PROTEINE E TRASPORTO TRANSMEMBRANALE

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1 PROTEINE E TRASPORTO TRANSMEMBRANALE Il glucoso ed il galattoso, gli aminoacidi e gli ioni utilizzano apposite proteine per attraversare la MP. L'H 2 O può attraversare con difficoltà lo strato lipidico della MP, per cui utilizza anche proteine specifiche. Il passaggio dell'h 2 O avviene tramite osmosi (questo verrà trattato successivamente). Ciascuna cellula ha il suo kit di trasportatori, in funzione del compito cellulare. In generale, i trasporti vengono definiti uniporti, se un solo tipo di molecola attraversa la MP, simporti o cotrasporti, se due o più molecole attraversano la MP nella stessa direzione (tutte escono o tutte entrano), ed antiporti, o contro-trasporti, se due o più molecole attraversano la MP in direzioni opposte (alcune entrano nella cellula, altre escono) (Fig. 2.1). Le proteine trasportatrici sono dette in Inglese "carriers". Uniporto Simporto Antiporto Fig Vengono mostrati l'uniporto ed esempi di simporto ed antiporto. La madre di (quasi) tutti i trasporti La pompa Na + /K +, o Na + /K + ATPasi trasporta 3 Na + all'esterno della cellula e due K + all'interno. Entrambi i trasporti avvengono contro il potenziale elettrochimico: l'energia necessaria viene fornita dall'atp (si consuma 1 molecola di ATP per il trasporto dei 5 ioni). Il ciclo della Na + /K + ATPasi è descritto in Fig La Na + /K + ATPasi crea le differenze di C intra- ed extracellulari di Na + e K + e, indirettamente, la differenza di potenziale transmembranaria (questo aspetto verrà trattato succesivamente). Come abbiamo visto, il potenziale elettrochimico del Na + muove lo ione verso l'interno ed il potenziale elettrochimico del K + muove lo ione verso l'esterno della cellula. Questi due flussi vengono bilanciati dalla Na + /K + ATPasi che non solo ha creato le differenze di concentrazioni intra- ed extracellulari di Na + e K + ed il potenziale di membrana, ma anche li mantiene. Di fatto, inibendo la Na + /K + ATPasi sia le differenze di concentrazioni di Na + e K + sia il potenziale di membrana tendono ad annullarsi. Molta parte dell'atp cellulare viene speso per alimentare la Na + /K +, o Na + /K + ATPasi (circa il 40%). La Na + /K + ATPasi crea un potenziale elettrochimico che viene utilizzato da molti tipi di trasporto. Nella trattazione succesiva faremo alcuni esempi specifici e sarà chiaro del perchè abbiamo denominato la Na + /K + ATPasi "la madre di (quasi) tutti i trasporti".

