COMPLESSO IV: CENTRI REDOX Subunità II = 1 centro redox: Cu A (centro binucleare a 2 atomi di rame legati a due residui di cisteina, formano una struttura geometrica simile a quella di un centro FeS) riceve e - dal CytC rid Subunità I = 3 centri redox: eme a (Fe 3+ ) eme a 3 (Fe 3+ ) Cu B Centro binucleare FeCu Riduce l O 2 La Tyr 244 partecipa al trasferimento degli e - all O 2 D. Voet C. W. Pratt J. G. Voet, FONDAMENTI DI BIOCHIMICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2013 18 23
COMPLESSO IV (13 subunità) (citocromo c ossidasi) Catalizza l ossidazione del citocromo c e la riduzione dell O 2 ad H 2 O 2 e- trasferiti da 2 Cyt-C al CuA sono sufficienti per ridurre ½ O 2 ad 1 H 2 O. Per ridurre completamente 1 O 2 ad H 2 O occorre che arrivino 4 Cyt-C (4 e-). 2H + 2xCytC 2x e - Il passaggio di 2e - (uno alla volta) attraverso i centri redox libera energia sufficiente da attivare una canale protonico e traslocare 2H + nello spazio intermembrana ½ O 2 2H + 2H + 1 H 2 O Nelson Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2014 19 24
Per ogni NADH che si riossida nel complesso I, la catena di trasporto degli e - trasloca 10 H + nello spazio intermembrana, per ogni FADH 2 riossidato sono traslocati 6 H +. 1NADH >>>> 10 H + out >>>> ½ O 2 H 2 O (4 H + out dal Compl. I 4 H + out dal Compl. III 2 H + out dal Compl. IV) e- e- e- e- https://www.youtube.com/watch?v=rdf3mnys1p0 1 FADH 2 >>>> 6 H + out >>>> ½ O 2 H 2 O (4 H + out dal Compl. III 2 H + out dal Compl. IV) Riduzione completa di O 2 2NADH >>>> 20 H + out >>>> O 2 2H 2 O Riduzione completa di O 2 2FADH 2 >>>> 12 H + out >>>> O 2 2H 2 O Trasferimento di 4 e -
I complessi I, III e IV generano un gradiente protonico che è sia un gradiente di concentrazione [H + ] sia un gradiente elettrico. L energia libera rilasciata dalle reazioni redox lungo la catena di trasporto degli e- viene immagazzinata come FORZA MOTRICE PROTONICA (teoria chemiosmotica di Mitchell) Spazio intermembrana + - Matrice A cavallo della membrana mitocondriale interna si stabilisce una differenza di potenziale elettrochimico (differenza di carica e di ph) D. Voet C. W. Pratt J. G. Voet, FONDAMENTI DI BIOCHIMICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2013 18 26
FORZA MOTRICE PROTONICA I protoni sono spinti a rientrare nella matrice secondo gradiente e ciò rende disponibile energia libera che viene utilizzata per la sintesi di ATP e- e- e- e- + + + + Complesso V + + + + + + + https://www.youtube.com/watch?v=rdf3mnys1p0 La membrana mit. Interna è impermeabile ai protoni. La porta d accesso verso la matrice per i protoni è il canale protonico dell ATP-sintasi (Complesso V), l enzima che sintetizza ATP. Nelson Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2014 19 27
COMPLESSO V o ATP-SINTASI o F 1 F O -ATPasi Componente F 1 (costituita dalle subunità α 3 β 3 γδε) Componente F o (subunità a 1 b 2 c 10 ) Matrice Contiene le subunità catalitiche (α e β) collegate alla componente F o tramite il gambo (γε) che si inserisce nel cilindro formato dalle subunità c, e la subunità δ collegata al dimero b F 1 Costituisce il canale protonico che attraversa la membrana (10 subunità c, 1 subunità a e il dimero b ) Mike Williamson, COME FUNZIONANO LE PROTEINE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2013 F o Spazio intermembrana 7 28
I protoni si muovono secondo gradiente attraverso un canale d ingresso creato dalla subunità a e raggiungono il cilindro c 10. Quando una subunità c lega 1 H + un altro H + è rilasciato nella matrice lasciando un sito vuoto. F 1 Matrice F o Mike Williamson, COME FUNZIONANO LE PROTEINE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2013 H + Spazio intermembrana 7 29 D. Voet, J.G. Voet, C.W. Pratt, FONDAMENTI DI BIOCHIMICA 2/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2007
matrice γε H + γε γε 2 1 10 11 12 2 1 H + H + H + H + 10 11 12 H + H + H + H + 3 2 1 10 11 H + H + H + H+ H + Sp. Interm. H + H + γε γε Il passaggio di H + nel canale protonico in 4 3 2 1 10 direzione della matrice H + H + H + H + provoca la rotazione del cilindro C10 e il gambo γε ruota con esso 3 2 1 10 11 H + H + H + H+ H +
La rotazione del gambo all interno dell esamero α 3 -β 3 modifica la sua conformazione aprendo e chiudendo i siti attivi in cui è sintetizzato ATP Occorre che ~ 10 H + attraversino la porzione F O per avere una rotazione completa. Cioè occorre l ossidazione di 1 NADH. Matrice Siti attivi: all interfaccia α-β F 1 (~ 3 ATP sintetizzati ogni rotazione completa: mediamente 1 ATP ogni 3 H + traslocati ). Spazio intermembrana F o
La forza motrice protonica creata dall ossidazione di 1 NADH è tale da produrre ~ 3 ATP (2,5 per ogni ½ O 2 ridotto), quella determinata dall ossidazione di 1 FADH 2 consente la sintesi di ~ 2 ATP (1,5 per ogni ½ O 2 ridotto). Il gradiente protonico si instaura lungo tutta la membrana mit. Interna, e può essere utilizzato quasi esclusivamente dalle varie copie di ATP-sintasi. Esse lavorano contemporaneamente e cooperano nel dissipare il gradiente. Anche la traslocasi Pi/H+ contribuisce a dissipare il gradiente.
