MICROBIOLOGIA FARMACEUTICA

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1 Piergiorgio Mazza Ordinario di Microbiologia Farmaceutica presso la Facoltà di Farmacia dell'università di Parma MICROBIOLOGIA FARMACEUTICA SOCIETÀ EDITORIALE FARMACEUTICA MILANO

2 INDICE CAPITOLO 1 L'origine e l'evoluzione della microbiologia 9 Cenni storici 9 I Diversi settori della microbiologia 14 La Microbiologia Farmaceutica 15 CAPITOLO 2 L'osservazione dei microrganismi 17 I microrganismi e le loro dimensioni 17 Lo scopo dell'osservazione microscopica 18 I diversi tipi di microscopio 18 Il microscopio ottico 18 Il microscopio a fluorescenza 19 Il microscopio a campo oscuro 19 Lo stereomicroscopio 19 Il microscopio a contrasto di fase 19 Il microscopio elettronico 20 L'allestimento di un preparato e l'osservazione al microscopio 20 Le colorazioni dei microrganismi 22 Colorazioni semplici 23 Colorazioni differenziali 23 La colorazione di Gram 23 La colorazione di Ziehl Neelsen 23 L'osservazione dei funghi 24 CAPITOLO 3 I microrganismi: batteri, funghi e virus 25 Microrganismi eucarioti e procarioti 25 I batteri 28 La forma e le dimensioni dei batteri 28 Aggregati batterici e divisione cellulare 28 L'organizzazione strutturale della cellula batterica 29 Capsula 29 Flagelli 29

3 Fimbrie Pili Parete cellulare Il peptidoglicano o mureina o mucopeptide La membrana esterna dei Gram negativi La membrana citoplasmatica Il citoplasma Il nucleo batterico I plasmidi Batteri sporigeni La sporificazione, la germinazione I funghi Le muffe Spore vegetative o asessuali, spore sessuali I lieviti I virus La specificità di ospite, la struttura e la composizione della particella virale Le diverse fasi del ciclo infettivo di un virus L'adsorbimento e la penetrazione, la replicazione, l'assemblaggio e la liberazione La classificazione dei microrganismi Caratteri di identificazione e classificazione La nomenclatura dei microrganismi La classificazione dei virus La classificazione delle muffe Sistemi rapidi per la classificazione tassonomica dei batteri Alcuni esempi di microrganismi di interesse medicofarmaceutico Batteri: Bacillus Clostridium Enterobatteri Pseudomonas Staphylococcus Streptomyces Muffe: Aspergillus Penicillium Lieviti: Saccharomyces cerevisiae Candide Virus: Herpes simplex (Herpes) Herpesvirus (Varicella - zoster) Orthomyxovirus (Influenza) Togavirus (Rosolia)

4 Picornavirus (Poliomielite) 54 CAPITOLO 4 La coltivazione e la titolazione dei microrganismi 56 I terreni di coltura - 56 Terreni di coltura minimi o sintetici 57 Terreni di coltura massimi o indefiniti 57 Terreni liquidi e terreni solidi 57 Terreni di coltura speciali. 58 Terreni differenziali o di saggio 59 Terreni di mantenimento 59 La preparazione di un terreno di coltura 59 I terreni di coltura suggeriti dalla FU IX Ed. 60 Condizioni chimico-fisiche necessarie per l'accrescimento dei microrganismi 62 Temperatura 62 Esigenze gassose 62 Acidità ed alcalinità 63 Grado di umidità ed attività dell'acqua 63 Condizioni fisiche relative alla coltivazione dei microrganismi in alcuni saggi microbiologici descritti dalla Farmacopea Ufficiale 64 Le colture di microrganismi 65 Caratteri colturali 66 Colture pure 66 Il mantenimento e la conservazione dei microrganismi 66 Le collezioni di microrganismi 69 La riproduzione e l'accrescimento dei microrganismi 69 Il tempo di generazione 69 La matematica dell'accrescimento batterico 70 La curva di crescita 70 La misura quantitativa di una popolazione microbica 72 La misura della massa cellulare 73 La misura turbidimetrica 73 La determinazione della concentrazione cellulare 73 Il conteggio totale. 73 Il conteggio vitale 75 La filtrazione su membrana 76 Il metodo del numero più probabile (MPN) 76 Metodi suggeriti dalla Farmacopea Ufficiale FU IX Ed. per il conteggio dei microrganismi 78 La coltivazione e la titolazione dei virus 79 Virus batterici 79 Virus animali 80 Colture cellulari 80 Embrioni di pollo 81 L'utilizzo di animali 81

