Misura del trasporto ionico transepiteliale mediante la tecnica della cortocircuitazione

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1 Misura del trasporto ionico transepiteliale mediante la tecnica della cortocircuitazione

2 Ambiente esterno Ambiente interno Giunzioni intercellulari Membrana luminale Canale intercellulare Membrana serosale Rappresentazione schematica di cellule epiteliali Costituiscono una barriera che separa l ambiente esterno all organismo, o cavità comunicanti con esso, dall ambiente interno trasformano le sostanze che provengono dall ambiente esterno selezionano il movimento di innumerevoli sostanze in ingresso o in uscita attraverso tale barriera effettuando assorbimento o secrezione.

3 Ambiente esterno Ambiente interno Giunzioni intercellulari Membrana luminale Canale intercellulare Membrana serosale Rappresentazione schematica di cellule epiteliali Le due membrane delle cellule epiteliali (apicale e basolaterale) sono diverse tra loro sia da un punto di vista morfologico che funzionale. Tale diversità conferisce all epitelio la capacità di operare un trasporto netto direzionato di sostanza (dal lume al sangue, cioè in senso assorbente, oppure dal sangue al lume ossia in senso secernente).

4 Il dispositivo più utilizzato per studiare gli epiteli da un punto di vista funzionale è rappresentato dalle Camerette di Ussing. Nella loro struttura più semplice sono costituite da due semicamerette in plexiglass comunicanti attraverso una finestra di diametro variabile. L epitelio, viene incastrato a sandwich tra le due semicamerette e va in tal modo ad occludere la finestra di comunicazione tra i due ambienti. In questo modo l epitelio si trova esposto con il suo lato apicale verso il mezzo acquoso contenuto in una semicameretta e il lato basolaterale verso il mezzo acquoso contenuto nell altra semicameretta. Le camerette di Ussing consentono lo studio del trasporto vettoriale di sostanze a cavallo di un epitelio Cameretta di Ussing Epitelio Lato basolaterale Lato apicale

5 Consentono di studiare il complesso funzionamento dell epitelio nella sua totalità Semicameretta di Ussing Semicameretta di Ussing Rappresentano una misura integrata del funzionamento dei vari trasportatori presenti sulla membrana apicale e basolaterale, responsabili del trasporto transepiteliale di sostanze Cameretta di Ussing Epitelio Lato basolaterale Lato apicale

6 Le camerette di Ussing consentono lo studio del trasporto vettoriale di sostanze attraverso un epitelio. Cameretta di Ussing Epitelio Lato basolaterale Lato apicale Infatti, si supponga di aggiungere una data sostanza nel mezzo di incubazione mucosale e di prelevare campioni di liquido dal mezzo di incubazione serosale a determinati intervalli di tempo. Se con opportuni metodi si determina in tali campioni la concentrazione della sostanza, si può calcolare il flusso della sostanza stessa dal lato apicale a quello basolaterale dell epitelio.

7 Cameretta di Ussing Epitelio Lato basolaterale Lato apicale Tecniche per la misura del trasporto vettoriale di sostanze in epiteli montati su camerette di Ussing: - tecniche radioisotopiche (per sostanze marcate con radioisotopi) -tecniche spettrofluorimetriche spettrofotometriche (per sostanze la cui concentrazione in soluzione può essere determinata spettrofluorimetricamente o spettrofometricamente. Ad esempio per misurare il trasporto di proteine integre da un lato all alltro dell epitelio che può avvenire per transcitosi. Pertanto, le proteine vengono inglobate integre per endocitosi a livello di una delle due membrane dell epitelio ed esocitate dal lato opposto. Questa è la via attraverso la quale possono essere assunte tossine o allergeni attraverso il tratto gastrointestinale ) -tecniche elettrofisiologiche (che permettono delle misure fisiologiche che si basano sui fenomeni elettrici legati al funzionamento di tali tessuti)

8 Studi fisiologici sugli epiteli mediante camerette di Ussing hanno interesse in campo: fisiologico farmacologico clinico tossicologico e ambientale Il dispositivo delle camerette di Ussing, disegnato per studiare il movimento vettoriale di ioni attraverso la pelle di rana, ha conosciuto un notevole sviluppo di possibili applicazioni dallo studio dell integrità di layers cellulari allo studio delle proprietà invasive delle cellule cancerogene.

