IL CITOSCHELETRO. Il citoscheletro è costituito da una fitta rete tridimensionale di filamenti proteici che attraversano il citoplasma

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2 Il citoscheletro 2

3 IL CITOSCHELETRO Il citoscheletro è costituito da una fitta rete tridimensionale di filamenti proteici che attraversano il citoplasma FUNZIONI sostegno meccanico per la cellula mantenimento e modificazioni della forma cellulare adesione cellula-cellula e cellula-matrice movimento della cellula nell ambiente movimenti intracellulari: localizzazione e movimento degli organuli cellulari Coomassie blu 3

4 IL CITOSCHELETRO COMPONENTI DEL CITOSCHELETRO Filamento Diametro Medio Componente proteico principale Caratteristiche funzionali generali Microtubuli 25 nm Tubulina Strutture Dinamiche Microfilamenti Filamenti sottili Filamenti Intermedi 6 nm Actina Strutture Dinamiche 10 nm Variabile Strutture Statiche Ciascun tipo di filamento ha proprietà meccaniche e funzioni distinte nella cellula 4

5 Microtubuli e Microfilamenti sono strutture dinamiche IL CITOSCHELETRO Si assemblano e disassemblano a partire da subunità proteiche globulari attraverso la formazione di legami non covalenti VANTAGGIO Assemblaggio e disassemblaggio avvengono in base alle necessità della cellula Es. fuso mitotico 5

6 CITOSCHELETRO: LOCALIZZAZIONE GENERALE DEI SUOI COMPONENTI Microtubuli Filamenti intermedi Microfilamenti Ciascun tipo di filamento tende a distribuirsi nello spazio in modo diverso nelle cellule 6

7 Microtubuli Microfilamenti Filamenti intermedi 7

8 IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI PM 110 kda Tubuli cavi parete 7nm 25 nm 13 protofilamenti Gli eterodimeri sono disposti ordinatamente testa-coda αß-αß-αß-αßi MT sono POLARIZZATI: presentano due estremità chimicamente e funzionalmente distinte, importanti per le funzioni del MT 8

9 IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI Microtubuli evidenziati in microscopia elettronica 9

10 IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI I microtubuli ( e i microfilamenti) sono strutture labili Sono polimerizzati da una riserva di subunità αß- e depolimerizzati Nella immagine microtubuli assemblati in vitro a partire da MT già formati (porzione segnalata in verde) Termina con ß La polarità rende le due estremità dei filamenti diverse, con effetto sulla velocità di pol (Vp) L estremità più si allunga e si accorcia più rapidamente Termina con α 10

11 IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI POLIMERIZZAZIONE dei FILAMENTI Esperimento In vitro NUCLEAZIONE La fase di equilibrio si ottiene ad una concentrazione critica di monomeri La quantità di monomeri aggiunta equivale a quella che si dissocia 11

12 IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI POLIMERIZZAZIONE dei FILAMENTI allungamento o accorciamento? Ruolo del GTP nella dinamicità Ai dimeri αß- liberi nel citoplasma è legato GTP Il GTP associato alla subunità beta si idrolizza in GDP quando il dimero è aggiunto al filamento In un microtubulo, le nuove subunità aggiunte contengono GTP (cappuccio di GTP), perché non è ancora avvenuta l idrolisi Le vecchie subunità presentano GDP 12

13 IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI POLIMERIZZAZIONE dei FILAMENTI allungamento o accorciamento? Ruolo del GTP nella dinamicità IDROLISI GTP Quando la subunità si Lega, il GTP è idrolizzato e il filamento si incurva e si destabilizza Regione instabile GDP Regione stabile GTP Quale è la conseguenza? 13

14 POLIMERIZZAZIONE dei MT allungamento o accorciamento? Ruolo del GTP nella dinamicità Il plus end è interessato dal fenomeno di instabilità dinamica Tante subunità (elevata concentrazione): l aggiunta di subunità con GTP procede più velocemente della reazione di idrolisi del GTP Permane il cappuccio di GTP che stabilizza l estremità più del MT che polimerizza e cresce Poche subunità (bassa concentrazione): l aggiunta di subunità procede più lentamente della reazione di idrolisi del GTP a GDP con destabilizzazione e depolimerizzazione 14

