La valutazione del materiale seminale

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1 La valutazione del materiale seminale

2 Due finalità 1. Scopo diagnostico 2. Scopo tecnologico-commerciale

3 Valutazione del riproduttore Sviluppo corporeo Stato di nutrizione e gestione

4 Valutazione del riproduttore Corretta conformazione in relazione alla razza ed età Treno posteriore ed appiombi

5 Valutazione del riproduttore Ispezione e palpazione dello scroto alterazioni di forma alterazioni di consistenza

6 Valutazione del riproduttore Circonferenza scrotale Alla pubertà fra cm Carattere ad elevata ereditabilità

7 Valutazione del riproduttore Parametro legato a numerosi fattori (età ) Correlato al peso testicolare Proporzionale alla quantità di spz/die (17M die/g parenchima)

8 Valutazione del riproduttore Libido Istinto alla procreazione Tempo di reazione Considerato carattere genetico ereditabile Legato agli ormoni (estrogeni/testosterone)

9 Valutazione del riproduttore Monta Interazione con la femmina Fiuta genitali esterni Sollevamento labro superiore (rif. Flehmen) Erezione Eiaculazione

10 Valutazione del riproduttore Tempi di eiaculazione Bovino 3-5 secondi Cavallo 1 minuto e oltre Suino diversi minuti Cane diversi minuti Gatto pochi secondi

11 Valutazione del riproduttore Monta Impennata Ancoraggio al bacino Propulsione con spinta eiaculatoria Eiaculazione vaginale (craniale)

12 Metodo di raccolta del seme Vagina artificiale Elettroeiaculazione Massaggio ghiandole accessorie

13 Ritmo di raccolta del seme Addestramento da mesi Fino a 2 anni 1/settimana Da 2 anni bisettimanale Massimo a 16 raccolte/mese (con riposo)

14 Valutazione del materiale seminale Valutazione macroscopica e chimica volume (contenitore graduato o peso) colore odore ph ( )

15 Valutazione del materiale seminale Valutazione microscopica concentrazione motilità morfologia integrità di membrana

16 Concentrazione camere contaglobuli (Burker, Thoma ) conteggio spz in ambienti a volume predefinito

17 Concentrazione Considerato il gold standard Limite legato alla preparazione del campione Tempo necessario

18 Camera di Burker n x h x dil x conv

19 Concentrazione Spettrofotometro Contatori elettronici (Coulter Counter) CASA

20 Concentrazione Bovino: x 10 6 /ml ( x 10 6 /ml) Cavallo: 240 x 10 6 /ml ( x 10 6 /ml) Cane: numero totale di spermatozoi più indicativo

21 Motilità soggettiva oggettiva CASA SQA

22 Motilità Soggettiva motilità di massa (0-100%) qualità del movimento (da 0 a 5)

23 Motilità Oggettiva Analizzatori computerizzati (CASA)

24 Motilità CASA, componenti: Microscopio a contrasto di fase neg. Telecamera ad alta frequenza Elaboratore

25 CASA PRINCIPI GENERALI Individuazione della testa Riscontro della testa nei successivi fotogrammi (Tracking) Ricostruzione della traiettoria Calcolo dei parametri numerici

26 Parametri cinetici degli spermatozoi Velocità sul percorso medio(vap) Velocità lineare (VSL) Velocità curvilinea (VCL) Ampiezza del movimento laterale della testa (ALH) Frequenza di attraversamento della traiettoria (BCF) Indice di rettilineità (STR) Linearità (LIN) Ovalizzazione della testa (ELONG) Superficie media della testa (SIZE) Coefficiente di Wobble (WOB) Danza (DANCE) Danza media (MeDANCE)

27 Parametri cinetici degli spermatozoi Valori generali Valori traccia per traccia

28 Sottopopolazioni Cluster 1 (mean± sd) Electroejaculated semen Cluster 2 (mean± sd) Cluster 3 (mean± sd) Cluster 1 (mean± sd) Epididymal semen Cluster 2 (mean± sd) Cluster 3 (mean± sd) % population VAP (μm/s) 53.56±47.11 a ±69.04 b 71.09±76.11 c 10.51±6.54 d ±57.98 e 76.33±56.49 de VSL (μm/s) 14.58±13.82 a ±65.96 b 59.38±71.66 c 7.49±5.65 d 91.19±55.84 e 50.05±53.95 f VCL (μm/s) ±70.42 a ±81.97 b ±96.28 c 24.58±15.96 d ±88.34 e ±88.4 de ALH (μm) 7.20±3.29 a 6.66±2.79 b 3.75±2.89 c 1.25±0.87 d 6.76±2.7 b 6.94±3.48 b BCF (Hz) 49.06±14.91 a 43.73±12.77 b 28.09±24.21 c 28.03±25.32 d 44.9±14.04 e 38.83±22.6 f STR (%) 29.05±13.49 a 78.47±17.69 b 72.64±21.55 c 69.87±24.3 d 77.60±19.16 e 52.35±29.75 d LIN (%) 10.13±4.85 a 51.21±21 b 43.08±25.03 c 38.06±26.3 d 43.25±18.12 e 27.02±22.63 d AREA (μm 2 ) 61.46±23.14 a 61.24±18.03 a 79.87±23.07 b 77.31±29.68 d 63.68±19.4 e 86.98± d ELONG (%) 4.85±3.8 a 6.13±4.42 b 2.64±2 c 2.24±2.02 d 6.05±2.91 b 2.41±2.56 d WOB (%) 36.82±12.86 a 63.25±17.51 b 55.82±20.7 c 50.87±22.82 d 53.80±14.71 e 45.25±17.41 d DANCE (μm 2 /s) ± a ± b ±845.0 c 39.39±37.61 d ± b ± d MeDANCE (%) 0.92±0.93 a 0.16±0.1 b 0.11±0.09 c 0.06±0.07 d 0.19±0.12 e 0.63±0.96 f