5 CAPITOLO 5 Genetica batterica 85 Il flusso dell'informazione genetica 85 La struttura del DNA 86 La replicazione del DNA 86 La struttura e la sintesi di RNA 86 Differenti tipo di RNA 90 L'organizzazione dei geni procarioti ed eucarioti 90 La sintesi proteica ed il codice genetico 91 Proteine secrete 92 Modificazioni post-traduzionali di proteine eucariote 92 La genetica dei microrganismi 93 La mutazione 93 L'effetto delle mutazioni sulla funzionalità del prodotto genico 93 L'origine delle mutazioni 95 Meccanismi riparativi -, 96 Differenti tipi di mutanti batterici 97 La retromutazione 98 Il test di fluttuazione 98 Metodi di scambio di DNA nei microrganismi 98 La coniugazione 100 La trasformazione 100 La trasduzione 100 CAPITOLO 6 Microrganismi e malattie 102 I rapporti tra gli organismi ed i microrganismi 102 La flora microbica del corpo umano 103 La flora della cute 103 La flora della bocca e delle vie respiratorie, 104 La flora intestinale 104 Microrganismi patogeni 105 Le sorgenti di infezione e le vie di trasmissione delle malattie infettive 107 Vie di penetrazioni dei microrganismi 107 La moltiplicazione in vivo dei microrganismi patogeni HO Fattori di diffusione 111 Tossine batteriche: esotossine ed endotossine 111 L'endotossina dei Gram negativi 112 Funghi patogeni 112 Micotossine e micotossicosi 115 Virus patogeni 117 La sindrome da immunodeficienza acquisita: AIDS 119 Le difese dell'organismo contro le infezioni 120 Meccanismi di difesa aspecifici 121 Cute e mucose 122

6 L'azione protettrice della flora microbica 122 Fattori umorali ad attività antimicrobica 123 B-lisine e leuchine 123 Lisozima e Lattoferrina 123 Interferoni 123 Anticorpi naturali 124 Il complemento 124 Meccanismi di difesa cellulari 125 La fagocitosi L'infiammazione 125 Meccanismi di difesa specifici: la risposta immunitaria 127 Antigene 128 La risposta umorale: I linfociti B e la produzione degli anticorpi 130 L'interazione antigene anticorpo 133 La risposta immunitaria cellulo-mediata: i linfocitit 134 La selezione clonale e la diversità immunologica 134 La risposta immunitaria primaria e secondaria 136 Disordini immunologia 137 Immunodeficienze primarie e secondarie 137 Reazioni di ipersensibilità o allergie 138 L'anafilassi 138 Ipersensibilità citotossica 138 Ipersensibilità mediata da immunocomplessi 139 Ipersensibilità ritardata 139 Malattie autoimmuni 130 Strategie dei microrganismi per contrastare o eludere il sistema immunitario 140 Reazioni sierologiche 140 Anticorpi monoclonali 141 Vaccini 142 Vaccini inattivati 143 Anatossine 143 Vaccini vivi attenuati 143 Vaccini rappresentati da frazioni immunogene del microrganismo 144 I vaccini della F.U. 145 Vaccini per uso umano 145 Vaccini per uso veterinario 148 Sieroterapia e sieroprofilassi: sieri immuni e immunoglobuline 149 Sieri immuni per uso umano della F.U. 150 Sieri immuni per uso veterinario della F.U. 151 Immunoglobuline umane della F.U. 151 CAPITOLO 7 Trattamenti antimicrobici 154 Generalità e definizioni

7 Trattamenti antimicrobici basati sull'uso di agenti fisici 156 Il calore secco 156 La sterilizzazione diretta alla fiamma 156 La sterilizzazione in stufa a secco 157 Il calore umido 157 La pastorizzazione 157 L'ebollizione 158 La tindalizzazione 158 La sterilizzazione in autoclave Trattamenti antimicrobici mediante radiazioni 161 Le radiazioni ultraviolette 161 I raggi y 161 La sterilizzazione mediante filtrazione 162 Trattamenti antimicrobici basati sull'uso di composti chimici 163 Acidi ed esteri 163 Acqua ossigenata 165 Alcoli 165 Aldeidi 165 Alogeni 168 Detergenti sintetici 169 Fenolo e composti fenolici 170 Metalli pesanti e loro derivati 170 Ossido di etilene 171 Composti vari 171 Fattori che influenzano l'efficacia dei trattamenti antimicrobici e dei conservanti 172 La concentrazione 172 La temperatura 172 L'ambiente 172 Il tipo di contaminazione, la sua concentrazione e lo stato fisiologico delle cellule. 173 Spore batteriche e trattamenti antimicrobici 174 La scelta di un agente antimicrobico 175 La gestione dei disinfettanti a livello ospedaliero 176 Le curve di mortalità delle popolazioni microbiche 176 I parametri che caratterizzano i trattamenti antimicrobici 178 Il valore D 178 Il valore Fo 179 La probabilità di sterilità 180 La valutazione dell'attività antimicrobica 182 L'efficacia dei conservanti 184 Test di challenge 184 Test di challenge ripetuto 185 Test d'uso 186 Test della regressione lineare 186 Il coefficiente fenolico 186 L'inattivazione degli agenti antimicrobici 187

