11---------, Analisi di spermatozoi umani con citometria a flusso: valutazione della struttura cromatinica con i fluorocromi PleDACM G. MAZZINII, C. FERRARP, A. NAUTP J Centro Istochimica CNR, Pavia 2Dip. di Chirurgia, Sez. Chirurgia Cen. A, IRCCS S. Matteo, Pavia 3Lab. Analisi, Università e IRCCS S. Matteo, Pavia INTRODUZIONE L'analisi automatizzata del liquido seminale ha, ad oggi, considerato tre parametri essenziali owero: la concentrazione in spermatozoi, la loro vitalità e la presenza di altri tipi cellulari (Ieucociti ed altri) (1-5). Specificamente per quanto attiene l'impiego della citometria a flusso (CF) sono stati utilizzati diversi marcatori fluorescenti, quasi sempre utilizzati per colorare il nucleo (6-8). Unitamente alla fluorescenza sono anche riportati studi concernenti la valutazione dello scatter della luce per avere informazioni di tipo morfologico (9). Più recentemente c'è stato un considerevole interesse verso i cosiddetti marcatori di vitalità (10) anche grazie ad una ampia disponibilità commerciale di nuovi traccianti fluorescenti a questo scopo proposti. I vantaggi peculiari della CF (rapidità, sensibilità, elevata statistica), ampiamente sfruttati in questi ultimi anni (11-13), specialmente nel settore della immunofenotipizzazione leucocitaria, sono in parte vanificati, nel caso dell'analisi di spermatozoi, dalla complessità morfologica di queste cellule. La loro particolare forma allungata dalla presenza della coda nonché la specifica geometria a "foglia" della testa (14), rendono molto complessa e a volte critica la loro analisi mediante citometria a flusso. Il sistema fluidodinamico laminare di trasporto tende ad orientare favorevolmente lo spermatozoo all'interno della vena liquida di trasporto fino é\1 punto di misura. Nell'istante in cui awiene l'intersezione delle cellule con il fascio di luce di illuminazione la "testa" può però assumere varie posizioni di orientamento rispetto all'asse ottico del sistema con due posizioni estreme owero "di profilo" o "di piatto" (secondo il citato esempio della "sagoma" a foglia). Oltre a questo, la geometria di illuminazione da un lato e di raccolta della luce emessa dall'altro, giocano un ruolo molto importante. In pratica, (non potendo ulteriormente approfondire, in questa sede, i concetti sopra esposti) vi sono limiti significativi alla misura a flusso quantitativa precisa di parametri cellulari, nel caso appunto dell'analisi di spermatozoi. Scopo del lavoro è stato quello di verificare la fattibilità di un approccio analitico (che si può definire semiquantitativo) basato sull'impiego di strumentazione e fluorocromi particolari. Per quanto riguarda lo strumento abbiamo utilizzato un citometro a flusso PARTEC con doppia sorgen- te di illuminazione combinata laser e lampada. Utilizzando quest'ultima è stato possibile realizzare una geometria di illuminazione particolarmente favorevole al modello in analisi. Per quanto riguarda i parametri analitici e quindi i fluorocromi si è inteso valutare lo stato di condensazione della cromatina utilizzando una coppia di fluorocromi idonea a misure di "trasferimento di energia". RAZIONALE DELL' ANALISI Le fasi maturative dello spermatozoo sono caratterizzate, oltre che da cambiamenti morfologici evidenti, anche da una parallela modificazione della struttura della cromatina (15-18) che passa da uno stato meno condensato, caratteristico dei primi stadi maturativi fino ad uno stato di massima compattazione tipico della forma matura. Su questa premessa si è inteso sperimentare una metodologia sensibile a questa variazione. Studi precedenti erano stati