Caratteristiche generali dei virus

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1 I virus 1898: Beijerinck e Iwanowsky dimostrano che il mosaico del tabacco è una malattia infettiva sostenuta da un agente filtrabile; Loeffler e Frosch isolano da animali il virus dell'afta epizootica 1915: Twort dimostra l'esistenza dei virus dei batteri, definiti da d'herelle "batteriofagi" 1935: Stanley ottiene virus del mosaico del tabacco in forma cristallina; dimostra la presenza di proteine : dimostrazione della presenza dell'acido nucleico Anni quaranta: colture cellulari, coltivazione in vitro Anni cinquanta: scoperta della replicazione virale Anni sessanta: utilizzazione del microscopio elettronico e caratterizzazione dei virus

2 Caratteristiche generali dei virus Entità biologiche subcellulari (virione: particella virale completa ed infettante) Parassiti endocellulari obbligati (di animali, piante, funghi, batteri) (non possono produrre energia o sintetizzare acidi nucleici e proteine al di fuori di una cellula ospite) Hanno dimensioni piccolissime (sono filtrabili) Possiedono un solo tipo di acido nucleico (DNA o RNA) Possiedono un involucro proteico (capside) e, a volte, un involucro lipoproteico (pericapside o peplos) Presentano in superficie strutture proteiche (antirecettori) che si legano a specifici recettori della cellula bersaglio

3 Definizione e proprietà dei virus Non sono esseri viventi Per esistere in natura devono essere infettanti Devono utilizzare i meccanismi della cellula ospite per produrre i propri componenti (mrna virali, proteine e copie identiche del genoma) Devono codificare proprie proteine specifiche per ogni processo da loro richiesto e non effettuabile dalla cellula La produzione di nuovi virioni assemblaggio delle componenti virali avviene per

4 Principali differenze fra procarioti e virus Eubatteri Micoplasmi Ricketsie Clamidie Virus Presenza contemporanea di DNA ed RNA Presenza di ribosomi Capacità biosintetiche autonome Sensibilità agli antibiotici Presenza di sistemi enzimatici per la produzione di energia Crescita in terreni artificiali acellulari Sensibilità all'interferone

5 Confronto tra le dimensioni di virus e batteri Dimensioni Å 450 Å 600 Å Å Å (fino a 3000) 1 6 µm

6 Struttura del virione

7 Composizione chimica dei virus Core Acido nucleico: DNA Deossiribovirus DNA bicatenario lineare (Herpesvirus, Poxvirus, Adenovirus) DNA bicatenario circolare (Papovavirus) DNA monocatenario lineare (Parvovirus) DNA parzialmente bicatenario circolare (Hepadnavirus) 1,5-2,2 / milioni di daltons

8 Composizione chimica dei virus Core Acido nucleico: RNA Ribovirus RNA bicatenario frammentato (Reovirus) RNA monocatenario lineare a polarità positiva (Coronavirus, Flavivirus, Togavirus, Astrovirus, Calicivirus, Picornavirus) RNA monocatenario diploide a polarità positiva (Retrovirus) RNA monocatenario frammentato a polarità negativa (Orthomyxovirus) RNA monocatenario lineare a polarità negativa (Filovirus, Paramixovirus, Rhabdovirus) RNA monocatenario frammentato circolare a polarità negativa o ambisenso (in 2 o 3 distinti nucleocapsidi, Arenavirus, Bunyavirus) 2,5 / 16 milioni di daltons

9 Virus a DNA presenza o assenza di pericapside

10 Virus a RNA presenza o assenza di pericapside

11 Virus a DNA

12 Virus a RNA

13 Virus a RNA

14 Composizione chimica dei virus Capside rivestimento proteico (fino al 90% del virione) il capside: fornisce protezione all'acido nucleico è importante per l infettività (strutture anti-recettoriali) dal momento che il genoma virale ha un numero limitato di geni, il capside è costituito dalla associazione di subunità proteiche in protomeri ripetuti (capsomeri) collegati da legami tra gruppi chimici presenti sulla superficie e autoassemblanti

15 Composizione chimica dei virus Proteine non strutturali Enzimi mancano enzimi deputati alla produzione di energia o coinvolti nelle vie biosintetiche dei precursori - lisozima (in alcuni batteriofagi) - - neuraminidasi (Ortho e Paramyxovirus) - proteasi virus-specifiche - RNA polimerasi RNA-dipendente (virus a RNA) - Trascrittasi inversa (DNA polimerasi RNAdipendente, Retrovirus) - RNA polimerasi DNA-dipendente (Poxvirus)

