Rhabdoviridae Grande famiglia di virus a -ssrna Dimensioni nm x nm Presenza di envelope fospolipidico

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1 e malattie notificabili dei salmonidi: ggiornamenti sui Novirhabdovirus nna Toffan entro di referenza nazionale per le malattie dei pesci, molluschi e crostacei tituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie Problematiche vecchie e nuove nell acquacoltura del terzo millennio orino, 6 Aprile 2018

2 Rhabdoviridae Grande famiglia di virus a -ssrna Dimensioni nm x nm Presenza di envelope fospolipidico

3 Rhabdoviridae Comprende 18 generi Infettano mammiferi, pesci, uccelli, artropodi e altri invertebrati, piante Solo 3 generi infettano i pesci: Sprivivirus Perhabdovirus Novirhabdovirus Pereiro et al. 2016

4 I Novirhabdovirus Comprende 4 specie: Infectious hematopoietic necrosis virus (IHN) Viral hemorrhagic septicemia virus(vhs) Hirame rhabdovirus Snakehead virus L IHN è l agente causale della necrosi ematopoietica infettiva (NEI) Il VHS è l agente causale della setticemia emorragica virale (SEV)

5 Distribuzione-VHS He et al. 2014

6 Distribuzione-IHN U E M L J

7 Distribuzione in Europa UK ufficialmente indenne per VHS e IHN Danimarca ufficialmente indenne da VHS e IHN dal 2009 Francia vuole raggiungere l indennità per VHS e IHN entro il 2022 VHS IHN endemici negli altri paesi europei

8 Focolai VHSe IHN in Europa 2016 Dati EURL 2016: 23% e 27% degli allevamenti in EU sono cat. I per VHS e IHN rispettivamente 74% e 70% degli allevamenti in EU sono categorizzati in cat. IIIper VHS e IHN rispettivamente 3% nelle restanti categorie II, IV e V (63 VHS e 53 IHN focolai aperti)

9 Italia: un po di storia La VHS èstata segnalata per la prima volta in Italia negli anni 60 (Ghittino et al. 1962) 1978: Programma volontario di controllo VHS in provincia di Trento 1988: Programma obbligatorio di controllo VHS in provincia di Trento L IHN èstata segnalata per la prima volta in Europa proprio in Italia nel 1987 (Bovo et al. 1987) 1990: IHN incluso nel programma di controllo Dal 1992 in poi: entrata in vigore norme comunitarie

10 Distribuzione aziende indenni in Italia aziende con specie sensibili censite 189 aziende indenni VHS 178 aziende indenni IHN Nessun nuovo focolaio di VHS e IHN nel 2017 In blu indenni per entrambe In verde indenni solo per VHS

11 VHS-ospiti Il VHS èstato isolato da piùdi 80 specie ittiche diverse in tutto il mondo La specie piùsuscettibile èla trota iridea (O. mykiss) Anche i pesci piatti (rombo e passera in particolare), il luccioe le aringhe sono molto sensibili alla VHS Trota fario, trota marmorata, salmerino sono meno suscettibili alla malattia L elenco (non aggiornato) delle specie sensibili e vettrici si trova nel D.lvo 148/2008 e nel Reg EC/1251/2008

12 IHN-ospiti Gli ospiti principale della malattia sono i pesci appartenenti alla famiglia dei Salmonidae Il salmone (S. salar) èsenza dubbio la specie piùsensibile Gli Oncorhynchus sono le più sensibili dopo il salmone Pesci appartenenti ad altra famiglie: Salvelinusspp. Anguilla Anguilla, Clupea pallasi, Gadus morhua, Acipenser transmontanus, Esox Lucius sono meno sensibili alla malattia IHNV è endemico nelle popolazioni di salmoni americani selvatici