9 Cameretta di Ussing Epitelio Tecniche per la misura del trasporto di sostanze in epiteli montati su camerette di Ussing: - tecniche elettrofisiologiche

10 asimmetrica distribuzione di proteine di trasporto a livello della membrana apicale e basolaterale delle cellule epiteliali. il complesso proteico che costituisce la giunzione tight intercellulare sigilla cellule epiteliali adiacenti garantendo così la funzione di barriera svolta dall epitelio. La formazione e la permeabilità delle tigth junctions determina la resistenza e l integrità del tesuto.

11 EPITELI LEAKY ED EPITELI TIGHT La presenza o meno di una via intercellulare in parallelo con la via cellulare consente di discriminare rispettivamente tra epiteli leaky o a bassa resistenza ed epiteli tight o ad alta resistenza. Negli epiteli leaky la resistenza offerta dalla barriera epiteliale sarà bassa e sarà circa uguale a quella offerta dalla via intercellulare. Negli epiteli tight, invece, la via intercellulare è ad elevata resistenza per cui il passaggio delle sostanze avviene prevalentemente attraverso la via cellulare. La permeabilità della via paracellulare di un epitelio dipende dalle caratteristiche delle sue tight junctions. EQUIVALENTE ELETTRICO DI UN EPITELIO INTESTINALE

12 Trasporto vettoriale di ioni Trasporto vettoriale di ioni e molecole attraverso l epitelio La via di trasporto cellulare è rappresentata da un insieme concertato di diversi sistemi di trasporto, sia attivi (primari e secondari) che passivi (canali). Il movimento transepiteliale degli ioni e delle molecole trasportabili da carrier richiede dapprima il loro ingresso nella cellula epiteliale e succcessivamente la loro fuoriuscita nel liquido extracellulare. Tale trasporto, che si tratti di assorbimento o di secrezione, richiede generalmente due processi: uno, a livello di una delle due membrane, è un processo attivo che richiede energia (in cui le sostanze si muovono contro gradiente di concentrazione), mentre l altro, che avviene sull altra membrana plasmatica è un processo passivo. L asimmetrica distribuzione di meccanismi di trasporto attivi e passivi sulle due membrane consente questo trasporto direzionato.

13 In tutti gli epiteli l assorbimento o la secrezione di ioni determina differenze di potenziale elettrico transepiteliale (Vt) tra lato luminale e serosale. Tali differenze di potenziale variano da poche centinaia di mv a molte centinaia di mv e possono essere positive o negative dal lato serosale rispetto a quello mucosale a seconda dei trasporti ionici coinvolti. Negli epiteli a bassa resistenza la differenza di potenziale è di pochi mv, mentre negli epiteli ad elevata resistenza è pari a molte decine di mv. 0 Vt Lato apicale Lato apicale DV (mv) Vm Vs Vt Vm -50 Vs Lato basolaterale lume lume cellula connettivo cellula connettivo Esempio: Vm = -50mV; Vs = -45 mv Vt = (-45) = = -5 mv

14 Il Vt è ripartito sulle due membrane, apicale e basolaterale, e risulta, quindi, essere pari alla somma algebrica dei due potenziali di membrana (Vm e Vs). Infatti, se si traccia l equivalente elettrico delle cellule epiteliali, si osserva come nella cellula epiteliale le due membrane siano in serie, per cui saranno in serie anche Vm e Vs. Ad eccezione di alcuni epiteli tight come la pelle di rana, in generale Vm e Vs sono negativi dal lato cellulare, per cui essi risultano di segno opposto e la differenza di potenziale transepiteliale è pari quindi alle differenze dei loro valori assoluti Vt Vm Vs Lato Lato apicale apicale Lato basolaterale DV (mv) -50 lume 0 Vm lume Vt - - Vs cellula connettivo cellula Esempio: Vm = -50mV; Vs = -45 mv Vt = (-45) = = -5 mv connettivo

15 Strettamente correlato al potenziale transepiteliale è un altro parametro di funzionalità epiteliale : la corrente di cortocircuito, Isc (µa/cm 2 ) la quale in opportune condizioni sperimentali, ossia quando il tessuto è bagnato da soluzioni di uguali concentrazioni ioniche da entrambi i lati, è una misura indiretta del trasporto attivo degli ioni attraverso l epitelio. La corrente di cortocircuito rappresenta la corrente necessaria per azzerare la differenza di potenziale transepiteliale. Essa, inviata sperimentalmente al tessuto attraverso uno strumento detto cortocircuitatore, è di intensità pari ma di segno contrario alla corrente ionica che il tessuto, grazie ai suoi meccanismi di trasporto, attiva transepitelialmente nel senso dell assorbimento o della secrezione.