16 Composizione chimica dei virus Componente lipidica e glucidica Pericapside (peplos o envelope) Rivestimento lipoproteico acquisito per gemmazione da membrane cellulari modificate sensibile a solventi dei lipidi e sali biliari Nei virus provvisti di peplos sono anche presenti glicoproteine

17 Morfologia e struttura Il modo in cui i diversi componenti sono organizzati nella struttura del virione è stato chiarito mediante microscopia elettronica e studi di diffrazione dei raggi X. Le catene polipeptidiche che costituiscono il capside sono disposte in modo simmetrico e la morfologia risultante del virione è variabile: rotondeggiante, allungata (a bastoncino), complessa, pleiomorfa.

18 Morfologia di vari gruppi di virus

19 Simmetria elicoidale capside cilindrico spiraliforme, capsomeri = protomeri; spire successive sfalsate maggiore stabilità; asse di simmetria rotatoria centrale Tutti i protomeri sono identici e si susseguono l uno all altro disponendosi in modo elicoidale intorno all asse centrale, formando legami ognuno con altri 2 protomeri; questo conferisce alla struttura estrema stabilità. I protomeri vengono prima montati a formare dischi (a destra) che vengono progressivamente aggiunti durante la formazione del capside. L acido nucleico si trova all interno del cilindro cavo, avvolto in modo elicoidale a stretto contatto con la superficie interna del capside.

20 Simmetria del capside: elicoidale Virus del mosaico del tabacco (elicoidale nudo). Sin.: rappresentazione schematica di un segmento del virus in cui si vedono i protomeri e nella parte alta (dove i protomeri sono stati omessi) l acido nucleico (RNA); Dx: fotografia al M.E.

21 Simmetria icosaedrica Icosaedro: poliedro regolare (12 vertici, 20 facce costituite da triangoli equilateri, 30 spigoli) Nei virus a simmetria icosaedrica, i protomeri sono organizzati in pentoni (ai vertici, sempre 12) e, nei virus più grandi anche in esoni (su facce e spigoli) legati da legami non covalenti, il cui numero varia a seconda dei virus (20, 60, 150 o 240) L icosaedro presenta tre assi di simmetria: asse di simmetria 2 che passa attraverso il centro degli spigoli, asse di simmetria 3 che passa attraverso il centro delle facce, asse di simmetria 3 che passa attraverso i vertici (simmetria di tipo 3:5:2 o simmetria cubica)

22 Virus a simmetria icosaedrica Assemblaggio del capside icosaedrico di un picornavirus (12 pentoni) Adenovirus (12 pentoni che si prolungano in strutture fibrose e 240 esoni)

23 Simmetria icosaedrica A,B,C: icosaedro visto lungo i 3 assi di simmetria D,E,F: diversi tipi di disposizione delle subunità che costituiscono il capside D) nei virus più piccoli (poliovirus) i protomeri possono formare dei trimeri; E) nei virus di medie dimensioni (es. Parvovirus) i protomeri costituiscono 12 pentoni (sui vertici) e 20 esoni (sulle facce); F) nei virus più grandi i protomeri costituiscono 12 pentoni (sui vertici) ed un numero variabile di esoni (sulle facce e sugli spigoli), fino a 252.

24 Simmetria complessa Poxvirus Fotografia al M.E. ( ) di un poxvirus Schema della struttura del virione dei Poxvirus A: visto dall esterno; B, C, D: in sezione lungo i 3 piani dello spazio. La porzione centrale (core) biconcava, circondata da una membrana interna (MI), contiene il DNA in una struttura filamentosa centrale (FC); i 2 voluminosi corpi laterali (CL), situati tra MI e la membrana esterna (ME) hanno funzione ignota. L intera superficie è avvolta da una struttura tubolare superficiale (TS).

25 Simmetria del capside: combinata Batteriofagi Caratteristiche morfologiche dei vari tipi di batteriofagi A) coda contrattile, DNA bicatenario (T2, T4); B) coda lunga non contrattile, DNA bicatenario (T1, λ); C) coda corta non contrattile, DNA bicatenario(t3); D) coda assente, ampi capsomeri, DNA a singola catena (Φx 174); E) coda assente, piccoli capsomeri, RNA a singola catena (MS2); F) testa assente, filamentosi, DNA a singola catena (M13)

26 Simmetria del capside: combinata Batteriofagi della serie T Fotografia al M.E. di un batteriofago T4 Struttura del batteriofago T4 Testa icosaedrica, coda elicoidale