basati sull'impiego di sonde fluorescenti quali l'arancio di acridina (AO) note per la loro capacità di intercalare in maniera differente nelle due condizioni. In questo studio si sfrutta invece l'interazione fra due fluorocromi che awiene in misura differente in funzione della diversa struttura a cui sono legati. Per una trattazione esaustiva si rimanda ad alcuni articoli specifici (19-20). In pratica utilizzando una coppia di fluorocromi quali 10- duro di Propidio (PI) e N-(7-dimetilamino-4-metil-cumarinil) maleimide (DACM) accade che queste due molecole possono statisticamente trovarsi più vicine tra loro se la struttura è compatta ed essere invece più distanziate in una struttura decondensata. Se a questo punto vengono utilizzate condizioni di analisi tali da realizzare il trasferimento di energia, la misura della fluorescenza emessa sarà funzione dell'entità dell'energia trasferita. In termini pratici a maggiore intensità di fluorescenza emessa, corrisponderà una minore distanza (statistica) fra coppie di fluorocromi e quindi una maggiore compattazione della struttura. I fluorocromi utilizzati possiedono le caratteristiche fisico-chimiche richieste, in quanto PI intercala nel DNA e DACM si lega ai gruppi -SH delle nucieoproteine in generale e, specificamente nel caso degli spermatozoi, alle protamine. Utilizzando per l'eccitazione luce UV a 366 nm
II----------------~ si eccita molto bene DACM che in stretta vicinanza con PI può cedergli l'energia assorbita consentendogli di emettere luce di fluorescenza rossa. Si sottolinea il fatto che la semplice eccitazione diretta di PI in UV porta a livelli di fluorescenza molto deboli. In sintesi l'analisi di campioni di spermatozoi colorati in doppio con una miscela di PI e DACM ed eccitati in luce ultravioletta consente di misurare un buon livello di fluorescenza rossa solo in con dizioni di "buon trasferimento" di energia. Questa situazione corrisponde quindi ad una condizione di cromatina compatta. Viceversa nel caso di nuclei con cromatina decondensata si avrà carenza di trasferimento di energia e si misurerà un segnale di fluorescenza rossa più basso. MATERIALI E METODI Analisi tradizionale Sono stati analizzati 40 campioni di liquido seminale da soggetti portatori di diverse patologie, l'età dei pazienti variava da 18 a 45 anni. I campioni sono stati mantenuti a temperatura ambiente per circa 30-40 minuti per permettere lo svolgersi della fase di fluidificazione, quindi sono stati diluiti 1:40 utilizzando una soluzione di NaHC03 e formaldeide (50 g NaHC03, 10 ml formaldeide al 40% in 1000 ml di acqua distillata). Ogni campione è stato analizzato in emocitometria, contando la sospensione in camera di Neubauer. La distinzione tra gli spermatozoi e le cellule rotonde presenti nei campioni in esame è stata invece effettuata in camera di Makler usando un volume di 5 ml di campione non diluito. Il conteggio delle cellule rotonde è stata effettuata in percentuale rispetto agli spermatozoi presenti. Citometria a flusso Per prevenire la formazione di aggregati proteici 450 mi di ogni campione di liquido seminale fluidificato è stato incubato, a 37 C per 30 minuti, con 50 ml di bromelina. AI termine i campioni sono stati centrifugati a 300 g per 10 minuti e lavati per 3 volte in 3 mi di PBS a ph 7,4. Dopo l'ultima centrifugazione il pellet è stato ricoperto con 200 ml di PBS e congelato a -20 C. AI momento dell'analisi i campioni sono stati scongelati e incubati per 1 h in una soluzione colorante di PI 7,5x10 5 M + DACM 10-7 M contenente 50 U/mL di RNASI. La misura è stata effettuata utilizzando un citometro a flusso