8 Il meccanismo d'azione degli agenti antimicrobici non antibiotici 188 La resistenza ad agenti antimicrobici non antibiotici 190 Fattori ambientali 191 Fattori genetici 191 CAPITOLO 8 Gli antibiotici 195 Caratteristiche generali 195 L'attività di un antibiotico: la MIC w 196 II meccanismo d'azione degli antibiotici 197 La selettività degli antibiotici 199 Lo spettro di attività di un antibiotico 201 L'antibiogramma 202 Il meccanismo d'azione degli antibiotici 203 Antibiotici inibitori della biosintesi del peptidoglicano 203 a) Inibitori della biosintesi dei precursori del peptidoglicano 204 b) Inibitori del trasporto del dimero pentapeptide e) Inibitori del processo di maturazione 206 Antibiotici che interferiscono con le funzioni della membrana 212 Antibiotici inibitori delle biosint. macromolecolari 214 a) Inibitori della sintesi del DNA 214 b) Inibitori della trascrizione 218 e) Inibitori della sintesi proteica 219 Antibiotici inibitori della biosintesi dell'acido folico 225 La resistenza agli antibiotici 228 La resistenza antibiotica di tipo cromosomico 230 Resistenza single step e multistep 231 L'insorgenza della resistenza può spiegare un insuccesso terapeutico 232 La resistenza cromosomica non è epidemiologicamente rilevante 232 Meccanismi molecolari della resistenza cromosomica 233 La resistenza antibiotica codificata da plasmidi 234 I trasposoni 236 Meccanismi molecolari della resistenza plasmidica e da trasposoni 236 Meccanismi di resistenza cromosomica e plasmidica dei principali antibiotici 239 Meccanismi di trasferimento della resistenza antibiotica 249 L'origine dei geni della resistenza antibiotica 250 La resistenza antibiotica: prospettive future 251 Chemioterapia antivirale 252 CAPITOLO 9 Aspetti microbiologici della produzione farmaceutica 256 Le Norme di Buona Fabbricazione 257 Gli effetti della contaminazione microbica dei prodotti farmaceutici 258

9 L'origine della contaminazione dei prodotti farmaceutici 260 La qualità dell'ambiente e dell'aria 260 Le apparecchiature 265 La contaminazione prodotta dall'operatore 265 Le materie prime 266 I materiali di confezionamento 268 Semilavorati e controlli in processo 269 La convalida 269 Prodotti farmaceutici obbligatoriamente sterili 270 I metodi di sterilizzazione consigliati dalla FU 270 Prodotti e preparazioni che possono essere sterilizzati nel loro contenitore finale 270 Prodotti e preparazioni che non possono essere sterilizzati nel loro contenitore finale 272 Gli indicatori di sterilizzazione 273 Il controllo di sterilità di prodotti farmaceutici 275 Campionamento 275 Scelta della tecnica di analisi 275 Controlli ed esecuzione del test 277 Lettura ed interpretazione dei risultati 279 La ripetizione del controllo di sterilità 279 I limiti del saggio di sterilità 281 L'attività pirogena dei prodotti farmaceutici ad uso parenterale 282 Saggio per la verifica dell'assenza di pirogeni: il test sul coniglio 283 Saggio per la ricerca delle endotossine batteriche: il Limulus test o LAL test 283 Il controllo della contaminazione microbica di prodotti non obbligatoriamente sterili 284 Analisi quantitativa della contaminazione microbica: determinazione della carica microbica \ 285 Analisi qualitativa della contaminazione: la ricerca di microrganismi specifici 286 Stabilità e stabilizzazione dei medicamenti: l'uso di conservanti antimicrobici 288 Saggio per la verifica dell'efficacia dei conservanti antimicrobici 290 Aspetti microbiologici della produzione cosmetica 291 Titolazioni microbiologiche 294 Il dosaggio degli antibiotici 295 Il dosaggio delle vitamine 298 CAPITOLO 10 I microrganismi nell'industria chimica e farmaceutica 305 I microrganismi nelle sintesi chimiche 306 La produzione microbiologica di acidi organici 306 Acido citrico 306 Acido gluconico 308