27 Fasi della moltiplicazione virale Nella fase di parassitismo intracellulare il virus perde le caratteristiche morfologiche della fase extracellulare Acido nucleico e proteine strutturali della progenie virale sono sintetizzati separatamente in un gran numero di copie, poi assemblati in virioni maturi al termine del ciclo di moltiplicazione Il ciclo moltiplicativo si divide in 5 fasi 1. adsorbimento 2. penetrazione 3. esposizione dell'acido nucleico 4. sintesi dei componenti virali 5. assemblaggio e fuoriuscita dei virioni dalla cellula infetta

28 Adsorbimento Riconoscimento ed attacco del virus alla cellula ospite Interazione stereochimica tra specifici gruppi chimici esposti sulla superficie esterna della cellula suscettibile (recettori) e del virione (antirecettori) Il processo di adsorbimento richiede solo una partecipazione passiva della cellula e si verifica anche a basse temperature (4 C) mentre per il successivo processo di penetrazione è necessario un certo grado di intervento attivo della cellula ed è possibile solo a temperature ottimali.

29 Recettori per singola cellula pochi con funzione nota, complementari a molecole presenti sulla superficie virale; solitamente virus diversi usano recettori diversi, a volte virus diversi usano gli stessi recettori (ad es. Adenovirus e Coxsackievirus); lo stesso virus usa recettori diversi su cellule diverse, La presenza dei recettori determina il tropismo per specifici tipi cellulari (es. specificità d'organo) e la specificità d'ospite (uomo, animali, ecc.) *Virus Epstein-Barr linfociti B (recettore: CD21) *HIV linfociti T helper (recettore: CD4) *Influenza A acido sialico delle cellule epiteliali *Virus della rabbia recettori per l acetilcolina

30 Antirecettori componenti della superficie virale che si legano ai recettori proteine del capside o glicoproteine del peplos ripetute numerose volte (ad es. virus influenzali 800 molecole per virione) - a volte, proiezioni che sporgono dal virione es. HA dei virus influenzali e del morbillo fibre degli Adenovirus gp120 di HIV - a volte, strutture superficiali non ben evidenti es. VP7 dei Rotavirus VP1-VP2-VP3 dei Rinovirus

31 Penetrazione di virus privi di rivestimento Micropinocitosi (adsorbimento endocitico, viropessi) meccanismo più frequente: lo stesso che le cellule usano per internalizzare sostanze corpuscolate al di sotto di 1 µm (introflessioni della membrana rivestite di clatrina con successiva fusione con lisosomi) (1); in qualche caso entra solo l acido nucleico (2)

32 Penetrazione di virus con rivestimento 1. Fusione - lipidi e proteine del peplos si fondono con quelli della membrana della cellula, il nucleocapside viene a trovarsi direttamente nel citoplasma (in alcuni virus una specifica glicoproteina F del peplos favorisce la fusione) 2. Endocitosi tutto il virus viene inglobato in una vescicola endosomica

33 Esposizione dell'acido nucleico scapsidamento (uncoating) eclissi destabilizzazione e disorganizzazione del virione con l'adsorbimento perdita del peplos (durante la fusione) degradazione di proteine virioniche da parte di proteasi citoplasmatiche intervento di enzimi scapsidanti virali (es. Poxvirus)

34 Sintesi dei componenti virali Replicazione dell acido nucleico Sede intracellulare di replicazione: - nucleo deossiribovirus (utilizzano RNA polimerasi DNA-dipendenti cellulari presenti nel nucleo), tranne Poxvirus (che possiede una RNA-polimerasi DNAdipendente virus-specifica) - citoplasma ribovirus (con polarità positiva che fungono da mrna o a polarità negativa che utilizzano RNA polimerasi RNA-dipendenti virali), tranne Orthomixovirus e Retrovirus Tutti i virus devono produrre mrna per la sintesi di proteine

35 Sintesi dei componenti virali

36 Strategie per la produzione di mrna

37 Espressione del genoma virale sintesi delle proteine precoci, non strutturali: - enzimi replicativi - inibitori sintesi cellulari (Polio, Adeno, Herpes) - stimolatori sintesi cellulari (virus oncògeni) replicazione dell'acido nucleico (in modi diversi nelle diverse classi replicative) sintesi proteine tardive strutturali (dopo la replicazione dell'acido nucleico)

38 Assemblaggio e fuoriuscita dei virioni diverse strategie Virus nudi: automontaggio del capside in sede citoplasmatica o nucleare, dovuto alla natura dei capsomeri; legami non covalenti tra i capsomeri Schema dell automontaggio di un Picornavirus Viene prodotta una poliprotreina (protomero), clivata in 3 proteine (VP0, VP1, VP3) che si aggregano a formare il procapside. Nel procapside entra una molecola di +RNA (provirione); alcune proteine vengono ulteriormente tagliate (maturazione virione definitivo infettivo).