PARTEC PAS (Dako) eccitando il campione in ultravioletto e raccogliendo la fluorescenza blu emessa dal DACM a 450-510 nm e la fluorescenza rossa emessa dal PI oltre 610 nm. Per ciascun campione sono state analizzate oltre 5000 cellule. I dati sono stati acquisiti in scala logaritmica riportando in ascissa i valori di fluorescenza blu e in ordinata quelli di fluorescenza rossa. Aliquote di campioni sono state parallelamente colorate con metodica tradizionale con PI 50 mg/ml ed analizzate eccitando con luce laser a 488 nm misurando la fluorescenza rossa emessa oltre 610 nm. RISULTATI L'analisi del liquido seminale dei 40 campioni ha rivelato una grande varietà di situazioni più o meno patologiche, sia per quanto riguarda il numero di spermatozoi (da con- dizioni di normalità ad altre di franca azospermia), sia per quanto riguarda la presenza di cellule rotonde. Alcuni dati sono stati poi confrontati con quelli ottenuti con citometria a flusso. Come si può vedere nel pannello che riporta alcuni degli esempi più significativi (Figg. 1-3) ottenuti dalla misura dei 40 campioni di liquido seminale, il risultato dell'analisi è rappresentato da un citogramma ovvero dalla correlazione, della fluorescenza rossa (FL III), in ordinata, con la fluorescenza blu (FL IV), in ascissa. Vengono inoltre riportati i risultati della semplice analisi del DNA effettuata con ioduro di propidio a singolo parametro. In questi grafici l' intensità di fluorescenza rossa dovrebbe essere proporzionale al contenuto di DNA; in realtà l'elevata condensazione cromatinica del nucleo degli spermatozoi potrebbe rendere non stechiometrica con il contenuto del DNA la quantità di fluorocromo legata e quindi l'intensità di fluorescenza emessa. Da un punto di vista pratico si può dire che il risultato della semplice colorazione con PI non ha fornito dati di rilievo: infatti sia in soggetti con quadri meno alterati o quasi normali, sia in soggetti con elevate variazioni del numero totale di spermatozoi, della funzionalità degli stessi e con la presenza di cellule rotonde, i grafici non mostrano sostanziali differenze. Quello che si osserva dai tracciati è che la grande variabilità nel valore della fluorescenza misurata testimonia quanto si è già detto più sopra circa la difficoltosa e variabile "colorabilità" del nucleo di queste cellule con PI. Tale variabilità non consente comunque di osservare differenze significative fra forme mature e forme immature come invece riportato da alcuni autori che hanno utilizzato altri fluorocromi (come l'arancio di Acridina). Analizzando invece i tracciati ottenuti dall'analisi a flusso dopo colorazione con PI-DACM sono state riscontrate variazioni significative nei tracciati confrontando quelli riferibili a campioni patologici con quelli "normali". Più in dettaglio possiamo vedere che in situazioni di "normalità" (Fig. 1) la quasi totalità delle cellule esprime un valore di fluorescenza rossa (FL III, in ordinata) abbastanza elevato frutto della fluorescenza indotta dal trasferimento di energia di DACM a PI. Ciò è sinonimo di condizioni di cromatina compatta che favorisce quindi interazioni elettroniche tra DACM e PI. AI contrario nella maggioranza dei casi ri~ conducibili a situazioni francamente patologiche (Figg. 2 e 3) sono sempre evidenti sottopopolazioni di cellule con livelli più bassi di fluorescenza rossa verosimilmente dovute a scarsità di trasferimento di energia fra i fluorocromi e in pratica ad una situazione meno condensata, nella quale le molecole di DACM e PI sono statisticamente più distanziate tra loro. Queste cellule esprimerebbero pertanto quella poca fluorescenza rossa direttamente emessa da PI eccitato in ultravioletto. DISCUSSIONE E CONCLUSIONI I risultati ottenuti, seppure su un numero preliminare di casi, ci hanno consentito di sperimentare cbn successo la metodologia analitica basata sul trasferimento di energia fra fluorocromi specifici. Ciò è stato possibile grazie all'impiego di uno strumento in grado di sfruttare le potenzialità peculiari della lampada a vapori di Mercurio; che offre ligand ASSAY VOL. 4 NUMERO 2 ANNO 1999
