motori molecolari piano della lezione tipi di movimento: intracellulari tipi di movimento: esseri viventi tipi di movimento: intracellulari

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1 piano della lezione motori molecolari tipi di movimenti di corpi, di cellule, di parti di cellule, di particelle/vescicole nelle cellule citoscheletro e movimenti intracellulari movimento di corpi o parti di corpi il motore piú noto: la miosina del muscolo scheletrico miosina e movimenti cellulari e sub-cellulari sono necessari altri motori dineina e chinesina movimento degli spermatozoi e trasporto di vescicole analogie e differenze tra motori famiglie di motori funzioni biologiche dei nuovi motori tecniche di studio dei motori a livello molecolare movimenti senza motori polimerizzazione dell actina e dei microtubuli (?) 1 2 tipi di movimento: esseri viventi tipi di movimento: intracellulari 019_WOMN.AVI 051_HUMM.AVI 3 4 tipi di movimento: intracellulari movimenti e motori e ormai chiaro che tutti i movimenti che avete visto sono resi possibili dall esistenza di proteine motorie difficolta di diffusione di molecole all interno delle cellule alta concentrazione di proteine (200 mg/ml) proteine organizzate in strutture retiformi citoscheletro molte particelle citoplasmatiche e vescicole sono troppo grandi per diffondere (30-50 nm) la diffusione e casuale, il trasporto intracellulare e indirizzato e regolabile 5 6

2 citoscheletro: filamenti citoscheletro tre tipi di filamenti: microfilamenti microfilamenti filamenti intermedi actina rete di binari su cui si muovono vescicole e particelle diametro 6 nm filamenti intermedi cheratina, vimentina (desmina, proteina acida della glia), proteine dei neurofilamenti nei neuroni, laminina, microtubuli diametro ~10 nm microtubuli tubulina diametro 25 nm sono tutti orientati estremita + e estremita citoscheletro: struttura dei filamenti microfilamenti actina citoscheletro: struttura dei filamenti microtubuli 9 10 citoscheletro: struttura dei filamenti filamenti intermedi il citoscheletro e collegato alla matrice extracellulare da proteine che formano un impalcatura per la membrana della fibra 11 12

3 microfilamenti (actina) filamenti intermedi microtubuli (tubulina) conferiscono forma alla cellula definiscono le proprieta meccaniche della cellula formano una rete di proteine orientate permettono di orientare il movimento delle particelle e vescicole citoscheletro: ruolo movimento di corpi o parti del corpo miosina (del muscolo striato) quali motori? miosina miosina: struttura scoperta nel 1943 l ATP separa due proteine dalla miosina di Kuhne (1864) l actina dalla miosina la miosina lavora in associazione con molte altre molecole identiche papain trypsin 15 esamero 2 catene pesanti 220 kd 4 catene leggere ~ 20 kd 16 miosina: struttura S1 miosina: struttura ed organizzazione nel sarcomero 17 18

4 interazione actina-miosina: meccanismo molecolare della contrazione miosina: accoppiamento chemo-meccanico myosin[1].mpeg crossbridge_cycle_right.mov miosina e motilita cellulare e intracellulare sono necessari altri motori? la miosina scheletrica puó sostenere i movimenti intracellulari? per poter funzionare per spostare particelle o vescicole la miosina deve: poter funzionare fuori dal sarcomero si puo verificare con in vitro motility assays funziona anche isolata interagire con filamenti di actina non puo funzionare sui microtubuli essere processiva cioe poter rimanere attaccata al filamento durante il movimento cioe camminare sul filamento la miosina del musoclo striato non puo farlo studio della miosina isolata: in vitro motility assays in vitro motility assay InVitroanim.avi TAS seq mpeg 23 24