39 Assemblaggio e fuoriuscita dei virioni Virus nudi - Non è necessaria la preventiva presenza dell'acido nucleico (virioni vuoti) - L'incapsidamento dell'acido nucleico solitamente stabilizza la struttura - Maturazione: automontaggio e incapsidamento Aggregati paracristallini (inclusioni) inclusioni nucleari inclusioni citoplasmatiche (Adenovirus) (Reovirus) La liberazione del virus avviene in seguito a disgregazione cellulare: lisi totale (es. Poliovirus) o parziale (es. Adenovirus) della cellula

40 Assemblaggio e fuoriuscita dei virioni Virus con pericapside - nucleocapside assemblato in modo analogo - pericapside acquisito da membrane della cellula per gemmazione, preceduta da una modificazione delle membrane cellulari Le proteine virali tendono ad aggregarsi, escludendo proteine cellulari (4) Schema della modificazione della membrana cellulare con inserimento di glicoproteine e proteine virali del pericapside

41 Assemblaggio e fuoriuscita dei virioni Virus con pericapside - Gemmazione A) Dopo l automontaggio, il nucleocapside si avvicina alla membrana modificata; B) Inizia il processo di gemmazione; C) Il virus fuoriesce avvolgendosi in parte della membrana modificata (pericapside) Herpesvirus: gemmazione attraverso la lamella interna della membrana nucleare, uscita attraverso il reticolo endoplasmatico Altri virus: gemmazione dalla membrana cellulare - Alcuni virus sono citocidi (Paramyxo, Toga, Herpes) - Altri sono liberati per lunghi periodi (Rabdo, Rosolia) o per periodi indefiniti (Retrovirus)

42 Durata e cinetica del ciclo di replicazione virale Curva di un singolo ciclo di replicazione di un virus rilasciato con lisi cellulare La durata del ciclo è variabile nei diversi gruppi di virus, da poche ore nei Picornavirus a diversi giorni nei virus di maggiori dimensioni Numero di virioni prodotti/cellula: nei virus litici 10 6 e più negli altri

43 Tipi di infezione virale a livello cellulare Replicazione abortiva In determinate condizioni i virus possono penetrare nelle cellule, esprimere parte del proprio genoma e produrre parte delle proprie macromolecole, ma non riescono a dare origine a nuovi virioni infettanti Virus normale - cellula restrittiva (Cellule permissive, semipermissive, restrittive) Virus defettivo - cellula normale (Virus helper satellitismo virale) es. - virus sarcoma di Rous del pollo (deriva pericapside da altri retrovirus) - parvovirus adeno-associati - viroide epatite D, dipendente da virus epatite B (capside)

44 Interferenza virale Fenomeno attraverso il quale un virus può impedire o ridurre la replicazione di un altro virus nelle stesse cellule o nello stesso organismo 3 meccanismi possibili: - Competizione per i recettori cellulari Recettori cellulari bloccati da anti-recettori prodotti in eccesso - Competizione per eventi biochimici intracellulari Apparati biosintetici cellulari impegnati da un virus, non disponibili (particelle defettive interferenti) - Produzione di interferone Meccanismo più importante di interferenza Glicoproteine a basso P.M. ( daltons) prodotte dalle cellule in seguito a diversi stimoli (tra cui l'infezione virale), ad attività antivirale e antineoplastica Interferoni α e β: - prodotti da leucociti e fibroblasti - attivi su cellule infettate da virus o tumorali - inducono stato antivirale e attivazione cellule NK specie - specifici, ma non virus - specifici Interferone γ: - prodotto da linfociti TH1 e cellule NK - attivo su macrofagi e linfociti T - attivazione macrofagi - risposta immunitaria cellulo-mediata