13 Segni clinici Gli animali giovani sono i piùsuscettibili alla malattia con mortalitàche possono raggiungere anche il 100% I principali segni clinici sono: Letargia Melanosi Nuoto anomalo a spirale Esoftalmo Emorragie cutanee Anemia e/o emorragie branchiali Distensione addominale

14 Segni clinici VHS

15 Segni clinici VHS

16 Segni clinici IHN

17 Segni clinici IHN 1990 Ottobre 2015

18 Lesioni anatomo-patologiche Esoftalmo Ascite Splenomegalia Emorragie in tutti gli organi Anemia

19 Lesioni anatomopatologiche VHS

20 Lesioni anatomopatologiche VHS

21 Lesioni anatomopatologiche IHN

22 Lesioni anatomopatologiche IHN

23 Lesioni anatomopatologiche IHN

24 Patogenesi Trasmissione orizzontale e verticale (attraverso i fluidi riproduttivi) Lo sviluppo della forma clinica è strettamente dipendente dalla temperature dell acqua: tra 4 e 14 C il tempo di incubazione è di 5-12 giorni, a temperature <4 C il tempo di incubazione è maggiore, a temperature >15 C generalmente la malattia non si manifesta I virus replicano in tutti gli endoteli, causando forme sistemiche Nelle forme croniche i virus tendono a localizzarsi nel SNC I virus vengono eliminato con le escrezioni e le secrezioni dei pesci infetti La forma clinica è più grave nei pesci < 1 anno, ma episodi di malattia si possono osservare a tutte le età I pesci che sopravvivono generalmente restano portatori I virus possono resistere nell acqua a basse temperature per molto tempo (più di un anno) I virus possono essere veicolati con le attrezzature, le movimentazioni di animali infetti o portatori, uccelli ittiofagi

25 Diagnosi/1 IHN e VHS sono sovrapponibili dal pdv clinico: indispensabile ricorrere al laboratorio Sebbene molto simili VHSV e IHNV sono due virus distinti che noncross reagiscono Sono frequenti le coinfezioni Isolamento virale su colture cellulari (BF-2 and EPC) a 15 C. Altre linee cellulari (FHSM o le RTG-2) sono suscettibili 2 passaggi ciechi di 7 giorni ciascuno sono necessari prima di considerare il campione negativo.

26 Diagnosi/2 Alla comparsa dell effetto citopatico, l isolato virale può venire caratterizzato mediante: IF, PCR, ELISA, SN. L isolamento virale è stata per anni la tecnica gold standard. La decisione di esecuzione 1554/2015 che abroga la 183/2001 ha riconosciuto ufficialmente le tecniche di biologia molecolare. Photo by I. Capua

27 Diagnosi/3 Diversi protocolli di RT-PCR protocolli disponibili: End point RT-PCR Real time RT-PCR VHS (Jonstrup et al. 2013) Real time RT-PCR IHN (Purcell et al. 2013)

28 Filogenesi VHSV Panzarin et al ceppi di VHS sequenziati ( ) Gene G piùinformativo Identificati in Italia 7 cluster (A-F1) In Italia nel tempo ci sono state introduzioni virali multiple Virus a tasso di evoluzione intermedio ( subs/site/year) Time to the most recent common ancestor (tmrca) stimato tra

29 Filogenesi VHSV - Trentino Dati Solo 2 cluster virali circolanti Presenza di «scambi» virali tra allevamenti Nessuna nuova introduzione recente

30 Filogenesi IHNV Panzarin 9 ceppi di IHN sequenziati ( ) ene G più informativo entificato 1 solo cluster (A) irus a tasso di evoluzione > di VHS ( bs/site/year) me to the most recent common ancestor MRCA) stimato tra irus piùgiovane NV evolve più rapidamente di VHSV

31 Filogenesi IHNV - Trentino Dati Diversi ceppi virali circolanti Presenza di «scambi» virali tra allevamenti Introduzioni recenti? Aumentata virulenza di IHNV