5 la miosina non e processiva miosina: accoppiamento chemo-meccanico dobbiamo cercare dei motori che si legano ai microtubuli sono processivi cyclemovie.avi myosin[1].mpeg e possibile studiare l attivita di una singola molecola di mioisna la miosina sta attaccata al filamento sottile un tempo breve LaserTrapanim.avi quali altri motori? quali altri motori? dineina chinesina dineina dopo la miosina e la prima proteine motoria scoperta scoperta negli spermatozoi nel 1960 movimento dei microtubuli in un saggio di motilita in vitro la meno conosciuta per molto tempo esistenza definitivamente accertata nel 1987 lega la tubulina, non l actina prima funzione biologica ipotizzata: muove microtubuli gli uni rispetto agli altri 29 30

6 dineina: struttura dineina e vescicole cilium formata da 7 catene alto peso molecolare catene pesanti: 530 kd quali altri motori? chinesina scoperta negli assoni giganti di calamaro nel 1985 lega la tubulina, non l actina fin dall inizio implicata nel trasporto di vescicole lungo i microtubuli processiva tetramero due catene pesanti: 120 kd l una due catene leggere: 64 kd l una chinesina quali altri motori? chinesina: struttura chinesina: accoppiamento chemo-meccanico kinesin[1].mpeg 35 36

7 funzioni biologiche dei tre motori anni 80 miosina non processiva sviluppo di forza ed accrociamento muscolo scheletrico, cardiaco e liscio dineina processiva trasporto di vescicole lungo microtubuli verso la terminazione negativa (-) nei neuroni, nei flagelli e cilia, verso il corpo chinesina processiva trasporto di vescicole lungo microtubuli verso la terminazione positiva (+) nei neuroni, nei flagelli e cilia, verso la periferia miosina scheletrica trasporto nei flagelli analogie e differenze tra i motori miosina dineina chinesina quali analogie tra miosina, (dineina) e chinesina quali analogie tra miosina, dineina e chinesina sono tutte formate da: porzione motoria (motor domain) cioe la porzione che contiene il motore molecolare vero e proprio scinde ATP, e una ATPasi cambia di conformazione durante l attivita in modo strettamente connesso all idrolisi dell ATP lega la proteina dei filamenti (actina o tubulina) globulare braccio di leva (lever arm) trasmette il cambiamento conformazionale alla rimanente porzione della molecola e lo amplifica lega le catene leggere o le molecole di calmodulina coda (tail region) lunghezza molto variabile determina il tipo di assemblaggio delle molecole (miosina) o il legame con il cargo KINESIN MYOSIN 41 tutte funzionano creando dei ponti (cross-bridges) con un altra proteina che si puo ritenere non modifichi la propria conformazione durante l attivita in tutte i ponti ciclano tra uno stato attaccato in cui si ha un cambiamento conformazionale che determina lo sviluppo di forza e di spostameto uno stato staccato in cui il cambiamento conformazionale si inverte e la molecola ritorna allo stato iniziale cyclemovie.avi 42

8 ciclo chemo-meccanico della miosina e chinesina famiglie di motori e nuove funzioni dei motori miosinici e non myosin[1].mpeg kinesin[1].mpeg la struttura del motore non e molto diversa l accoppiamento chemomeccanico sembra essere diverso myosin superfamily kinesin superfamily dinein superfamily dalla meta degli anni 80 in poi definizione della struttura atomica della miosina e della chinesina definizione del possibile/probabile meccanismo molecolare alla base dell attivita motoria scoperta dell esistenza di centinaia di motori analoghi a miosina, dineina, chinesina famiglie di motori sviluppo di tecniche per lo studio dei motori molecolari a livello della singola molecola famiglie di motori oggi si parla di motori molecolari si conoscono centinaia di motori molecolari suddivisi in tre famiglie le funzioni dei tre motori originari si sono estese moltissimo grande progresso dello studio dei motori molecolari sequenze aminoacidiche delle proteine derivate dal genoma o dall analisi degli mrna scoperta della struttura atomica della miosina e della chinesina tecniche di studio delle proteine isolate famiglie di motori myosin superfamily: 147 miosine le tre proteine motorie scoperte per prime hanno dato origine a tre famiglie di proteine motorie myosin superfamily kinesin superfamily dynein superfamily le famiglie sono create sulla base di somiglianze nelle sequenze aminoacidiche dei motori essendo note le strutture atomiche di miosina e chinesina si possono ricostruire le probabili strutture degli altri motori 47 48