45 Meccanismo d azione antivirale dell interferone Il virus infettante si replica (1) ed induce la cellula infetta ad attivare il gene per l interferone (2, 3, 4) Induzione induttori RNA bicatenari (intermedi replicativi virali) Meccanismo d azione l interferone viene secreto e si lega a recettori specifici sulle cellule vicine (5), inducendo la sintesi (6, 7, 8) di due enzimi antivirali: protein chinasi fosforilazione di EF-2 (fattore di innesco della S.P.) con perdita della attività oligoadenilato sintetasi (2'-5' (A)n sintetasi) sintesi di acido 2'-5'- oligoadenilico, nucleotide che attiva una ribonucleasi che degrada gli mrna virali (RNAsi L) I due enzimi bloccano la sintesi proteica e degradano gli mrna virali (9)

46 Gli stadi dell infezione virale nell organismo

47 Alcuni esempi di malattie sostenute da virus Patogenicità dei virus: danno cellulare Infezioni localizzate o sistemiche acute, croniche (virus lenti o oncògeni) o latenti (recidive) Virus teratogeni (infezioni del feto e malformazioni) principalmente, Citomegalovirus e virus della rosolia

48 Modalità di trasmissione dell infezione virale

49 Classificazione dei virus Struttura dimensioni, morfologia e tipo di acido nucleico es. picornavirus [piccolo RNA], togavirus [mantello] Tipo di replicazione (es. replicazione nucleare o citoplasmatica) Cellula ospite (spettro d ospite) animali (uomo compreso), piante, funghi, batteri Tropismo di tessuto od organo es. enterovirus, adenovirus Malattia sostenuta es. encefaliti, epatiti, ecc. Tipo di trasmissione es. arbovirus diffusi dagli insetti

50 Sensibilità dei virus ad agenti chimici e fisici Preparazione di vaccini, prevenzione della diffusione dei virus Agenti chimici - Solventi dei lipidi (etere, cloroformio, detergenti anionici): virus con peplos - Fenolo: inattiva le proteine del capside e peplos (disinfettanti) - Formaldeide: inattiva acidi nucleici e proteine, senza alterarne le proprietà antigeniche (preparazione di vaccini) - Alcool isopropilico, etilico, iodofori, ipoclorito di sodio, glutaraldeide 2% - Fotoinattivazione: alcuni coloranti (rosso neutro, proflavina, blu di toluidina) possono penetrare nel capside, legarsi all'acido nucleico; in presenza di luce fotoossidazione Virus + resistenti: Enterovirus (clorazione delle acque) e virus dell'epatite B Agenti fisici - Temperatura: conservati a basse temperature inattivati a C metodi di sterilizzazione (autoclave e stufa) efficaci - Radiazioni: raggi X e gamma (ionizzanti) rottura dell'acido nucleico UV (non ionizzanti) dimeri di timina o di uracile

51 Metodi di coltivazione dei virus animali Coltivazione indispensabile per la diagnosi di laboratorio, la preparazione di vaccini e a scopo sperimentale Cellule viventi: colture cellulari, uova embrionate animali (utilizzati per la produzione di antisieri, studi sull'azione patogena, studi su vaccini e sostanze antivirali) Colture cellulari - Colture primarie, derivate da tessuti o organi animali (massimo 50 subcolture, diploidi) - Colture secondarie, derivate da primarie - Fibroblasti (cellule embrionali, diploidi; oltre 100 subcolture) - Cellule in linea continua, trasformate o tumorali (spesso aneuploidi o poliploidi) o

52 Colture cellulari Effetti citopatici - Comparsa di inclusioni citoplasmatiche e/o nucleari - Comparsa di modificazioni morfologiche evidenti - necrosi e lisi (Picornavirus e Togavirus) - sincizi, megacariociti (Paramyxovirus, Herpesvirus) - foci di cellule arrotondate (Citomegalovirus) - Comparsa di nuovi antigeni virus-indotti: - Emoadsorbimento - Immunofluorescenza

53 effetto litico su cellule Vero (Poliovirus) effetto litico su cellule Vero (Enterovirus) Effetti citopatici da virus sincizio (virus del morbillo) cellule giganti multinucleate (freccia) cellule Vero (linea continua) non infettate

54 Effetti citopatici da virus fibroblasti umani non infetti effetto litico su fibroblasti umani immunofluorescenza citoplasmatica (Rotavirus)

55 Effetti citopatici da virus immunofluorescenza nucleare immunofluorescenza nucleare e citoplasmatica cellule infettate e trattate con anticorpi marcati con perossidasi: localizzazione nucleare degli antigeni virali

56 Uovo embrionato Annessi embrionali Inoculazione in: A) membrana corionallantoidea (MCA) (Pox, alcuni Herpes) B) cavità allantoidea (virus influenzali: preparazione vaccino) C) cavità amniotica (virus influenzali: preparazione vaccino) D) sacco vitellino