DIPARTIMENTO DI FARMACIA-SCIENZE DEL FARMACO Sezione di Farmacologia RESEARCH DAY
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- Adolfo Bossi
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1 DIPARTIMENTO DI FARMACIA-SCIENZE DEL FARMACO Sezione di Farmacologia RESEARCH DAY RICERCA PRE-CLINICA DELLE DISTROFIE MUSCOLARI E DELLE MIOPATIE INFIAMMATORIE: CROSS-TALK TRA INFIAMMAZIONE ED ALTERAZIONI METABOLICHE E IDENTIFICAZIONE DI NUOVI TARGETS FARMACOLOGICI Bari Capogrosso Roberta Francesca Assegnista di ricerca
2 DISTROFIE MUSCOLARI Distrofia muscolare di Duchenne Miopatia ereditaria legata al cromosoma X 1/3500 bambini nati maschi vivi Progressiva degenerazione muscolare con severa debolezza e fatica Esordio tra 3-5 anni e perdita di deambulazione autonoma Morte intorno ai anni (compromissione cardio-respiratoria)
3 MECCANISMI PATOGENETICI Alterazione del complesso DGC (difetto genetico) Delocalizzazione dell nnos Instabilità meccanica del sarcolemma Ischemia funzionale indotta da contrazione Infiammazione cronica Danno sarcolemmale indotto dall attività contrattile Perossidazione della membrana indotta da ROS Citochine pro-infiammatorie (TNF-α, IL-1...) Citochine pro-fibrotiche (TGF-β, miostatina) Morte della miofibra, mancata rigenerazione e fibrosi
4 Ipotesi: La cronicizzazione dell infiammazione dipende dall alterata meccano-trasduzione delle miofibre mancanti di distrofina/dgc che innesca meccanismi di auto-rinforzo per i suoi effetti sul metabolismo e sul rimodellamento muscolare. Michele & Campbell, JBC 2003
5 Complesso cross-talk tra attività fisica ed infiammazione Handschin, 2009 Suscettibilità del topo mdx ed altri animali distrofici all esercizio Standard protocol: 4-18 week-old male mdx and wtmice 30 min running on horizontal treadmill at 12 m/min twice a week for 4-12 weeks (
6 Handschin, PAPS 2009 Il muscolo distrofico risponde all esercizio con un alterato adattamento metabolico? Questa alterazione metabolica è correlata all infiammazione cronica? Identificazione di nuovi bersagli farmacologici al fine di individuare nuove strategie terapeutiche Obiettivo
7 Batteria di test e approccio multidisciplinare Tempo di raccolta degli end-points: Tempo 0 (4-5 settimane di età, solo in vivo) Tempo 4 (8-9 settimane di età) Tempo 12 (16-17 settimane di età) In vivo metodiche comportamentali e fisiologia sistematica- Funzioni vitali, peso corporeo, forza degli arti anteriori, test di resistenza alla fatica. Ex vivo -diversi muscoli scheletrici e altri tessuti- Studi funzionali Contrazione isometrica ed eccentrica di singoli muscoli Microspettrofluorimetria con fura-2 per omeostasi del calcio Accoppiamento eccito-contrattile (elettrofisiologia mediante microelettrodi) Biochimica e Biologia Molecolare Spettrofotometria, ELISA, real-time PCR Istologia e Immunoistochimica
8 RISULTATI IN VIVO L esercizio riduce significativamente la forza delle zampe anteriori nel topo distrofico mdx, riduzione mantenuta fino alle 12 settimane
9 RISULTATI IN VIVO Test acuto di exhaustion: 5 min at 5 m/min e incrementi di 1m/min fino ad exhaustion Resistenza alla fatica Burdi et al., 2009 L esercizio peggiora significativamente la performance dei topi mdx, peggioramento mantenuto fino alle 12 settimane
10 RISULTATI EX VIVO Extensor digitorum longus Fatica in vitro L esercizio peggiora la fatica del muscolo EDL dei topi mdx L esercizio riduce l affaticamento del muscolo EDL dei topi wt
11 RISULTATI EX VIVO EDL contrazione eccentrica La mancanzadi adattamento, piùchedi un dannostrutturale, può sottolineare la maggior suscettibilità delle fibre distrofiche allo stretch meccanico Attualmente è in fase di valutazione l attività contrattile in vivo
