Skeletal muscle plasticity. Functional analysis at cellular and molecular level

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Leone Capasso
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1 Skeletal muscle plasticity Functional analysis at cellular and molecular level 1

2 Plasticità muscolare Capacità di adattamento a diverse richieste funzionali 2

3 Meccanismi di plasticità muscolare quantitativo massa muscolare qualitativo distribuzione relativa dei diversi tipi cellulari le fibre muscolari scheletriche hanno proprietà funzionali molto diverse 3

4 L elemento contrattile fondamentale, il sarcomero, ha una grande uniformitá strutturale 4

5 number of fibres Eterogeneità funzionale delle fibre muscolari scheletriche : massima velocità di accorciamento Vo (L/s) Vo (L/s) 5

6 Il sarcomero e quindi le fibre muscolari hanno una grande eterogeneitá molecolare 6

7 Isoforma proteica Le proteine contrattili esistono in un numero di forme differenti Isoforme: Hanno funzione biologica simile, struttura terziaria molto simile ma differenti sequenze amminoacidiche Sono codificate da uno stesso gene o da geni diversi appartenenti alla stessa famiglia Sono intercambiabili, cioè un isoforma può sostituirsi ad un altra ma continuare la sua funzione 7

8 Isoforme della miosina scheletrica isoforme delle catene pesanti (MHC) 1, 2A, 2X (e 2B) isoforme delle catene leggere (MLC) Essenziali o alcaline 1f, 1s, 3f Regolatorie o fosforilabili 2s, 2f Le isoforme delle catene pesanti della miosina sono considerate i marker molecolari delle fibre muscolari 8

9 Diverse isoforme della miosina conferiscono proprietà funzionali diverse alle fibre muscolari scheletriche 9

10 Proprietà funzionali di singole fibre muscolari Meccanica muscolare a livello cellulare : skinned single fibres 10

11 Approccio sperimentale Isolare le fibre muscolari scheletriche Determinare nella stessa fibra muscolare scheletrica: tipo di motore miosinico miosina 1, 2A, 2X, 2B proprieta funzionali Forza e velocità di accorciamento confrontare le proprietà funzionali di diversi tipi cellulari 11

12 Identificazione del motore miosinico con tecnica elettroforetica MHC-2X MHC-2A MHC-1 MHC-1 tipo 1 MHC-2A tipo 2A MHC-2X tipo 2X MHC 1+2A tipo 1-2A MHC 2A+2X tipo 2A-2X 12

13 Proprietà funzionali delle singole fibre muscolari Campioni muscolari (50-100mg) Biopsie intraoperatorie Agobiopsie con aghi di 5mm di diametro Singole fibre (frammenti di 2-4mm) Chimicamente demembranate Massimalmente attivate Analisi condotte a 12 C, lunghezza del sarcomero ottimale, ph=7.0 13

14 Agobiopsie PRELIEVO DI CAMPIONI DI MUSCOLO VASTO LATERALE DI CIRCA mg IN ANESTESIA LOCALE 5 mm 14

15 Preparazione di singole fibre muscolari scheletriche 0.2 mm 15

16 Apparecchiatura sperimentale Trasduttore di forza Puller elettromagnetico 16

17 Singole fibre muscolari isolate x1000 magnification le fibre spellate e attivate attraverso esposizione a soluzioni contenenti calcio hanno un comportamento molto simile alle fibre intatte 50 μm 18

18 Parametri determinati Massima tensione isometrica specifica (Po/CSA) Velocità di accorciamento in assenza di carico (Vo) 19

19 Po (kn/m 2 ) Po/Po type 1 Massima tensione specifica isometrica 80 Po/CSA A 2A 2A-2X 2X MHC 20

20 Vo (L/s) Vo/Vo type 1 Velocità di accorciamento in assenza di SLACK TEST carico Vo A 2A 2A-2X 2X 0.0 fibre type 21

21 Forza specifica di fibre isolate da soggetti con ipertrofia muscolare (Body Builders) 22

22 Massima velocità di accorciamento di fibre isolate in soggetti anziani e anziani immobilizzati 23

23 Esistenza di meccanismi in grado di modulare le proprietà di un isoforma di miosina a) Influenza di altri componenti della fibra muscolare o di altre proteine sarcomeriche b) Modificazioni post-trasduzionali della molecola miosinica: glicosilazione (Ramamurthy et al 2001) 2); ossidazione (Coirault et al 2002 ; fosforilazione (Maffei et al. 2014) 24

