UNIVERSITA degli STUDI di BARI
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- Sofia Rinaldi
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1 UNIVERSITA degli STUDI di BARI DPARTIMENTO FARMACO-BIOLOGICO SEZIONE DI FARMACOLOGIA Facoltà di FARMACIA CORSO DI DIDATTICA LIBERA IN: FARMACOLOGIA PRECLINICA:TECNICHE ED ANALISI PER LA SPERIMENTAZIONE DEI FARMACI BARI, 20 novembre 2012 Prof.ssa Diana Conte Dr.ssa Roberta Capogrosso
2 ESPERIMENTI SU ORGANI ISOLATI Tecniche che sfruttano l impiego di tessuti prelevati (organi isolati) rivestono una notevole importanza: - Dati soddisfacenti in tempi relativamente brevi - Valutazioni di parametri funzionali QUALITA DEI DATI: STATO DI FUNZIONALITA CONSERVAZIONE DEL TESSUTO ISOLATO
3 PARTICOLARE ATTENZIONE A : MODALITA DI PRELIEVO DEL TESSUTO COMPOSIZIONE DELLE SOLUZIONI FISIOLOGICHE IN CUI I PREPARATI VENGONO MANTENUTI PER L INTERA DURATA DELL ESPERIMENTO MANTENERE INTEGRA LA LORO FUNZIONALITA DEVONO ESSERE OSSIGENATI (ossigeno puro, o miscela di 95% O 2 e 5% CO 2 o in altri casi semplicemente aria) E MANTENUTI AD UNA TEMPERATURA FISIOLOGICA
4 IL TESSUTO, UNA VOLTA ISOLATO: TRASFERITO IN BAGNI PER ORGANI ISOLATI della CAPACITA : ml UN ESTREMITA DEL TESSUTO VIENE POI FISSATA ALL INTERNO DEL BAGNO E L ALTRA ESTREMITA AD UN TRASDUTTORE CHE CONSENTE DI REGISTRARE LE VARIAZIONI DI TENSIONE
5 APPLICAZIONI FARMACOLOGICHE PREPARATI ISOLATI MUSCOLO SCHELETRICO
6 MUSCOLO Unità contrattile
7 MUSCOLO SCHELETRICO
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9 ESPERIMENTI DI CONTRAZIONE ISOMETRICA SU ORGANO ISOLATO
10 MUSCOLI ESAMINATI SOLEO muscolo a fibre lente EDL muscolo a fibre veloci DIAFRAMMA muscolo a fibre lenti/veloci
11 ALLESTIMENTO CAMPIONI Prelievo muscolo/organo Vengono ricreate le condizioni fisiologiche: -Miscela 95% O 2 e 5% CO 2 (ph: ) - Soluzione di Ringer normale (RN) con composizione: NaCl 148mM; KCl 4,5mM; CaCl2 2,0mM; MgCl2 1,0mM; NaHCO3 12,0mM; NaH2PO4 0,44mM e Glucosio 5,5 mm Il campione viene fissato opportunamente mediante filo di sutura e poi inserito nella camera di registrazione Il muscolo viene poi tirato da un trasduttore alla lunghezza per cui il muscolo sviluppa la massima forza di contrazione
12 SOLUZIONE DI RINGER NORMALE (RN) I SALI ESSENZIALI O MEGLIO I LORO IONI, DEVONO ESSERE SEMPRE PRESENTI Le grosse variazioni degli ioni essenziali fanno sentire la loro influenza sulla reattività dell organo Na + : quando il tasso di Na + è molto basso nelle cellule non entra più Na + a sufficienza durante il potenziale d azione ed il preparato diventa meno eccitabile K + : l alta concentrazione di K + rende i preparati miocellulari più eccitabili Ca 2+: un aumento del Ca 2+ aumenta la contrazione dei preparati muscolari Mg 2+: riduce l eccitabilità del sistema nervoso vegetativo, perciò si abbassa il tasso di Mg 2+ quando si vogliono aumentare i movimenti autonomi generati dai neuroni periferici Cl - : una sua diminuzione depolarizza la membrana cellulare e facilita l insorgenza di stimoli autogeni NaHPO 4 e NaHCO 3 :fungono da correttivi intervengono sulla regolazione del ph