16 Soluzione luminale J J C C C C C 1 2 Soluzione serosale LIS C = cellula J = tight junction LIS = spazio laterale 1 via di permeazione paracellulare o via di shunt 2 via di permeazione cellulare Le giunzioni tight non sono delle semplici barriere impermeabili: esse manifestano una certa permeabilità a ioni e piccole molecole e una selettività ionica e dimensionale. Il loro grado di permeabilità, da cui dipende la tightness di un epitelio, varia a seconda del tipo di epitelio considerato. La tightness di un epitelio può essere espressa elettricamente come

17 Rpar Rm Rs Un indice della permeabilità agli ioni inorganici della via paracellulare ed una misura della funzione di barriera svolta dalle giunzioni tight di un epitelio, viene fornita dalla misura della resistenza transepiteliale. Epiteli con valori di resistenza bassa di pochi Ώcm 2 trattengono differenze di potenziale di pochi mv, non sviluppano gradienti osmotici e trasportano fluido isotonico in elevata quantità (intestino tenue, cistifellea, tubulo prossimale) Epiteli con valori di resistenza transepiteliale elevata invece, sono in grado di sviluppare forti gradienti osmotici, trasportano spesso fluido ipertonico, trattengono differenze di potenziale elettrico elevate di decine di mv. Il modo più semplice per misurare sperimentalmente Rt è attraverso la legge di Ohm Rt = DV I I = DV = impulso noto di corrente che viene fatto passare attraverso l epitelio variazione del potenziale transepiteliale che la corrente nota genera passando attraverso la resistenza dell epitelio.

18 CAMERETTA DI USSING E APPARATO DI PERFUSIONE 99% O 2 1% CO 2 Soluzione Ringer 18 C Lato Serosale Lato mucosale Tessuto V 1 e V 2 = elettrodi di Ag/AgCl per la misura del potenziale transepiteliale I 1 e I 2 = elettrodi di Ag/ AgCl per la misura della corrente di cortocircuito.

19 PARAMETRI ELETTROFISIOLOGICI MISURATI CON LA TECNICA DELLA CORTOCIRCUITAZIONE V t ( mv) Isc (μa/cm 2 ) R t (Ω x cm 2 ) Potenziale transepiteliale Corrente di cortocircuito Resistenza del tessuto Sono espressione di un trasporto netto di Cl - attraverso l epitelio Calcolo di R t ΔV = I x R Legge di Ohm R = ΔV/I R t = (ΔV t - ΔV sol )/I I = 33 μa/cm 2 ; cm 2 = 0.6

20 Epitelio intestinale di anguilla come modello di studio del trasporto ionico transepiteliale European eel Trasporto attivo transepiteliale di NaCl Na + -K + -2Cl - K + + Lato Luminale epitelio intestinale Essendo sede di un elevato assorbimento di NaCl, può rappresentare un utile mezzo per studiare l attività di trasporto di un epitelio assorbente Somiglianza tra i meccanismi di trasporto ionico presenti nel tratto medio dell'epitelio intestinale di anguilla e quelli presenti nell'epitelio del tubulo renale del tratto spesso ascendente dell'ansa di Henle di mammifero. enterocita ATP Na + ADP+P i Cl - K + - Na + Lato Basolaterale Nel modello ionico descritto il Na + risente del potenziale transepiteliale, negativo dal lato serosale, e viene richiamato elettricamente attraverso le giunzioni verso il lato basolaterale dell epitelio. Pertanto il trasporto ionico complessivo consiste nell assorbimento transepiteliale di NaCl. Il trasporto transepiteliale di Cl - sopravanza il trasporto di Na +, generando una differenza di potenziale transepiteliale negativa dal lato basolaterale rispetto a quello apicale del tessuto ed una corrente di cortocircuito misurabile, espressa come flusso netto di cariche negative in direzione mucosa-serosa. Tali parametri elettrofisiologici sono espressione indiretta dell assorbimento attivo transepiteliale di Cl -.