32 Novimark Identificare i marker molecolari di virulenza dei Novirhabdovirus al fine di sviluppare e validare test diagnostici rapidiche consentano di discriminare tra ceppi a bassa e ad alta patogenicità. Partner : Institut National de la Recherche Agronomique (INRA, Francia) (Coordinatore) Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie (IZSVe, Italia) Agence Nationale de Sécurité Sanitaire (ANSES, Francia) Technical University of Denmark (DTU, Danimarca) Universidad de Santiago de Compostela (IA-USC, Spagna) Center for Enviroment Fisheries and Acquaculture Science (CEFAS, Regno Unito)

33 Novimark Prima fase: caratterizzare il maggior numero di ceppi di VHS e IHN in base alla patogenicità Infezione per bagno di trote iridee di 0,1-0,3 g con 10 4 TCID50/ml <40% bassa patogenicità >40% e <70% patogenicitàintermedia >70% alta patogenicità

34 Caratterizzazione VHSV Italiani Virus % cumulative mortality Class of virulence VHSV/O.mykiss/I/TN/480-2/Oct96 14,3 Low VHSV/O.mykiss/I/PN/234/Mar High VHSV/O.mykiss/I/BZ/301/Jun00 92,9 High VHSV/O.mykiss/I/TV/3-2/Dic02 55,7 Moderate VHSV/O.mykiss/I/TN/475/Nov04 91,4 High VHSV/O.mykiss/I/TV/299-3/Aug High VHSV/S.trutta/I/TN/470/Nov09 55,7 Moderate VHSV/O.mykiss/I/TN/80/Mar High VHSV/O.mykiss/I/TN/28-1.2/Feb High VHSV/O.mykiss/I/TN/62-5/Feb High VHSV/O.mikiss/I/TN/68-10/Feb High

35 Caratterizzazione IHNV Italiani Virus % cumulative mortality Class of virulence IHNV/O.mykiss/I/TN/459/Sep97 48,6 Moderate IHNV/O.mykiss/I/TN/139-6/Mar01 L.1 15,7 Low IHNV/O.mykiss/I/TN/139-6/Mar01 L.2 18,6 Low IHNV/O.mykiss/I/TV/3-1/Jan02 10 Low IHNV/O.mykiss/I/TV/310-1/May05 10 Low IHNV/O.mykiss/I/VI/409/Nov06 L.1 20 Low IHNV/O.mykiss/I/VI/409/Nov06 L.2 18,6 Low IHNV/O.mykiss/I/TN/534/Dec11 5,7 Low IHNV/O.mykiss/I/TN/143/Apr14 5,7 Low IHNV/O.mykiss/I/TN/86-9/Feb15 55,7 Moderate IHNV/O.mykiss/I/TN/68-4/Feb15 60 Moderate IHNV/O.mykiss/I/TN/62-6/Feb15 50 Moderate IHNV/O.mykiss/I/TN/509/Oct15 82,9 High

36 Novimark in progress Sequenza completa dei virus caratterizzati in vivo Identificazione delle mutazioni caratterizzanti i ceppi ad alta patogenicità, anche in associazione (NV-N-L) Generazione di virus reverse genetic (RG) con e senza le mutazioni identificate Infezioni sperimentali con ceppi RG Sviluppo test molecolari discriminanti i diversi ceppi

37 Controllo e Prevenzione Non esistono vaccini commerciali per questa malattia. Di fatto la vaccinazione èvietata ai sensi del D.lvo 148/2008 Applicazione delle norme di biosicurezza Buone prassi igieniche Installazione reti anti-ittiofagi Controllo approvvigionamento idrico Limitazione delle movimentazioni Riduzione dei contatti con animali selvatici (derattizzazione, ostacoli alla risalita, animali domestici) Raccolta e controllo della mortalità Introduzione di materiale indenne Disinfezione delle uova