10 Acido lattico 308 La produzione di aminoacidi 309 I microrganismi utilizzati ed i metodi produttivi 319 Un esempio: la produzione di acido glutammico 310 La produzione di vitamine 310 Vitamina B Riboflavina (Vitamina B2) 314 Polimeri di origine microbica 314 Polisaccaridi 314 Poliesteri 315 Enzimi di origine microbica 316 I microrganismi produttori 321 Enzimi e biotecnologie 321 Il miglioramento delle caratteristiche di un enzima 322 L'immobilizzazione di enzimi e di cellule microbiche 322 Le biotrasformazioni 326 I vantaggi delle biotrasformazioni 326 I metodi delle biotrasformazioni 327 Le trasformazioni microbiologiche degli steroli 327 La penicillina acilasi 328 La sintesi dell'acido ascorbico 330 Studi sulla metabolizzazione dei farmaci 331 La degradazione dei composti organici 332 II ruolo dei microrganismi nella valutazione delle proprietà genotossiche dei prodotti chimici 333 Mutagenesi e cancerogenesi 333 Aspetti legislativi riguardanti la mutagenesi di composti chimici 335 Il test di Ames o test Salmonella - microsomi 336 La ricerca e lo sviluppo di nuovi antibiotici: la via microbiologica 342 Fisiologia dei microrganismi produttori di antibiotici 342 I microrganismi produttori 342 Relazione tra posizione tassonomica ed antibiotico prodotto 343 Aspetti biochimici della produzione degli antibiotici: il metabolismo secondario 344 Enzimi e vie metaboliche del metabolismo secondario 344 Il concetto di famiglia di antibiotici 345 Aspetti genetici del metabolismo secondario 346 La regolazione del metabolismo secondario 346 L'effetto dell'antibiotico sul ceppo produttore 347 Il significato del metabolismo secondario 348 La ricerca e lo sviluppo di nuovi antibiotici 349 Le caratteristiche ideali di un antibiotico 349 La ricerca di nuovi microrganismi produttori: lo schema classico di screening 349 Lo screening di nuovi microrganismi 351

11 Il saggio di screening per la ricerca di nuovi antibiotici 352 La determinazione della novità di un antibiotico 353 Il brevetto dell'antibiotico 354 Lo sviluppo di un antibiotico: dal laboratorio alla clinica clinica 354 Dal laboratorio alla produzione industriale: II miglioramento genetico dei ceppi produttori 355 Il miglioramento dei ceppi produttori 355 La mutagenesi del ceppo di partenza 356 La selezione casuale 'random selection' 357 Tecniche razionali di selezione 357 Nuove strategie per il miglioramento dei ceppi produttori 358 Metaboliti secondari indesiderati 359 Il miglioramento delle caratteristiche farmacologiche e microbiologiche di un antibiotico 360 La produzione industriale degli antibiotici 361 Il fermentatore 362 Il terreno di coltura ed il processo di fermentazione 363 La purificazione degli antibiotici dal brodo di coltura 364 Il miglioramento delle condizioni di fermentazione 364 Metaboliti utili non antibiotici 365 Le biotecnologie: prodotti farmaceutici ottenuti mediante la tecnica del DNA ricombiante. 366 I metodi dell'ingegneria genetica 367 Endonucleasi di restrizione 367 I vettori di clonaggio 370 Il clonaggio genico 371 L'origine del frammento di DNA da donare ed il suo inserimento nel vettore 371 L'inserimento del DNA esogeno in un vettore 375 L'introduzione del vettore nel sistema ospite e la ricerca del clone 376 L'ottimizzazione dell'espressione genica 376 Le modificazioni post-traduzionali 380 L'ingegneria proteica 380 Il controllo di qualità di prodotti farmaceutici ottenuti mediante la tecnologia del DNA ricombinante 381 Alcuni esempi di prodotti biotecnologici 382 Ormone umano della crescita 382 Somatostatina 383 Insulina umana 383 L'attivatore tissutale del plasminogeno (t-pa) 386 Una anatossina della pertosse ottenuta mediante la tecnologia del DNA ricombinante 389 Il fattore Vili di coagulazione 390