2 1 Il Na + citoplasmatico si lega alla pompa. 2 Il legame con il Na + attiva la fosforilazione della proteina. 6 Il K+ viene rilasciato nel citosol. 3 La fosforilazione cambia la conformazione della proteina ed il Na + viene rilasciato all esterno. 5 4 La defosforilazione + /K + ATPasi è formata da 3 subunità (α,β, e γ) ciascuna delle quali presenta Il K + extracellulare La Na può ora numerose legarsi alla causa un cambio di proteina e attiva isoforme. La subunità α1 è presente in tutte le cellule e contiene i siti di legame per Na +, K + la, ATP e conformazione. de-fosforilazione per i glicosidi cardiaci, quali la ouabaina, che inibiscono la pompa. della proteina. Fig Il ciclo della Na + /K + ATPasi. LA CA 2+ ATPASI Nella MP abbiamo una Ca 2+ ATPasi che espelle il Ca 2+ contro il potenziale elettrochimico, con una stechiometria 1/1. Anche il reticolo endo-sarcoplasmatico ha una Ca 2+ ATPasi detta SERCA che trasporta il Ca 2+ dal citosol nel reticolo endo-sarcoplasmatico. Trasporto concentrazione-dipendente (trasporto facilitato) Il glucoso passa con estrema difficoltà attraverso la MP ed è stata così inserita nella MP una proteina, detta GLUT (glucose transporter) che facilita il passaggio del Glucoso in favore di una differenza di C. Esistono tre isoforme:glut1 e GLUT3 sono ad alta affinità e bassa capacità, GLUT2 è a bassa affinità ed alta capacità. GLUT è associato ad una esochinasi che fosforila il Glucoso, rendendolo incapace di interagire con GLUT. Questo fa sì che la C intracellulare di Glucoso resti bassa, mantenendo una differenza di C che faciliti l'ingresso di Glucoso. L'isoforma GLUT4 è insulina-dipendente ed è presente nel muscolo schletrico e nel tessuto adiposo (Fig. 2.3). L'aumento della glicemia stimola la produzione di insulina che pilota GLUT4 dal citosol alla MP, favorendo l'ingresso del Glucoso. L'insulina aumenta anche l'espressione dell'esochinasi, perfezionando la risposta all'aumento della glicemia.

3 Insulina Modificata da Recettore per l'insulina Espressione genica, crescita Inserimento GLUT4 Altri segnali Utilizzo del Glucoso Fig L'insulina ha numerosi effetti, tra i quali l'inserimento di GLUT4 nella MP. La direzione del trasporto è concentrazione-dipendente (le molecole si muovono da concentrazioni maggiori a concentrazioni minori); il meccanismo viene denominato a volte diffusione facilitata ma non si tratta di un processo diffusivo. La Fig. 2.4 mostra come la proteina può interagire sia col glucosio interno che con quello esterno conformazioni, ed il processo può essere così schematizzato: dci/dt = K 1 [Ce(t)] [ Proteina trasportatrice] dce/dt = K 1 [Ci(t)] [ Proteina trasportatrice] Cosicché se Ce>Ci c è un trasporto verso l interno e viceversa. Ce P Ci P Fig Nel trasporto facilitato la proteina trasloca la molecola nei due sensi, in funzione della C della molecola. Questo tipo di trasporto viene utilizzato da molecole polari che non possono attraversare facilmente la membrana. Non essendo ioni, il passaggio non è influenzato da Vm. Co-trasporto Na + /Glucoso Nei reni e nell intestino il Glucosio viene assorbito dal lume tramite un co-trasporto (o simporto) Na + /Glucosio, mediante una proteina detta SGLT. Il passaggio può avvenire anche contro differenza di C perché accoppiato all ingresso di Na +, che avviene in favore di potenziale elettrochimico (Fig. 2.5). Questo favorisce il riassorbimento completo del Glucosio dal lume tubulare o intestinale. La C intracellulare di Glucosio aumenta, cosicché può passare mediante trasporto concentrazione-dipendente nei capillari sanguigni

4 Modificato da Diabesity Digest Lume tubulare Glucoso Na + Rene Lume intestinale Glucoso Sangue Intestino tenue Fig Assorbimento del Glucoso nel rene e nell'intestino tenue. Il glucoso viene co-trasportato dal lume intestinale o tubulare e passa nel sangue con il meccanismo del trasporto facilitato. Opportunamente, in questo caso il Glucoso non viene fosforilato. Qui vediamo un primo esempio di trasporto che utilizza il potenziale elettrochimico del Na +, creato dalla Na + /K + ATPasi. Il riassorbimento di Glucosio non costa immediatamente energia, ma dovrà essere utilizzato dell ATP per espellere il Na + tramite la Na + /K + ATPasi, mantenedo costante il suo potenziale elettrochimico. Co-trasporto Na+/aminoacidi Gli aminoacidi possono entrare nella cellula utilizzando un co-trasporto con il Na +, in modo analogo al Glucoso (Fig. 2.6). Questo consente l'ingresso dell'aa anche contro gradiente elettrochimico. Anche in questo caso non vi è consumo diretto di energia, che verrà utilizzata per espellere il Na +. Na + AA Sito di legame per il Na + Sito di legame per l'aa Na + AA Fig Co-trasporto (o simporto) Na + /AA