21 Cameretta di Ussing Epitelio Lato basolaterale Lato apicale (collegato a terra) Vt (mv) Isc (ma/ cm 2 ) Rt (W cm 2 ) -4.4± ± ±2.3 Da dove scaturisce Vt e Isc? Quali sono i meccanismi di trasporto ionico responsabili?

22 Cameretta di Ussing Epitelio Lato basolaterale Lato apicale (collegato a terra) Approccio farmacologico = utilizzo di inibitori specifici di trasportatori ionici Rimozione ionica = rimozione di specifici ioni dalle soluzioni di perfusione

23 -4 - Se si aggiunge ouabaina 0.1 mm (inibitore -3 - specifico della pompa Na + - K + -ATPasi) nella soluzione di perfusione -2 - serosale, il potenziale transepiteliale e la corrente di cortocircuito -1 - dell epitelio manifestano 0 - il seguente andamento nel tempo: Vt (mv) Approccio farmacologico = utilizzo di ouabaina, inibitore specifico della pompa Na + -K + -ATPasi Cameretta di Ussing 10 min Lato mm bumetanide apicale (luminal Lato side) basolaterale 75 mm Mannitol Vt (mv) Vt (mv) ouabaina 0.1 nm ouabaina 0.1 mm 10 min Vt Isc Epitelio 10 mm bumetan 10 mm bumetan Isc (ma x cm -2 ) 7 7

24 enterocita ATP + Approccio farmacologico = utilizzo di ouabaina, inibitore specifico della pompa Na + -K + -ATPasi ouabaina 0.1 nm Cameretta di Ussing Epitelio Lato apicale Lato basolaterale a) Vt e Isc osservati sono espressione di un trasporto transepiteliale attivo dipendente dall attività della pompa Na + -K + - ATPasi Lato apicale Lato basolaterale ADP+P i Na + - K +

25 Qual è il trasporto attivo secondario, dipendente dall attività dalla pompa Na + -K + -ATPasi responsabile di Vt e Isc

26 Approccio farmacologico = utilizzo di bumetanide, inibitore specifico del trasporto Na + -K + -2Cl - Bumetanide 10 mm Cameretta di Ussing Epitelio Lato apicale Lato basolaterale Se si aggiunge bumetanide 10 mm (inibitore specifico del cotrasporto Na + /K + /2Cl - ) nella soluzione di perfusione mucosale, il potenziale transepiteliale e la corrente di cortocircuito dell epitelio manifestano il seguente andamento nel tempo: Bumetanide 10 mm (m)

27 Approccio farmacologico = utilizzo di bumetanide, inibitore specifico del trasporto Na + -K + -2Cl - + ATP Bumetanide 10 mm Cameretta di Ussing Epitelio Lato apicale Lato basolaterale L esperimento con bumetanide dimostra l esistenza di un trasporto Na + -K + -2Cl - sulla membrana apicale dell enterocita, responsabile di Vt e Isc Lato apicale Na + -K + -2Cl - enterocita Lato basolaterale ADP+P i Na + - K +

28 Approccio farmacologico = utilizzo di NPPB o di DPC, inibitori specifici dei canali del Cl - NPPB 0.1 nm Cameretta di Ussing Epitelio Lato apicale Lato basolaterale NPPB 0.1 mm Se si bloccano i canali basolaterali del Cl - si annulla Vt e Isc

29 ATP + Approccio farmacologico = utilizzo di NPPB o di DPC, inibitori specifici dei canali del Cl - NPPB 0.1 nm Cameretta di Ussing Epitelio Lato apicale Lato basolaterale Il Cl - accumulato in cellula dall azione del cotrasporto Na + - K + -2Cl - fuoriesce dalla membrana basolaterale attraverso canali per il Cl -, generando la corrente di Cl - responsabile di Vt e Isc. Il trasporto transepiteliale di Cl - determina una differenza di potenziale transepiteliale negativa dal lato basolaterale. Lato apicale Na + -K + -2Cl - enterocita Lato basolaterale Cl - ADP+P i Na + - K +