15 POLIMERIZZAZIONE dei FILAMENTI allungamento o accorciamento? Ruolo del GTP Per certe concentrazioni (concentrazione intermedia) il Mt polimerizza alla estremità più e depolimerizza alla estremità meno, restando di lunghezza invariata Le subunità si spostano da + a - treadmilling Cosa regola l allungamento, l accorciamento e la lunghezza dei filamenti? La concentrazione delle subunità La idrolisi del GTP nelle subunità Queste variazioni possono consentire variazioni della organizzazione dei MT nella cellula e lo svolgimento dei loro compiti meccanici ai MT 15

16 tripletta MT IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI Assemblaggio dei MT (processo iniziale di polimerizzazione) inizia nei Centri di organizzazione microtubulare (MTOC) (centrosoma) I MTOC sono regioni specializzate poste in prossimità del nucleo IL MTOC comprende una coppia di centrioli, circondati da materiale proteico pericentriolare centriolo 9 triplette Dal MTOC i MT si irradiano fino alla 16 periferia della cellula

17 IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI Nel materiale pericentriolare la γ-tubulina si associa ad altre proteine formando dei complessi ad anello I complessi ad anello sono essenziali per l inizio della polimerizzazione dei MT per aggiunta delle subunità MTOC:γ-tubulina 17

18 MTOC in microscopia elettronica Centriolo Microtubuli neoformati Centrioli 18

19 IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI LOCALIZZAZIONE dei MT Cellula in interfase I MT nella cellula si distribuiscono: centrosoma Cellula in mitosi - concentrati attorno al nucleo dal quale si irradiano - organizzati a formare strutture transitorie: Fuso mitotico durante la divisione cellulare Fuso mitotico Cellula con ciglia ciglia -organizzati in strutture stabili: ciglia e flagelli di alcune cellule specializzate 19

20 Microtubuli IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI Microtubuli citoplasmatici nelle cellule in interfase FUNZIONI - Impalcatura di sostegno per la cellula Microtubuli di una cellula in interfase evidenziati mediante IIF -Posizionamento e movimento di organuli rivestiti da membrana (es. Golgi, vescicole secretorie) 20

21 IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI La organizzazione e le funzioni dei microtubuli dipendono dalla associazione con proteine dette: MAP (microtubuleassociated protein) Esistono diversi tipi di MAP: - MAP che stabilizzano i microtubuli e regolano la loro organizzazione spaziale, associandosi alle subunità di tubulina - MAP, motori microtubulari che interagendo con i microtubuli generano movimenti di organuli 21

22 IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI -MAP che favoriscono la polimerizzazione, stabilizzano e coordinano l organizzazione dei microtubuli nel citoplasma Le MAP2 hanno un dominio sporgente lungo Le tau, MAP con un dominio sporgente corto In assone di neuroni neuroni con MAP2 formano fasci di MT stabili tenuti lontani tra loro neuroni con TAU formano fasci di MT molto compatti 22

23 IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI MAP: MOTORI MICROTUBULARI - hanno un sito di attacco per il MT e per la membrana di un organulo -si muovono in modo unidirezionale, trasportando l organulo lungo il MT - hanno attività ATPasica (il movimento richiede ATP) CHINESINA organulo organulo DINEINA Nota l importanza dell orientamento del MT 23

24 Chinesine e Dineine passeggiano sui microtubuli 24

25 MICROTUBULI e motori microtubulari I microtubuli e i motori microtubulari sono necessari al posizionamento corretto degli organuli nel citoplasma MICROTUBULI INTEGRI L apparato del Golgi (VERDE) è normalmente in posizione perinucleare MICROTUBULI DEPOLIMERIZZATI (agenti farmacologici) l apparato del Golgi si disperde nel citoplasma 25

26 MICROTUBULI e motori microtubulari I microtubuli e i motori microtubulari sono necessari al posizionamento di apparato del Golgi e reticolo endoplasmatico + l apparato di Golgi viene tirato dalle dineine verso il centro della cellula - il reticolo endoplasmatico viene tirato verso la periferia della cellula da chinesine 26

27 MICROTUBULI e motori microtubulari I MT e i motori microtubulari sono concentrati nelle cellule nervose. Nell assone sono distribuiti con lo stesso orientamento e garantiscono il trasporto di vescicole e organuli (vescicole secretorie, mitocondri) tra le diverse parti della cellula: trasporto assonico Alterazioni nel trasporto assonico sono associate a patologie nuerodegenerative: Alzheimer 27

28 IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI: fuso mitotico I Microtubuli costituiscono il fuso mitotico (ME) durante la divisione cellulare 28

