa soluzione estraente (per le arachidi, etanolo 80%) 2. Preparare due nuove coppette pulite 3. Nella coppetta 1 porre 500 µl di soluzione e 100 µl di campione filtrato/centrifugato, miscelare delicatamente con la pipetta. Si ottiene così il campione diluito. 4. Nella coppetta 2, trasferire le quantità di DB5 BUFFER e di campione diluito secondo le proporzioni indicate in Tabella 4. 5. Procedere come da indicazioni in tabella 4, qualora sia prevista una coppetta 3. 6. Miscelare con la pipetta ed inserire lo strip nella coppetta finale. Attendere il tempo di incubazione della strip indicato in tabella 4 e procedere con la lettura mediante Quickscan. 7. Nella finestra dei risultati (fig. 6), selezionare nella colonna Dilution dal menù a tendina il fattore 1:A (o indifferentemente 1:B), il software calcolerà automaticamente il livello di contaminazione tenendo conto diluizione effettuata. 10 Dichiarazione di non responsabilità Generon S.p.A. non si assume responsabilità di alcun tipo, esplicite o implicite, eccetto garantire che i materiali di cui i propri prodotti si compongono sono di qualità standard. In caso di materiale difettoso, Generon S.p.A. si impegna a fornire un prodotto sostitutivo. Generon S.p.A. non è tenuta a rispondere per qualunque danno, inclusi danni speciali o consequenziali o spese che derivano direttamente o indirettamente dall`uso di questo prodotto. L acquirente può duplicare questo documento, in tutto o in parte, solo per scopi interni, a condizione che questa nota venga riportata in tutte le copie. Nella duplicazione l acquirente si impegna a compiere ogni ragionevole sforzo per impedire l'uso non autorizzato e la distribuzione delle informazioni sulla proprietà. Questo manuale è la semplice traduzione in lingua italiana del manuale in lingua straniera presente nel kit. [10] Manuale d uso - QuickToxTM Kit for QuickScan Aflatoxin FREE - Rev. 7-29/07/2016