5 Anti-trasporto o antiporto Na + /Ca 2+ Nella MP si trova una proteina, denominata scambiatore Na + /Ca 2+, che consente il trasporto, in direzioni opposte, di un Ca 2+ e di 3Na + (Fig. 2.7). Questo tipo di trasporto viene detto anti-trasporto o antiporto. Scambiatore Ca 2+ Na + /Ca 2+ 3 Na + Scambiatore Na + /Ca 2+ 3 Na + Ca 2+ Fig Scambiatore Na + /Ca 2+. Lo scambiatore può trasportare il Na + dentro la cellula ed il Ca 2+ fuori dalla cellula, o viceversa. Sia il Na + che il Ca 2+ extracellulari tendono ad entrare. Se il potenziale elettrochimico di 3 Na + extracellulari è maggiore del potenziale elettrochimico di un Ca 2+ extracellulare, entrano 3 Na + ed esce un Ca 2+, questo contro potenziale elettrochimico. Alternativamente, entra un Ca 2+ ed escono 3 Na +. In genere lo scambiatore espelle il Ca 2+ ; un aumento della [Na + ] intracellulare, per esempio, può essere tale da bloccare il trasporto o invertirlo. L'ingresso di Na + sarà bilanciato dalla Na + /K + ATPasi. Se è il Ca 2+ ad entrare, sarà la Ca 2+ ATPasi, se necessario, ad espellerlo. Spesso Ca 2+ ATPasi e scambiatore Na + /Ca 2+ coperano nell espellere il Ca 2+ : lo scambiatore ha bassa affinità ma alta capacità di trasporto (interviene per concentrazioni superiori a circa 1 µm), la Ca 2+ ATPasi ha alta affinità ma bassa capacità di trasporto ed interviene quando la [Ca 2+ ]i è tra 1 µm e 0.1 µm, essendo questa la C basale. Simporto Na + /2 Cl - /K + In Fig. 2.8 troviamo esemplificato un simporto Na + /2 Cl - /K +, che consente l'ingresso di 1 Na +, 2 Cl - ed 1 K +. Fig Simporto Na + /2 Cl - /K +. In questo caso il Cl - entrato attraverso il simporto esce dall'altro lato della cellula mediante un canale, il Na + entrato attraverso il simporto esce attraverso la Na + /K + ATPasi, il K+ entrato attraverso il simporto esce attraverso un canale. Ulteriore K + entra a causa dell'uscita di Na+ mediante la Na + /K + ATPasi.

6 Trasporto degli Idrogenioni Il metabolismo cellulare tende a produrre idrogenioni. Ci sono due meccanismi che possono estrudere gli H + : un antiporto Na + /H + (Fig. 2.9A) ed una pompa protonica utilizzante ATP (Fig. 2.9B). A B Pompa protonica Vm=-70 mv Modificata da Fig A, l'antiporto Na + /H + utilizza l'ingresso di Na +, con gradiente elettrochimico favorevole, per estrudere l'h+ contro il gradiente elettrochimico (si ricordi che la C extracellulare è leggermente inferiore a quella intracellulare, ma Vm è più negativo del potenziale di equilibrio dell'h + )). B, L'H + viene estruso contro il gradiente elettrochimico utilizzando ATP. Come è noto, la pompa protonica può utilizzare il potenziale elettrochimico dell H + per sintetizzare ATP, come avviene nei mitocondri. Alcune caratteristiche del trasporto mediato da proteine Nel caso della diffusione la velocità con cui le molecole si spostano da un compartimento ad un'altro aumenta con l'aumentare della C presente nel compartimento (il flusso netto sarà proporzionale alla differenza di C). Nel caso del trasporto mediato da carrier la velocità aumenta con la C ma, al progressivo aumentare di questa, tenderà a saturare (Fig. 2.10). Il fenomeno è assimilabile ad una reazione enzimatica, dove l'enzima è una proteina trasportatrice. La velocità di trasporto (numero di molecole trasportate nell'unità di tempo, o dm/dt) aumenterà con l'aumentare di C, tenderà alla saturazione e sarà descrivibile dall'equazione di Michaelis Menton. dm/dt= (Vmax x C(t))/ (Km + C(t))