38 Ceolin SIPI 20 Fattori di rischio di introduzione e diffusione di agenti infettivi (Dec. 2008/896) Acqua Ripopolamento a monte dell azienda con specie sensibili Presenza di aziende a monte e loro stato sanitario Movimentazione di pesci/uova Stato sanitario delle aziende da cui si acquista pesce e/o uova Introduzione di pesce selvatico Allevamento d acquacoltura Tipo di produzione Fattori geografici Densità degli allevamenti Prossimità degli allevamenti Stato sanitario degli allevamenti a monte e a valle Misure di biosicurezza Disinfezione di mezzi ed attrezzature Condivisione di mezzi e personale Presenza di reti contro uccelli ittiofagi

39 Analisi dei fattori di rischio per l introduzione di VHSV in impianto 1) Raccolta informazioni (dalle schede di richiesta di autorizzazione e valutazione del rischio) relative a: Indirizzo produttivo: az. con riproduttori, az. con incubatoio, az. da ingrasso per consumo umano Tipologia di approvvigionamento idrico : corso d acqua, pozzo, sorgiva Stato sanitario delle aziende da cui si acquista pesce 2) Raccolta informazioni geografiche (GIS): Posizione geografica Numero e stato sanitario degli allevamenti presenti nel raggio di 5 km Distanza dal più vicino allevamento positivo per VHS Numero di allevamenti presenti lungo il corso d acqua entro i 5 km a monte e a valle 3) Risultati analisi di laboratorio per la ricerca di VHS dal 2010 al ) Creazione ed implementazione di un database

40 Risultati Conferma di quanto riportato in letteratura (Oidtmann et al., 2011) cioè che i fattori di rischio più importanti associati alla diffusione di VHS sono: Stato sanitario aziende limitrofe Vicinanza ad allevamenti positivi Movimentazioni di animali vivi Conferma che i fattori considerati nella scheda di valutazione del rischio per il rilascio dell autorizzazione sono giustamente da prendere in considerazione: Presenza di aziende a monte e loro stato sanitario Movimentazioni (legate all indirizzo produttivo) stato sanitario delle aziende da cui si acquista pesce Ulteriori approfondimenti necessari analizzando anche l applicazione delle misure di biosicurezza nonché il numero e l origine delle singole partite introdotte in azienda

41 Controllo e Prevenzione Applicazione delle norme di biosicurezza Buone prassi igieniche Installazione reti anti-ittiofagi Controllo approvvigionamento idrico Limitazione delle movimentazioni Riduzione dei contatti con animali selvatici (derattizzazione, ostacoli alla risalita, animali domestici) Raccolta e controllo della mortalità Introduzione di materiale indenne Disinfezione delle uova

42 Abbattimento a fasi nelle aziende di acquacoltura sedi di focolaio Nota Minsal /01/2017 Nelle aziende colpite da VHS e IHN, in alternativa allo svuotamento completo dell azienda prima del ripopolamento, ove possibile, èpermesso effettuare il ripopolamento prima del completamento del ciclo produttivo dei pesci ancora sotto taglia commerciale (eradicazione per fasi) - Effettuata secondo una logica «da monte a valle» - Effettuata sotto controllo della ASL territorialmente competentecon l adozione di appropriate misure di biosicurezza - Associata all esecuzione di opportuni controlli diagnostici a carico dell allevatore per monitorare gli eventuali rischi sanitari

43 Sector 4 Sector 2 Sector 3 Sector 1

44 Eradicazione a step Vantaggi Approccio innovativo Approccio a lungo termine senza interruzione di produzione Minori costi di disinfezione e personale Educazione alla biosicurezza sul lungo termine In caso di reinfezione si può ricominciare il programma senza elevate perdite economiche Possibilitàdi chiudere i focolai di malattia Svantaggi Percentuale di successo sconosciuta Elevato rischio di reinfezione Azione di lunga durata Elevati costi di mantenimento della biosicurezza (nel lungo periodo)

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