29 I Microtubuli costituiscono il fuso mitotico (IIF) Esistono molecole che interagiscono con i componenti del fuso: - Colchicina (da una pianta: croco) lega la tubulina libera e ne impedisce la polimerizzazione -Taxolo (da un pianta: tasso) stabilizza i MT Queste molecole bloccano la mitosi! - La funzione del fuso mitotico è mantenuta se i MT possono polimerizzare e depolimerizzare -Tali molecole sono utilizzate in ambito clinico: composti chemioterapici 29

30 IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI in strutture stabili della cellula: Ciglia e Flagelli I MT presentano una organizzazione specifica in ciglia e flagelli e sono responsabili del loro movimento Ciglia e flagelli sono espansioni mobili di alcuni tipi cellulari (cellule 30 epiteliali, spermatozoo)

31 Microtubuli Microfilamenti Filamenti intermedi 31

32 IL CITOSCHELETRO MICROFILAMENTI La G actina ha una polarità (estremità + e -) mantenuta nell assemblaggio I microfilamenti (MF) sono polarizzati come i MT Microfilamenti 6 nm G-actina PM 42 kda F-actina 32

33 IL CITOSCHELETRO MICROFILAMENTI Localizzazione:presenti in tutte le cellule e, in misura maggiore, nelle cellule contrattili. FUNZIONI - Formano una rete di supporto per il mantenimento e modificazioni della forma cellulare, in particolare della superficie cellulare -Intervengono nella adesione al substrato (matrice extracellulare) e movimento cellulare -Intervengono nelle attività contrattili delle cellule - Forniscono supporto e rigidità a strutture fisse di alcuni tipi cellulari (microvilli e stereociglia) 33

34 IL CITOSCHELETRO MICROFILAMENTI La polimerizzazione, la organizzazione e le funzioni dei microfilamenti dipendono anche dalla associazione con altre proteine: Proteine che regolano la polimerizzazione Proteine che regolano la loro organizzazione reciproca Proteine che regolano le funzioni Proteine Arp favoriscono la polimerizzazione Monomeri di actina Proteine che sequestrano i monomeri Timosina e profilina e regolano la polimerizzazione Gelsolina Frammentazione Cofilina Depolimerizzazione filamenti di actina Proteine cappuccio che bloccano la 34 polimerizzazione

35 IL CITOSCHELETRO MICROFILAMENTI Proteine che regolano la polimerizzazione La formazione dei filamenti di actina è indotta dalle Proteine ARP (2 e 3) Il complesso ARP2/3: 1) facilita la formazione dei primi aggregati di actina (nucleazione) alla estremità meno favorendo allungamento da meno a più 2) Può legare i filamenti di actina favorendo la formazione di una rete La attività di ARP è spesso regolata da segnali extracellulari 35

36 IL CITOSCHELETRO MICROFILAMENTI Proteine che regolano la polimerizzazione Timosina lega actina e blocca la crescita Profilina lega actina e favorisce la crescita Gelsolina lega actina e favorisce la frammentaione 36

37 IL CITOSCHELETRO MICROFILAMENTI Proteine che regolano la loro organizzazione reciproca Proteine che formano reti: Filamina filamenti di actina proteine che formano fasci: alpha actinina Fimbrina 37

38 IL CITOSCHELETRO MICROFILAMENTI I microfilamenti forniscono sostegno per strutture stabili di alcuni tipi cellulari specializzati: i microvilli proteine che formano fasci: Fimbrina Alla base i MF sono stabilizzati ancorandosi a una fitta rete di actina 38 e filamenti intermedi

39 IL CITOSCHELETRO MICROFILAMENTI Proteine che regolano le funzioni Come per i MT, proteine motrici si associano ai microfilamenti per generare movimento: miosina Miosina I 1 testa e 1 coda Questa interazione determina spostamenti di vescicole e modificazioni della membrana Miosina II 2 teste e 1 coda Questa interazione determina attività contrattili Miosina I vescicola Miosina II 39

40 Esempi di contrattilità associati ai microfilamenti L anello contrattile che consente la separazione delle due cellule figlie in mitosi consiste di microfilamenti di actina e miosina actina miosina Comprenderemo l interazione actina-miosina nei dettagli trattando del 40 Tessuto Muscolare

41 IL CITOSCHELETRO MICROFILAMENTI Nella cellula in interfase i MF formano una fitta rete sotto la membrana: impalcatura di sostegno meccanico alla superficie cellulare I MF in prossimità della superficie intervengono inoltre nel consentire: - modificazioni della forma es. tramite una organizzazione in espansioni cellulari dette pseudopodi: filopodi (forma filiforme) lamellipodi (forma laminare) lobopodi (forma globosa) - adesione al substrato (contatti focali) 41