7 Trasporto somma Trasporto mediato da proteine Trasporto mediato da proteine Diffusione Diffusione Concentrazione (M) Modificato da Fig Cinetica del trasporto mediato dalla diffusione e da proteine. Il trasporto mediato da proteine può presentare il fenomeno della competizione: due molecole simili possono competere con lo stesso carrier, e la velocità di trasporto di una molecola diminuirà in funzione della C dell'altra molecola. Infine la diffusione è poco sensibile alla temperatura, poichè la velocità del processo è proporzionale alla temperatura assoluta, mentre il trasporto mediato da proteine lo è maggiormente. Un parametro empirico per valutare la sensibilità di un processo alla temperatura è il Q 10, variazione della velocità del processo per una variazione di 10 C. Il trasporto mediato da proteine ha un Q 10 pari a 2-3, mentre il Q 10 della diffusione è circa Genesi delle concentrazioni ioniche intracellulari e del potenziale di membrana. Concorrono a determinare le C ioniche intracellulari e Vm numerosi meccanismi, ma dal punto vista quantitativo questi due parametri sono in larga prevalenza funzione dell'attività della Na + /K + ATPasi e della permeabilità basale al K +, molto più alta di quella degli altri ioni. Per comprendere la genesi delle differenze di concentrazioni ioniche e del potenziale di membrana supponiamo di avere una proto-cellula con una membrana unicamente composta da un doppio strato lipidico immersa in un liquido con [Na + ] e = 130 mm e [K + ] e = 3 mm; ancorchè pochissimo permeabile agli ioni, la proto-cellula, col tempo, avrà all'interno un liquido di uguale composizione e Vm=0 (Fig. 2.11). Na + K + Vm= 0 Vm= negativo Fig Genesi di Vm (vedi testo)

8 Supponiamo di inserire nella MP un trasportatore che generi una differenza tra le Ce e le Ci del Na + e del K +. Inseriamo ora nella MP dei canali ionici permeabili al Na + ed al K + e quelli al K+ siano molto più numerosi. Per diffusione, il Na + entra nella cellula ed il K + esce, ma la permeabilità al K + è maggiore di quella al Na +, per cui vi è una uscita netta di cariche positive, e Vm diventa negativo (questo meccanismo viene denominato potenziale di diffusione) (Fig. 2.11). Se Vm diventa negativo, aumenta l'ingresso di Na + e diminuisce quello di K +. Quando Vm sarà tale che IK + = -INa +, Vm si stabilizzerà. Quando si raggiungerà una condizione di equilibrio per Vm e per le C di Na + ed K +? La situazione, per i soli Na + e K +, è esemplificata in Fig Fig Condizione di equilibrio, in cui tanto Vm che le C di Na + e K + sono costanti Tanti K + escono secondo il gradiente elettrochimico, tanti K + entrano tramite la Na + /K + ATPasi; tanti Na + entrano secondo il gradiente elettrochimico, tanti Na + escono tramite la Na + /K + ATPasi. Questo principio vale per tutte gli ioni: il Ca 2+, per esempio, tende ad entrare per gradiente elettrochimico, e deve quindi essere espulso attivamente, tramite lo scambiatore Na + /Ca 2+ (che consuma ATP indirettamente) o tramite la Ca 2+ ATPasi.