30 Rimozione ionica = rimozione di specifici ioni dalle soluzioni di perfusione Cameretta di Ussing Epitelio Lato apicale Lato basolaterale La soluzione di perfusione ha una composizione ionica, ph e osmolarità simili a quelle del plasma dell animale utilizzato per le attività sperimentali. Composizione ionica (in mm): NaCl 125, KCl 2.2, MgCl 2 1.0, NaHCO 3 20, KH 2 PO 4 0.3, glucosio 11, CaCl

31 Composizione ionica (in mm): NaCl 125, KCl 2.2, MgCl 2 1.0, NaHCO 3 20, KH 2 PO 4 0.3, glucosio 11, CaCl Sostituzione del NaCl con N-metilglucammina cloruro Si azzera sia Vt che Isc Vt e Isc sono Na + dipendenti Sostituzione del NaCl con gluconato di sodio Si azzera sia Vt che Isc Vt e Isc sono Cl - dipendenti

32 + Il trasporto transepiteliale di Cl - è accompagnato da quello del Na +. Il trasporto del Na + avviene pertanto in parte per via cellulare attraverso il cotrasporto Na + - K + -2Cl - ( a livello della membrana apicale) e attraverso la pompa Na + /K + ATPasi a livello della membrana basolaterale in parte per via paracellulare attraverso le giunzioni tra cellula e cellula, secondo il suo gradiente elettrochimico, richiamato dal gradiente elettrico transepiteliale creato dal trasporto del Cl - Na + Lato apicale Na + -K + -2Cl - Na + -K + -2Cl - enterocita Cl - ADP+P i Na + Na + ADP+P ATP i ATP Cl - Lato basolaterale K + - K +

33 STUDIO DELLE CARATTERISTICHE DI PERMEABILITA DELLA VIA PARACELLULARE MEDIANTE POTENZIALI DI DIFFUSIONE A CAVALLO DELL EPITELIO La via di permeazione intercellulare si attua essenzialmente a livello delle giunzioni tight del tessuto, le quali in un epitelio leacky possono essere attraversate da piccoli ioni e piccole molecole che in tal modo aggirano la cellula Nell epitelio intestinale, nel groviglio proteico che costituisce la giunzione, è presente un campo elettrico negativo impartito da gruppi carbossilici o fosfato o carbonile che sporgono dalle membrane adiacenti alla giunzione. Questo campo elettrico negativo fa si che la diffusione degli ioni sia fortemente controllata: i cationi passano molto meglio degli anioni. Tale fenomeno può essere messo in evidenza misurando il potenziale di diffusione generato da un gradiente di concentrazione di NaCl ai due lati del tessuto.

34 Grazie alla presenza delle cariche fisse negative a livello delle giunzioni intercellulari la mobilità del Na + attraverso la via giunzionale diventa maggiore di quella del Cl -, contrariamente a quanto avviene in ambiente libero. Pertanto, nel caso, ad esempio, di un gradiente di concentrazione di NaCl serosa-mucosa (serosa > mucosa) si osserva una iperpolarizzazione di Vt, dovuta alla più veloce diffusione degli ioni Na + rispetto agli ioni Cl - verso il lato mucosale. Nel caso di un gradiente di concentrazione in direzione opposta, si invertirà il segno del potenziale di diffusione.

35 Applicando la formula di Hodgkin e Katz è possibile calcolare il rapporto di permeabilità relativa del Cl - rispetto al Na + Formula di Hodgkin e Katz: DV = - RT ln PNa [Na] + PCl [Cl] zf PNa [Na] + PCl [Cl] dove: gli apici e si riferiscono alle soluzioni di bagno mucosale e serosale rispettivamente; DV è il potenziale di diffusione ; Rt/zF è pari a 25,5 mv a 25 C; P è il coefficiente di permeabilità relativa; Dividendo numeratore e denominatore dell equazione per PNa si calcola il valore di PCl/PNa

36 Recentemente la messa a punto di microcamerette di Ussing ha permesso il loro utilizzo anche in campo clinico: Biopsie rettali (diagnosi di fibrosi cistica - mancanza di secrezione di Cl - ; carcinoma colon retto - alterazione della resistenza transepiteliale) Biopsie intestinali (celiac desease - decremento della resistenza transepiteliale)