13 Importanza del ph: Ionizzazione dei Sali nel RN Ionizzazione del farmaco Reattività dell organo Temperatura: è utile al fine di mantenere sopravvivente un organo isolato
14 ORGANO ISOLATO STIMOLATORE CAMERA DI REGISTRAZIONE
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17 REGISTRAZIONE DI CONTRAZIONE ISOMETRICA Contrazione singola il muscolo è stimolato a 40V con impulsi di 0,2ms gptw TTP RT Parametri cinetici di contrazione: TTP (tempo di raggiungimento del picco di contrazione) e RT (tempo di rilassamento del muscolo) Forza di contrazione singola P tw sp tw = P tw /CSA CSA: m/d*lo* (Lf/Lo )
18 REGISTRAZIONE DI CONTRAZIONE ISOMETRICA Contrazione tetanica Il muscolo è stimolato con un treno di impulsi della durata di ms a diverse frequenze P o Channel g seconds Forza di contrazione tetanica P o (g) sp o (KN/ m 2 ) = P o /CSA CSA: m/d*lo* (Lf/Lo )
19 REGISTRAZIONE DI CONTRAZIONE ISOMETRICA Fatica muscolare Il muscolo è stimolato con un train di tetani a ~100/120 Hz per 5min Channel g
20 ESEMPIO DI CURVA FORZA-FREQUENZA: differenze tra fibre veloci e lente P/Po
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22 ESEMPI DI POSSIBILI BERSAGLI Canali al Na + Canali al Ca 2+ voltaggio dipendenti SERCA Canali al Cl - ESEMPI DI POSSIBILI FARMACI/ MODULATORI Anestetici locali Nifedipina Tapsigargina 9-antracene acido carbossilico Intervengono nel excitation-contraction coupling
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24 APPLICAZIONI FARMACOLOGICHE Incubazione del 9-antracene acido carbossilico (9AC) per 30min. inibisce specificatamente ClC Channel g seconds seconds RT: 2 sec RT: 80 msec
25 In patologie come DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE (DMD) Parametri Contrattili Alterati Dalla Patologia Migliorie Dovute Al Trattamento In Vivo Di Sostanze Testate Su Modelli Animali Valutare Differenze Muscolari In Condizioni Patologiche E Controllo MDX: modello animale della DMD
26 J Appl Physiol 106: , 2009 Multiple pathological events in exercised dystrophic mdx mice are targeted by pentoxifylline: outcome of a large array of in vivo and ex vivo tests Rosa Burdi, 1,* Jean-François Rolland, 1,* Bodvael Fraysse, 1 Karina Litvinova, 1 Anna Cozzoli, 1 Viviana Giannuzzi, 1 Antonella Liantonio, 1 Giulia Maria Camerino, 1 Valeriana Sblendorio, 1,2 Roberta Francesca Capogrosso, 1 Beniamino Palmieri, 2 Francesca Andreetta, 3 Paolo Confalonieri, 3 Leonarda De Benedictis, 4 Monica Montagnani, 4 and Annamaria De Luca 1 Non si osserva alcuna variazione dei parametri cinetici di contrazione
27 Contrazione singola il muscolo è stimolato a 40V con impulsi di 0,2ms. Contrazione tetanica Il muscolo è stimolato con impulsi della durata di ms a diverse frequenze
28 DIFFERENZE TRA CONDIZIONE PATOLOGICA E CONTROLLO
29 Contrazione eccentrica Le fibre distrofiche sono più suscettibili al danno da contrazione eccentrica
30 ORGANO ISOLATO IN UN AMPIO SCREENING DI FARMACI E POSSIBILE VALUTARE L EFFICACIA DI TRATTAMENTI IN VIVO E IN VITRO CHE POSSANO MODULARE E MIGLIORARE PARAMETRI FUNZIONALI CONTRATTILI NEL MUSCOLO SCHELETRICO, IN CONDIZIONE FISIOLOGICA E PATOLOGICA
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