29 Morfologia Valutazione della forma degli spermatozoi colorazione (Diff-Quik, o altre) metodo di Hankock

30 Morfologia classificazione alla porzione interessata 1. a. della testa 2. a. del tratto intermedio 3. a. della coda

31 Morfologia classificazione in base alla sede a. primarie a. secondarie a. terziarie

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33 Vitalità Colorazione classica (eosina/nigrosina) Colorazioni in fluorescenza CFDA; SYBR-14 PI; Hoechst 33258; etidio omodimero;

34 Ulteriori test La valutazione del materiale seminale Integrità dell acrosoma (FITC-PSA/PNA) Potenziale dei mitocondri (Rodamina 123, Mito Tracker, JC-1) Stato di capacitazione (CTC, Merocianina 540) Frammentazione del DNA (acridina orange)

35 I test di laboratorio sono accurati nella valutazione delle caratteristiche del materiale seminale? Procedura essenziale per oggettivizzazione e comparazione Parametri usuali non predittivi della fertilità Spesso non identificano soggetti subfertili

36 Mancanza di correlazione fra test classici e recenti rispetto Fertilizzazione in-vivo Fertilizzazione in-vitro Mancanza di correlazione evidenziata in numerose specie

37 Differenti condizioni ambientali Microclima epididimale Eiaculazione Ambiente vaginale/uterino Legame con regioni della giunzione U.T. Capacitazione Interazione con zona e oocita

38 Fattori di variabilità individuale a livello cellulare Regolazione del volume cellulare Legame con l epitelio oviduttale Capacità di fertilizzare (capacitazione)

39 Regolazione del volume cellulare In condizioni di iperosmosi o ipoosmosi Capacità di perdere o acquisire liquidi Capacità acquisita a livello epididimale

40 Regolazione del volume cellulare Fisiologicamente eiaculazione (da iperosmosi a isosmosi) Tecnologicamente crioconservazione shock ipertonico al congelamento shock ipotonico allo scongelamento

41 Regolazione del volume cellulare Meccanismo che prevede la perdita di elettroliti Effetto legato alla fosforilazione/defosforilazione delle protein kinasi Adattamento del citoscheletro

42 Test per valutare la regolazione del volume Hypoosmotic swelling test per valutare la funzionalità della membrana ambiente ipotonico determina curvatura/arricciamento degli spz

43 Test per valutare la regolazione del volume Hypoosmotic swelling test limiti soggettivo non individua gli spz che esplodono

44 Test per valutare la regolazione del volume Osmotic challange Impiego di un contatore elettronico Volume cellulare determinato come resistenza elettrica al passaggio degli spz in un capillare

45 Test per valutare la regolazione del volume Osmotic challange Determina il volumetrico come V ipertonico V isotonico

46 Interazione con l ovidutto Spesso deposizione relativamente lontana dall ovulazione epitelio sequestra gli spermatozoi adesione e rilascio controllato significato di stabilizzazione e aumento sopravvivenza

47 Interazione con l ovidutto Spesso deposizione relativamente lontana dall ovulazione epitelio sequestra gli spermatozoi adesione e rilascio controllato significato di stabilizzazione e aumento sopravvivenza

48 Interazione con l ovidutto Individuato il legame carboidrato-recettore Importante la normale architettura dello spermatozoo Non ancora sviluppato un test in-vitro

49 Capacitazione Cascata di modificazioni metaboliche e strutturali Rendono lo spermatozoo in grado di fertilizzare Difficoltà nello studio in-vivo

50 Capacitazione Condizioni ambientali tipiche: elevata concentrazione di bicarbonato elevata concentrazione di CO2 influenza di fattori ovulatori

51 Capacitazione Valutazione Clortetraciclina (calcio) Merocianina 540 Annessina V