9 allineamento miosine kinesin superfamily cosa si conosce di tutti questi motori? la sequenza aminoacidica spesso alla base dell identificazione permette di esprimere la proteina in vitro permette di generare anticorpi contro la proteina la probabile struttura derivata per analogia dalle strutture della miosina e chinesina per alcuni il meccanismo molecolare del funzionamento del motore ci sono tecniche che permettono di studiare la funzione di una sola molecola per alcuni la localizzazione uso di anticorpi spesso poco sulla funzione nelle cellule molte congetture, le conoscenze stanno crescendo vertiginosamente kinesin and dinein superfamilies funzioni biologiche trasporti lunghi perche cosí tanti motori? servono tutti? ogni vescicola il suo motore? regolazione indipendente dei traffici? chi riporta i motori indietro? miosine non muscolari o non convenzionali : funzioni biologiche miosina V This "pot pourri" of potential myosin functions depicted in a virtual hybrid cell was taken from Mermall et al., 1998, Science, 279:

10 motor domains due miosina V: com e fatta? lever arm lungo lega sei molecole di calmodulina regione ad alfa elica estremita C terminale due porzioni globulari determinano probabilmente localizzazione nella cellula specificita per il cargo passi lunghi 36 nm miosina V: come funziona? direzione del movimento come tutte le miosine, eccetto la VI, si muove verso l estremita positiva del filamento di actina processiva una testa resta sempre legata all actina come la chinesina al microtubulo miosina V: come funziona? miosina V: a cosa serve? passeggero su organelli che si muovono sia su microtubuli che su filamenti di actina muove vescicole sinaptiche muove porzioni del reticolo sarcoplasmatico nei neuroni muove i granuli pigmentati dei melanociti ha un ruolo nella estensione degli pseudopodi mutazioni whole-stack.avi 57 nel ratto nell uomo sindrome di Griscelli 58 miosina VI: com e fatta? miosina VI motor domains due lever arm breve una sola subunita calmodulina simile coda ad alfa elica estremita C terminale due formazioni globulari determinano probabilmente localizzazione nella cellula specificita per il cargo si muove in senso opposto alle altre miosine verso la estremita negativa del filamento di actina 59 60

11 miosina VI: dove si trova e cosa fa? miosina VI: dove si trova e cosa fa? trasporto di vescicole dai microtubuli alla membrana fenomeni di endocitosi si associa chiaramente ai clathrin coated pits nelle cellule ciliate dell organo del Corti ancora e stabilizza le stereocilia trasporto di vescicole fenomeni di endocitosi si associa chiaramente ai clathrin coated pits nelle cellule ciliate dell organo del Corti ancora e stabilizza le stereocilia miosina I motor domain uno lever arm molto breve manca della coda ad alfa elica ha un estremita globulare miosina I: com e fatta? miosina I: a cosa serve? miosina I: udito 65 66

12 miosina I: udito miosina I: udito actin filaments ion channels miosina I: udito miosina: udito Positive adaptation.new.avi tecniche di analisi motori molecolari in vitro motility assays + microneedle studio singole molecole microneedleanim.avi 71 72

13 optical trap o optical tweezers total internal reflectance fluorescence microscopy (TIRFM) and molecular motors Trap.avi LaserTrapanim.avi TIRFManim.avi chinesina e melanosomi altri motori oltre alle tre famiglie: miosina, chinesina, dineina? polimerizzaizone dell actina polimerizzazione di microtubuli (?) melanosome.mpeg altri motori? polimerizzazione dell actina in virus e batteri polimerizzazione dell actina protrusione di pseudopodi 77 78