12 ESERCIZIO FISICO ESPRESSIONE di GENI TARGET MUSCOLO SCHELETRICO METABOLISMO RIGENERAZIONE INFIAMMAZIONE
13 Espressione del PGC-1α e di altri geni sensibili all esercizio 12 settimane di esercizio PGC-1α Sirtuina 1 BNIP3 Viene ridotta significativamente nei topi mdx esercitati l espressione di geni di fattori protettivi Effetto dell esercizio sull espressione di geni markers di danno NOX2 (gp91 phox ) TGF-β TNF-α Viene aumentata significativamente nei topi mdx l espressione di geni di fattori protettivi
14 Nella Distrofia muscolare di Duchenne suscettibilità allo stress meccanico alterato adattamento metabolico Fattori di danno Fattori protettivi Effetto dell esercizio sui ROS muscolari Burdiet al, J ApplPhysiol2009
15 Targets ROS-sensibili I ROS possonomodulareilsignallingdi infiammazione edaccelerarela degradazionedel complesso DGC mediante attivazione di proteine red-ox sensibili Src-tirosin chinasi Okutani et al 2006 E aumentata significativamente nei topi mdx l espressione dell src-tirosin chinasi
16 Effetto del Prednisolone sull espressione dell SrcTK e PGC-1a PDN: 1 mg/kg i.p. per 4 settimane in parallelo con l esercizio PGC-1α + PDN ha indotto un up-regulazione dell utrofina
17 Effetto del Prednisolone sui distroglicani e altre proteine PDN: 1 mg/kg i.p. per 4settimane in parallelo con l esercizio Laminin Tamma et al., Laboratory Invest 2013
18 Conclusioni Alterato accoppiamento meccano-metabolico in miofibre mancanti di distrofina/dgc Difetto primario (alterata meccano-trasduzione)aumento di fattori di danno e diminuzione dei fattori protettivil infiammazione cronica ROS possono giocare un ruolo attivo nel cross talk tra infiammazione e alterato metabolismo nelle miofibre distrofiche Interesse di farmaci con azione anti-infiammatoria e che potenziano i pathways dei fattori protettivi
19 In fase di valutazione sperimentale: Farmaci che stimolano la via PGC-1α/SIRT-1 Farmaci che contrastano NADPHox Farmaci che contrastano SrcKinasi Farmaci che aumentano l espressione delle proteine del DGC (utrofina) Farmaci che migliorano l omeostasi del calcio (coinvolta nei difetti contrattili e nei processi infiammatori) Nelle distrofie muscolari Difetto primario suscettibilità meccanica infiammazione Polimiosite (miopatia idiopatica infiammatoria) Modello HT Infiammazione suscettibilità meccanica alterazione metabolica
20 Sez. di Farmacologia Anna Cozzoli Arcangela Giustino Antonella Liantonio Giulia Camerino Elena Conte Maria Cannone Ada Massari Paola Mantuano Claudia Capozzi Massimiliano Guidetti Milena Mariani Prof.ssa Diana Conte Camerino GRAZIE PER L ATTENZIONE Coordinatore Scientifico: Prof.ssa Annamaria De Luca Collaborazioni esterne Prof. Kannebojina Nagaraju Research Center for Genetic Medicine, Children's National Medical Center and Washington, USA. Prof. Miranda Grounds and Prof. Peter Arthur The University of Western Australia, Perth, Australia Prof. Kay Davies, MRC Functional Genomics Unit, Department of Physiology Anatomy and Genetics, University of Oxford, UK Prof. Robert Grange Department of Human Nutrition, Foods and Exercise, Virginia Polytechnic, USA Collaborazioni altri Dipartimenti Università di Bari Prof. Monica Montagnani Dip. Di Farmacologia e Fisiologia Umana, Sez. Di Farmacologia, Facoltà di Medicina, Università di Bari Prof. Beatrice Nico Dip. Di Anatomia Umana e Istologia, Facoltà di Medicina, Università di Bari
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