, 000 ) 11------ A ~, B ~" :,;,~"/;~~;;~~ j {ìj l ~[] ':-JJ--. o 50 '~... ' 50:ZOO 150 '"",., '" 0 0. 1 l IO 100 1000 I~D PI/DACM ecc UV I:L I,., '''' i ~l' nlr -r! ' - ""'~~" ;C;;;'-'-''-- ''-'~7.C''''--~;;;-----,l~ 0 0. 1 l n.'~ lco -,1XlO! -=_. o,,-;,:;; ~-~;_""' c~ 0.1 l F; g 100 1000 Figurai Confronto fra risultato dell'analisi dopo semplice colorazione con PI (grafici a sinistra) e colorazione doppia con PI e DACM (grafici a destra) di due soggetti "normali" (A e B). Legenda sinistra: FSC ''forward scatter", DNA ''fluorescenza rossa", counts "numero di cellule". Legenda destra: FL III ''fluorescenza rossa", FL IV ''fluorescenza blu", counts "numero di cellule" PI/DACM ecc UV l~~! ~[IJ L>=.:4.',,;...'--'.-"--~-_-=-_...,J_ 0 0. 1 l IO lco 1000 ". l ~~!~c "'~'!,,'''' ' ''''' '''' l "'.;;~~p "_,..,_'_+.-;;;- -;;;;;--.L 001 1 F~~ 100 1000 Figura 2 Confronto fra risultato dell'analisi dopo semplice colorazione con PI (grafici a sinistra) e colorazione doppia con PI e DACM (grafici a destra) di due soggetti (A e B) classificati moderatamente fuori dagli intervalli di normalità (secondo OMS 92) per la presenza di cellule rotonde. Legenda sinistra: FSC ''forward scatter", DNA ''fluorescenza rossa", counts "numero di cellule". Legenda destra: FL III ''fluorescenza rossa", FL IV ''fluorescenza blu", counts "numero di cellule" '" LlGAND ASSAY VOL 4 NUMERO 2 ANNO 1999
11------- PIIDACM ecc UV A I~D o 50 1~150200 150 Figura 3 Confronto fra risultato dell'analisi dopo semplice colorazione con PI (grafici a sinistra) e colorazione doppia con PI e DA CM (grafici a destra) di due soggetti (A e B) francamente patologici (secondo OMS 92) per la presenza di cellule rotonde. Legenda sinistra: FSC ''forward scatter", DNA ''fluorescenza rossa", counts "numero di cellule". Legenda destra: FL III ''fluol'escenza rossa", FL IV ''fluorescenza blu", counts "numero di cellule" grande versatilità di eccitazione in UV. L'aspetto più importante che si vuole sottolineare è l'originalità dell'assetto analitico globale in quanto la citometria a flusso è stata utilizzata non per la misura di intensità di fluorescenza correlata ad un valore di "contenuto" bensì per fornire informazioni riferibili alla struttura. Nel caso specifico la premessa era proprio quella della variazione della struttura (e soprattutto del rapporto DNA/protamine) in funzione del grado di maturazione e quindi della potenziale funzionalità delle cellule stesse. Le prospettive di impiego della citometria a flusso per quanto riguarda l'analisi automatizzata del liquido seminale sono ulteriormente validate da questo nuovo approccio analitico che sebbene necessiti di essere confermato da un numero più significativo di casi ha comunque fornito dei risultati molto incoraggianti. D'altra parte il costante sviluppo tecnologico della strumentazione e il sempre crescente interesse a sviluppare e sperimentare nuove metodologie di marcatura di componenti cellulari è prevedibile possa portare anche in questo settore i successi applicativi che la citometria a flusso ha ormai consolidato nel campo dell'ematologia. BIBLIOGRAFIA 1. Evenson DP, Melamed MR. Rapid analysis of normal and abnormal celi types in human semen and testis biopsies by flow cytometry. J Hystochem Cytochem 1983; 31: 248-53. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Spanò M, Calugi A, Capua no V, et al. Flow cytometry and sizing for routine andrological analysis. Andrologia 1984; 16: 367-75. Harrison PE, Barrat CLR, Robinson AJ, et al. Detection of white blood celi populations in the ejaculate of fertile meno J Reprod Immunol 1991; 19: 95-8. Evenson DP, Parks JE, Kaproth MT, et al. Rapid determination on sperm celi concentration in bovine semen by flow cytometry. J Dairy Sci 1993; 76: 86-94. Ferrara F, Daverio R, Mazzini G, et al. Automation of human sperm celi analysis by flow cytometry. Clin Chem 1997; 43: 801-7. Spanò M, Evenson P. Flow cytometric analysis for reproductive biology. Biol CelI 1993; 78: 53-62. Anderson D, Dobrzynska MM, Yu TW, et al. DNA integrity in human sperm. Teratog Carcinog Mutagen 1997; 17: 97-102. Golan R, Shochat L, Weissenberg R, et al. Evaluation of chromatin condensation in human spermatozoa( a flow cytometric assay using acridine orange staining. Mol Hum Reprod 1997; 3: 47-54. 9. Zucker RM, Perrauit SO, Eistein KH. Utility of light scatter in the morphological analysis of sperm. Cytometry 1992; 13: 39-47. 10. Tao J, Du J, Crister ES, Crister JK. Assessment of the
acrosomal status and viability of human spermatozoa simultaneously using flow cytometry. Human Reprod 1993; 8: 1879-85. 11. Fulwyler MJ. Electronic separation of biological cells by volume. Science 1965; 150: 910. 12. Gohde W. Automation of cytofluorometry by use of the impulsemicrophotometer. Fluorescence techniques in cell biology. A Thaer and M. Sernetz eds, Springer Verlag, New York 1972; 79-88. 13. Mazzini G, Danova M. Citometria a flusso: applicazioni cliniche dell'analisi del DNA in oncologia. Collana "I manuali delle scuole" Manuale Ph. D. 08. Ed. Scuola Superiore Oncologia e Scienze Biomediche 1994 Genova. 14. Hettwer H, Hofrnan N, Ehle B. Shape position of the haploid peak in flow cytometric sperm histogram for the assessment of andrological diseases. Andrologica 1986; 18: 312-20. 15. Bedford JM, Bent MJ, Calvin H. Variations in the structural character and stability of the nuc1ear chromatin in morphologically normal human spermatozoa. J Reprod Fert 1973; 33: 19-29. II.. 16. Auger J, Schoevaert D, Dadoune J. Computer-assisted TEM image cytometry: a new approach for the study of morphological and chromatin texture changes related to sperm cell differentiation and maturation. Biol Cell 1990; 43A: 70. 17. Engh E, Clausen OPF, Scholberg A, et al. Relationship between sperm quality and chromatin condensation measured by sperm DNA fluorescence using flow cytometry. Int J Andro11992; 15: 407-15. 18. Fossa SD, De Angelis P, Kraggerud S.M, et al. Prediction of posttreatment spermatogenesis in patients with testicular cancer by flow cytometric sperm chromatin structure assay. Cytometry 1-997; 30: 192-6. 19. Bottiroli G, Croce AC, Pellicciari C, et al. Propidium iodide and the thiol-specific reagent DACM as a dye pair for fluorescence resonance energy transfer analysis: an application to mouse sperm chromatin. Cytometry 1994; 15: 106-16. 20. Zuccotti M, Katayose H, Matsuda J, et al. Fluorescence energy transfer shows that various physical and chemical treatment of human sperm induce unpacking of chromatin. Andrologia 1994; 26: 225-30. Per corrispondenza: Dott. Giuliano Mazzini Dipartimento di Biologia Ambientale Università degli Studi di Pavia P.zza Botta, 10 27100 Pavia Te!': 0382-506429 - Fax: 0382-506430 e-mail: esi@dragon.ian.pv.enr.it