42 IL CITOSCHELETRO MICROFILAMENTI- Modello di aggregazione e disaggregazione dei filamenti di actina nella formazione di pseudopodio Testo 4.4 La profilina favorisce la nuova polimerizzazione vecchi 42

43 IL CITOSCHELETRO MICROFILAMENTI Nei contatti focali (aree di adesione estese tra cellula e matrice): -i MF si concentrano formando fasci I contatti focali consentono alle cellule di: - aderire alla matrice extracellulare - esercitare trazione su matrice extracellulare - ricevere segnali dalla matrice che ne regolano il comportamento - originare movimento cellulare (ameboide) 43

44 IL CITOSCHELETRO MICROFILAMENTI Fibre stress La miosina interagisce con i microfilamenti nelle fibre da stress: fasci di actina che hanno attività contrattile Actina-miosina contatti focali La miosina II genera forze contrattili fra i filamenti di actina che si ancorano alla membrana nei contatti focali 44 Walcott S, Sun S X PNAS 2010;107:

45 MICROFILAMENTI MOVIMENTO AMEBOIDE 1. protrusione: la cellula emette espansioni in avanti, tramite polimerizzazione di filamenti di actina 3.Trazione. La porzione posteriore della cellula si contrae e la cellula è tirata in avanti Interazioni ACTINA- MIOSINA II 2.Adesione la cellula aderisce al substrato nei contatti focali 3.Trazione in avanti del citoplasma tramite interazione actinamiosina 45 II

46 Nei contatti focali i MF si concentrano formando FIBRE da STRESS MICROFILAMENTI In espansioni cellulari possono fare fasci stretti 46 Fibre da stress e filopodi

47 Fibroblasto in movimento ameboide osservato al microscopio a scansione. Tale movimento è caratteristico di diverse cellule: fibroblasti, cellule embrionali, macrofagi, leucociti. lamellipodi 47

48 Microtubuli Microfilamenti Filamenti intermedi Filamenti intermedi 48

49 IL CITOSCHELETRO FILAMENTI INTERMEDI CLASSE ETEROGENEA in base alle proteine costitutive GRUPPI PRINCIPALI di filamenti intermedi Proteine costitutive Cheratine Distribuzione Epiteli e derivati Vimentina Desmina GFAP Periferina Proteine dei Neurofilamenti (NF-L, NF-H, NF-M) Lamine nucleari (A,B,C) Cellule mesenchimali Cellule muscolari Astrociti Neuroni SNP Neuroni Involucro nucleare IIC ed IIF Consentono la identificazione di tipi cellulari differenziati 49

50 IL CITOSCHELETRO FILAMENTI INTERMEDI -Organizzazione generale comune -Strutture filamentose stabili formate da subunità proteiche lineari I dimeri hanno direzione opposta NO polarità! Funzione: conferire resistenza a stress meccanici da stiramento I tetrameri si uniscono in lunghi fili affiancati simili a corde Concentrati in alcune cellule: -cellule epiteliali -cellule nervose 50

51 IL CITOSCHELETRO FILAMENTI INTERMEDI Il ruolo dei tonofilamenti nel conferire resistenza meccanica è chiaramente visibile in questa immagine Stiramento di cellule con filamenti intermedi Stiramento di cellule prive di filamenti intermedi Lo strato cellulare rimane integro Rottura delle adesioni cellulari 51

52 FILAMENTI INTERMEDI: neurofilamenti I neurofilamenti si concentrano negli assoni dei neuroni fornendo resistenza alla tensione I neurofilamenti sono caratterizzati da protrusioni: legami laterali che aumentano la resistenza a tensione Sclerosi laterale amiotrofica (SLA) (cause sconosciute). I NF si accumulano,con alterazione del trasporto assonale e progressiva atrofia muscolare 52

53 FILAMENTI INTERMEDI di lamina I filamenti intermedi formano una fitta rete al di sotto dell involucro nucleare: Lamina nucleare Lamina nucleare si digrega e si riforma durante la divisione cellulare Lamna nucleare al microscopio elettronico 53

54 IL CITOSCHELETRO nelle giunzioni cellulari I componenti del citoscheletro interagiscono con i sistemi di giunzione cellulare (tra cellula e cellula) Lezione degli epiteli 54