24 Funzione del motore molecolare miosinico isolato dal contesto sarcomerico Tecnica di studio della motilità in vitro 25

25 In vitro motility assay (IVMA) o saggio di motilità in vitro (Kron and Spudich 1986) 26

26 IVMA Preparazione e purificazione delle proteine contrattili (actina e miosina) Marcatura dei filamenti di actina con una molecola fluorescente (rodamina-falloidina) Assemblaggio delle proteine nella camera di flusso (flow cell) Esperimento: Filamenti di actina legati in rigor alle molecole di miosina Aggiunta di ATP e movimento dei filamenti di actina 27

27 1 miosina 2 BSA 3 actina fluorescente 4 BSA 5 ATP 28

28 29

29 IVMA Parametri determinati: Velocità con la quale i filamenti di actina vengono traslocati dalle molecole di miosina ( m/sec) a ph = 7.2, 25 C e 50mM di forza ionica Effetto sulla velocità della variazione di ph, forza ionica e temperatura 30

30 actin sliding velocity ( /s) 1.5 actin sliding velocity (Vf) MHC-1 MHC-2A MHC-2X MHC 31

31 Vf ( m/s) Vf ( m/s) Vf ( m/s) L invecchiamento agisce direttamente sulla molecola miosinica modificando la velocità di scorrimento dei filamenti di actina Vf MHC-1 YO 1 EL Vf MHC-2A YO 2A EL 2A 2 1 Vf MHC-2X YO 2X EL 2X YO 1 EL YO 2A EL 2A 0 YO 2X EL 2X 32

32 Perché le isoforme della miosina sono diverse? 33

33 Meccanismo della contrazione muscolare: ciclo di interazione acto-miosinico Velocità = spazio / tempo Velocità = ampiezza del passo della miosina (δ) /durata della fase di interazione acto-miosinica (t on ) 34

34 Studio della durata della fase di attacco acto-miosinico (t on ) e dello step size (δ) Studio dell interazione acto-miosinica elementare a livello di singola molecola trappole ottiche 35

35 Tecnica della trappola ottica con tre beads (Finer et al 1994) 36

36 Tecnica della trappola ottica Preparazione di vetrini con glass-beads (diametro 2.5μm) Preparazione e purificazione delle proteine contrattili Attivazione delle polystirene beads fluorescenti con neutravidina (diametro 1μm) e attacco della biotina alla actina fluorescente Attacco delle beads all actina fluorescente e creazione del dumbell Interazione acto-miosinica 37

37 Attacco delle beads all actina fluorescente e creazione del dumbell 38

38 Tecnica della trappola ottica Parametri determinati: Spostamento di un singolo filamento di actina da parte di una singola molecola di miosina (nm) (δ) Durata del ciclo di interazione (msec) (t on ) Velocità di interazione actomiosinica (V = δ / t on ) 39

39 Tecnica della trappola ottica Evento = riduzione del rumore (30-40%) Posizione di equilibrio 40

40 Tecnica della trappola ottica passo elementare = step size = δ = spostamento del filamento di actina dovuto ad una singola interazione acto-miosinica t on = durata dell evento contrattile 41

41 Tecnica della trappola ottica con tre beads (Finer et al 1994) 42

42 Isoforme della miosina Vf ( m/sec) S 1 rat type 1 ~0.312 S 1 mouse type 2B ~2.011 Forza ionica= 50mM T = 25 C [MgATP] = da 1 a 20 M 43

43 step size (nm) Step size = δ B 1 myosin 44

44 ton (ms) Durata dell interazione = t on B 1 myosin 45

45 The large differences amomg members of the myosin family appears to be due to the differences in the duration of acto-myosin interaction cycle and not to the amplitude of the working stroke In particular the rate of ADP release defines the duration of acto-myosin cycle M.Capitanio, M.Canepari et al., PNAS,

46 47

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