3 siti catalitici, ciascuno può assumere 3 diverse conformazioni APERTA (0): rilascia l ATP appena sintetizzato e accoglie ADP + P i ALLENTATA (L): lega saldamente ADP + P i STRETTA (T): favorisce la condensazione di ADP + P i in ATP L T ENERGIA 0 ENERGIA L>T 0>L T>0 ENERGIA T>0 L>T 0>L Rotazione dell asse γ di 120 : i 3 siti cambiano conformazione Il sito allentato diventa stretto e sintetizza ATP, il sito vuoto diventa allentato, il sito stretto diventa vuoto e rilascia ATP David L. Nelson Michael M. Cox, INTRODUZIONE ALLA BIOCHIMICA DI LEHNINGER, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2015 19 33
L ATP-sintasi nel mitocondrio funziona come una «dinamo» che converte il movimento del complesso in energia: ruota ad una velocità di 130 Hz generando ca 400 molecole di ATP al secondo. Ogni molecola di ADP viene rifosforilata ca 1000 volte al giorno!! Il corpo umano sintetizza più di metà del suo peso in molecole di ATP. https://www.youtube.com/watch? v=3y1do4nnaky https://www.youtube.com/watch? v=rdf3mnys1p0
Esce 1 carica negativa netta (secondo gradiente) Sfrutta il gradiente protonico per traslocare il fosfato all interno: utilizza 1 H + ogni 3 H + che entrano invece con l ATP-sintasi David L. Nelson Michael M. Cox, INTRODUZIONE ALLA BIOCHIMICA DI LEHNINGER, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2015 19 35
Agenti che interferiscono con la fosforilazione ossidativa Inibizione del trasferimento di elettroni Inibizione dell ATP-sintasi Cianuro Azide Monossido di carbonio Antimicina A Rotenone Amytal Piericidina A Aurovertina Oligomicina Venturicidina citocromo c-ossidasi Trasferimento cit. b/cit. c 1 Trasferimento centri Fe-S/Q Componente F 1 Componente F O Disaccopiamento della fosforilazione dal trasferimento elettronico FCCP DNP Valinomicina Termogenina Carriers protonici idrofobici Ionoforo Forma canali protonici Inibizione dello scambio di membrana ATP-ADP Attratiloside Adenina-nucleoside traslocasi
AGENTI DISACCOPPIANTI IDROFOBICI Molecole liposolubili debolmente acide che si inseriscono nella membrana mitocondriale interna e fanno si che le reazioni redox attraverso i complessi continuino ad avvenire consumando l ossigeno senza però che venga sintetizzato ATP. Funzionano da carriers di H + : li legano sul lato esterno della membrana mitocondriale interna e li portano dentro la matrice: dissipano il gradiente protonico. I protoni rientrano nella matrice senza passare attraverso l ATP-sintasi D. Voet C. W. Pratt J. G. Voet, FONDAMENTI DI BIOCHIMICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2013 18 37
TERMOGENINA (UCP1) proteina disaccoppiante presente nei mitocondri del grasso bruno (tessuto adiposo presente nei neonati di mammifero, e nei mammiferi che vanno in letargo). Costituisce una via di ingresso per i protoni nella matrice senza che debbano passare per l ATP-sintasi. L energia è dissipata sottoforma di calore. Nel tessuto adiposo e muscolare dell essere umano adulto sono presenti le UCP2 e UCP3: proteine disaccoppianti che servono a regolare la velocità metabolica. Se la loro attività è elevata il metabolismo viene accelerato e così anche il consumo di combustibili accumulati.